一种生物材料的杀菌方法及其应用与流程

1.本发明属于食品杀菌技术领域，具体涉及一种生物材料的杀菌方法及其应用。


背景技术：

2.杀菌技术是食品等行业的重要技术之一，是食品加工中决定食品安全、营养、风味、品质的关键工艺，因此与人类健康、食品资源的利用效率和产品的商业价值都密切相关。
3.目前，常见的杀菌技术可以分为热杀菌和非热杀菌两大类。热杀菌在传统食品加工行业应用相对较多，主要包括巴氏杀菌法、高温灭菌法、超高温瞬时灭菌法、欧姆加热等。它们的共同特点是利用热量来杀死食品中的微生物以保证产品的安全，但是，由于较高的温度会导致食品中的热敏性成分流失以及带来食品风味、色泽、质地的不良变化，因而降低产品的营养价值。此外，多数热力杀菌法具有耗能、耗时、自动化程度低、设备及附属设施占地面积大等缺点。非热杀菌技术在食品等行业正得到越来越多的重视，因为非热杀菌技术往往在保证产品微生物安全的同时可以最大程度的保持食品原有的性质和价值。非热杀菌技术手段繁多，主要包括采用一些物理加工手段(超高压、超高压均质、超声波、等离子体和高压脉冲电场等)和/或添加一些天然生物抑菌剂(ε-聚赖氨酸、溶菌酶、乳酸链球菌素等)。单纯外加抑菌剂的方法一方面无法完全杀死食品原料中已有的微生物，另一方面存在超量添加的安全性问题。
4.因此，近年来非热的物理杀菌手段正受到越来越多的关注。cn111543481a公开了一种超高压冷杀菌牛乳的生产方法，按照以下步骤依次进行：对生牛乳进行检测，对检测合格的生牛乳在采集后6小时内进行灌装，得到包装牛乳；对得到的包装牛乳进行超高压处理，得到灭菌牛乳；将得到的灭菌牛乳置入2～6℃下冷藏贮存，并在2～6℃下进行运输和销售；且所述检测的标准为：菌落总数≤5000cfu/ml，体细胞数≤200000个/ml，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均为每25ml不得检出，该发明采用超高压冷杀菌对生牛乳进行杀菌，通过合理的原料控制和工艺设计，在保证食品安全前提下，最大程度地保留牛乳的新鲜风味和营养价值。但是，该发明提供的杀菌方法在杀菌过程中存在着能耗高和前期生产设备投入大的缺点，且目前工业化放大前景尚不明了。
5.cn104432396a公开了一种果蔬汁杀菌方法，包括如下步骤：将果蔬汁进行预热处理，并对其进行超高压均质处理和温热处理即可，其中，所述超高压均质处理的进料温度为50～60℃，压力为100～400mpa，所述温热处理的温度50～60℃，该发明所制得的果蔬汁在保证卫生安全要求的条件下，能较好的保持品质和营养成分，其色泽、ph、可滴定酸、可溶性固形物和抗氧化能力均没有显著变化；经感官评价分析，气味、口感和风味也要显著优于巴氏杀菌果蔬汁。但是，该发明提供的方法需要在超高压下进行，而超高压均质设备投入大，均质孔狭窄、易堵塞，同样存在工业化产量难放大的问题。
6.cn109924253a公开了一种用于牛奶杀菌的超声-热复合连续杀菌装置及杀菌方法，装置包括：若干个超声波发生器；封闭式的反应室，反应室侧壁上带有进料口和出料口，
反应室内沿进料口至出料口方向设置折流板，由折流板分隔若干个依次连通的处理腔；对应设于每个处理腔内的超声波探头，每个超声波探头通过对应的超声波换能器与所述超声波发生器一一对应连接；包覆在所述反应室外的夹套，夹套上的进、出水口连接循环水热交换装置。该发明以相对温和的处理强度达到更好的杀菌效果，进而最大程度保持食品原有品质性质。但是，由于该方法需要多个超声波发生器，设备复杂，也容易造成设备投入高的问题。
7.因为设备及操作实现难度相对较低，利用不同电场实现杀菌的方案，正逐渐成为食品工业中研究的热点之一。cn107372820a公开了一种羊奶杀菌方法，包括以下步骤：将羊奶进行杀菌；向杀菌后的羊奶加入抑菌物质，混合均匀。cn104172429a公开了一种微等离子体液体食品杀菌的方法，具体步骤是将液体食品引入微等离子体装置；打开气源，调节气体流量，待气流稳定后开启直流高压电源，放电反应开始，在阳极和液体食品的液面之间形成微等离子体；利用微等离子体产生的oh、h2o2和h2o等强大的杀菌氧化剂，放电处理3～10min可有效将液体食品中有害微生物杀灭，实现食品杀菌消毒。该发明简单、低成本、高处理效率且便捷地杀灭液体食品中的有害微生物，实现液体食品的安全保障，具有潜在的发展前景。但是，其存在着杀菌的同时，一定程度上会不可避免地带来食品中易氧化物质氧化的问题，对富脂食品具有一定的局限性。且该方法使用的设备在操作安全性也有待商榷。
8.综上所述，目前食品领域的主流的热杀菌手段往往存在能耗高、影响感官品质、风味和营养价值、设备及附属设备复杂等问题；而非热物理杀菌手段则或多或少的存在杀菌效果差、操作条件安全性差、设备复杂等问题。
9.因此，亟待开发一种杀菌效果好、能耗低、安全性高且不会影响生物材料本身感官品质、风味和营养价值的杀菌方法。


技术实现要素：

10.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种生物材料的杀菌方法，所述杀菌方法包括：对生物材料施加低压电场，完成所述生物材料的杀菌处理；通过控制所述低压电场的场强为0.01～100v/cm，施加时间为0.5～300min，使得杀菌效果优异且不会破坏生物材料本身的风味和营养价值，所述杀菌方法还具有能耗低且操作简单的优势，适合工业生产应用。
11.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
12.第一方面，本发明提供一种生物材料的杀菌方法，所述杀菌方法包括：对生物材料施加低压电场，完成所述生物材料的杀菌处理；
13.所述低压电场的场强为0.01～100v/cm，例如0.05v/cm、0.1v/cm、0.5v/cm、1v/cm、5v/cm、10v/cm、20v/cm、30v/cm、40v/cm、50v/cm、60v/cm、70v/cm、80v/cm或90v/cm等，所述施加时间为0.5～300min，例如5min、10min、20min、50min、70min、90min、110min、130min、160min、190min、210min、250min或280min等。
14.目前，现有生物材料的杀菌手段包括热物理杀菌手段和非热物理杀菌手段，热物理杀菌手段往往存在能耗高、影响感官品质、风味和营养价值、设备及附属设备复杂等问题；非热物理杀菌手段则或多或少的存在杀菌效果差、操作条件安全性差、设备复杂等问题。
15.首先，本发明提供的生物材料的杀菌方法是一种基于低压电场的生物材料杀菌方法，通过控制低压电场的场强为0.01～100v/cm，施加低压电场的时间为0.5～300min，可以在温度较低(低于60℃)的情况下实现对生物材料的杀菌，且杀菌效果优异；且由于低压场强处理过程产生的热量较低，所以能耗低且对于生物材料的感官与风味影响也较小，进而使得生物材料的营养价值及生物活性物质(如牛奶中的β-乳球蛋白、α-乳清蛋白和免疫球蛋白)保留度较高；而且本发明提供的杀菌方法使用的设备简单、投入成本少、操作方便且电流和电压低，进而安全性很高，易于实现工业化应用。
16.其次，本发明提供的杀菌方法主要通过控制施加的电场强度为0.01～100v/cm，施加的时间为0.5～300min；所产生的杀菌效果主要是利用上述电场条件下生物材料中荷电物质受到的影响，改变各种微生物细胞中的代谢进程、破坏其细胞结构，甚至会对少数代谢关键物质产生一些氧化性损伤。同时，由于该电场作用条件下，还可以出现轻微的电解水杀菌效应；且由于杀菌过程中产生的温度较低(低于60℃)，进而并不会影响生物材料本身的营养价值和口感。第三方面，本发明提供的杀菌方法中施加低压电场的方式可以有三种选择，可以直接对生物材料施加恒压电场，保持电场强度为0.01～100v/cm中任意一个或多个电场强度值即可；还可以对生物材料施加恒流电场，使得在电场强度处于0.01～100v/cm范围内即可；还可以采用恒压和恒流组合模式，只要电场强度一种保持在0.01～100v/cm即可。
17.优选地，所述生物材料为液体生物材料。
18.优选地，所述液体生物材料包括水、饮料、调味品或液体鸡蛋中的任意一种或至少两种的组合。
19.优选地，所述饮料包括果汁或者奶制品。
20.优选地，所述生物材料为牛奶。
21.作为优选技术方案，本发明提供的杀菌方法不会影响牛奶中的β-乳球蛋白、α-乳清蛋白和免疫球蛋白，进而使得牛奶中的营养保留度较高。
22.优选地，所述水包括纯净水、自来水或加工废水中的任意一种或至少两种的组合。
23.优选地，所述施加低压电场之前还包括对生物材料进行预处理的步骤。
24.优选地，所述预处理包括过滤、搅拌、添加缓冲液、添加盐溶液、脱脂或添加抑菌剂中的任意一种或至少两种的组合。
25.优选地，所述添加盐溶液中的盐溶液为中性盐溶液。
26.优选地，所述中性盐溶液包括nacl溶液、kcl溶液、cacl2溶液或k2so4溶液中的任意一种或至少两种的组合。
27.作为本发明的优选技术方案，进行预处理的时候在生物材料中加入一些缓冲液或盐溶液，可以增加生物材料的电导率，进而实现相同的杀菌效果的同时进一步降低能耗。
28.优选地，所述盐溶液的浓度为0.01～1.5％，例如0.05％、0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1.1％或1.3％等，进一步优选为0.1～0.5％。
29.优选地，所述添加缓冲液中的缓冲液包括磷酸缓冲液、柠檬酸/柠檬酸钠复合缓冲液、酒石酸/酒石酸钠复合缓冲液、甘氨酸/hcl缓冲液或草酸/草酸钠溶液缓冲液中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。
30.优选地，所述缓冲液的摩尔浓度为0.01～2m，例如0.05m、0.1m、0.3m、0.5m、0.7m、
0.9m、1.1m、1.3m、1.5m、1.7m或1.9m等，进一步优选为0.1～0.5m。
31.优选地，所述缓冲液的ph值为2～9，例如3、4、5、6、7或8等，进一步优选为3～8。
32.优选地，所述添加抑菌剂中的抑菌剂包括天然抑菌剂和/或合成抑菌剂，进一步优选为ε-聚赖氨酸、溶菌酶、乳酸链球菌素、壳聚糖或茶多酚中的任意一种或至少两种的组合。
33.优选地，所述低压电场的场强为1～20v/cm，例如2v/cm、4v/cm、6v/cm、8v/cm、10v/cm、12v/cm、14v/cm、16v/cm或18v/cm等。
34.优选地，所述低压电场包括低压直流电场或低压脉冲电场。
35.优选地，所述低压直流电场的电流为0.01～2.5a，例如0.05a、0.1a、0.5a、0.7a、0.9a、1.3a、1.5a、1.9a、2.1a或2.3a等，进一步优选为0.05～1a。
36.优选地，所述低压脉冲电场的周期为2～600s，例如50s、100s、150s、200s、250s、300s、350s、400s、450s、500s或550s等，进一步优选为5～20s。
37.优选地，所述低压脉冲电场的占空比为1～99％，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％等，进一步优选为30～70％。
38.优选地，所述施加低压电场的具体方法包括：将生物材料置于安装有阴极板和阳极板的处理槽中，对所述处理槽施加低压电场。
39.示例性地，本发明提供的杀菌方法可在如图1所述的装置中进行。
40.优选地，所述处理槽的温度为0～60℃，5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃等，例如优选为35～55℃。
41.优选地，所述施加低压电场在搅拌的条件下进行。
42.优选地，所述搅拌的转速为1～300rpm，例如30rpm、60rpm、90rpm、120rpm、150rpm、180rpm、210rpm、240rpm或270rpm等，进一步优选为5～100rpm。
43.优选地，所述处理槽的外部设置有夹套。
44.优选地，所述处理槽的内部设置有换热管。
45.优选地，所述处理槽的内部设置有液体循环出槽。
46.优选地，所述处理槽的内部还设置有搅拌装置。
47.虚伪优选技术方案，所述杀菌方法包括如下步骤：
48.(1)对生物材料进行预处理，得到预处理后的生物材料；所述预处理包括过滤、搅拌、添加缓冲液、添加盐溶液、脱脂或添加抑菌剂中的任意一种或至少两种的组合；
49.(2)将步骤(1)得到的预处理后的生物材料置于安装有阴极板和阳极板的处理槽中，处理槽的内部还设置有搅拌装置，外部设置有夹套，0～60℃、转速为1～300rpm的搅拌条件下在对处理槽施加0.01～100v/cm的低压直流电场或低压脉冲电场0.5～300min，完成所述生物材料的杀菌处理。
50.第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的杀菌方法在食品杀菌中的应用。
51.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
52.(1)本发明提供生物材料的杀菌方法包括对生物材料施加低压电场，完成所述生物材料的杀菌处理，所述杀菌方法通过控制所述低压电场的场强为0.01～100v/cm，所述施加低压电场的时间为0.5～300min，实现了在较低温度下对生物材料的杀菌处理，且由于所述杀菌处理过程中的温度较低，因此，能耗低且对于生物材料的感官与风味影响也较小，进
而使得生物材料的营养价值保留度较高。
53.(2)本方提供的杀菌方法使用的设备简单、投入成本少、操作方便且电流和电压低，进而安全性很高，易于实现工业化应用。
附图说明
54.图1为实施本发明提供的杀菌方法的设备；
55.图2为实施例3～5、实施例9～11和对比例1～3得到的杀菌后的鲜牛奶的乳清蛋白变性率柱状图。
具体实施方式
56.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
57.实施例1
58.一种鲜牛奶的杀菌方法，所述杀菌方法包括如下步骤：
59.(1)将鲜牛奶放于20℃、转速为120rpm中的摇床中12h，进行增菌培养至菌落总数为7.5log，得到预处理后的鲜牛奶；
60.(2)取200ml步骤(1)预处理后的鲜牛奶置于如图1所示的安装有阴极板和阳极板的处理槽中，处理槽外部利用20℃低温恒温槽进行控温，使处理槽中的最高温度控制在55℃，在恒压、恒流组合模式下，电场强度9v/cm、电流上限设置为0.6a(即当体系电流增长至0.6a时，会自动切换为恒流模式)，对处理槽施加低压直流电场120min，完成所述鲜牛奶的杀菌处理。
61.实施例2
62.一种鲜牛奶的杀菌方法，所述杀菌方法包括如下步骤：
63.(1)将鲜牛奶放于20℃、转速为120rpm中的摇床中12h，进行增菌培养至菌落总数为7.5log，得到预处理后的鲜牛奶；
64.(2)将200ml步骤(1)预处理后的鲜牛奶置于如图1所示的安装有阴极板和阳极板的处理槽中，处理槽外部利用18℃低温恒温槽进行控温，使处理槽中的最高温度控制在55℃，在电流恒定为0.6a的条件下，对处理槽施加强度为0.01～100v/cm的低压直流电场150min，完成所述鲜牛奶的杀菌处理。
65.实施例3
66.一种鲜牛奶的杀菌方法，所述杀菌方法包括：将200ml鲜牛奶(菌落总数为4.8log)置于如图1所示的安装有阴极板和阳极板的处理槽中，处理槽外部利用23℃低温恒温槽进行控温，使处理槽中的最高温度控制在55℃，在电流恒定为0.6a的条件下，对处理槽施加强度为0.01～100v/cm的低压直流电场90min，完成所述鲜牛奶的杀菌处理。
67.实施例4
68.一种鲜牛奶的杀菌方法，所述杀菌方法包括：向200ml鲜牛奶(菌落总数为4.8log)加入0.6g的nacl固体，搅拌混匀，然后置于如图1所示的安装有阴极板和阳极板的处理槽中，在电流为0.6a的条件下对处理槽施加强度为0.01～100v/cm的低压直流电场30min，完成所述鲜牛奶的杀菌处理。
69.实施例5
70.一种鲜牛奶的杀菌方法，所述杀菌方法包括：将200ml鲜牛奶(菌落总数为4.8log)置于如图1所示的安装有阴极板和阳极板的处理槽中，在恒压模式下，对处理槽施加电场强度为20v/cm，周期为8s、占空比为50％的低压脉冲电场30min，完成所述鲜牛奶的杀菌处理。
71.实施例6
72.一种苹果汁的杀菌方法，所述杀菌方法包括如下步骤：
73.(1)将苹果清洗、切块、榨汁、过滤，得到苹果汁(菌落总数为3.5log)；
74.(2)将200ml步骤(1)得到的苹果汁和摩尔浓度为0.5m、ph为4.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液以体积比为2:1的比例进行混合，然后一起置于如图1所示的安装有阴极板和阳极板的处理槽中，对处理槽施加强度4v/cm的低压直流电场45min，完成所述苹果汁的杀菌处理。
75.实施例7
76.一种啤酒的杀菌方法，所述杀菌方法包括如下步骤：
77.(1)将啤酒开盖，空气中敞口放置48h，得到预处理后的啤酒(菌落总数为5.5log)；
78.(2)将200ml步骤(1)得到预处理后的啤酒置于如图1所示的安装有阴极板和阳极板的处理槽中，对处理槽施加强度3v/cm的低压直流电场45min，完成所述啤酒的杀菌处理。
79.实施例8
80.一种水的杀菌方法，所述杀菌方法包括如下步骤：
81.(1)取无菌水接种代表性菌种大肠杆菌o157:h7，接种后水中菌落的浓度达109cfu/ml，得到预处理后的水；
82.(2)将200ml步骤(1)得到预处理后的水置于如图1所示的安装有阴极板和阳极板的处理槽中，在恒流模式下，对处理槽施加电流为0.3a的低压直流电场20min，该处理过程中场强为0.01～100v/cm，完成所述水的杀菌处理。
83.实施例9
84.一种鲜牛奶的杀菌方法，其与实施例5的区别仅在于，步骤(2)所述电场强度为0.01v/cm，处理时间为300min，其他条件和步骤均与实施例5相同。
85.实施例10
86.一种鲜牛奶的杀菌方法，其与实施例5的区别仅在于，步骤(2)所述电场的强度为100v/cm，施加时间为0.5min，其他条件和步骤均与实施例5相同。
87.实施例11
88.一种鲜牛奶的杀菌方法，其与实施例4的区别仅在于，不添加nacl，直接对鲜奶施加低压直流电场，其他条件和步骤均与实施例4相同。
89.对比例1
90.一种鲜牛奶的杀菌方法，其与实施例3的区别仅在于，步骤(2)所述电场的强度为200v/cm，施加时间为0.5min，其他条件和步骤均与实施例3相同。
91.对比例2
92.一种鲜牛奶的杀菌方法，其与实施例3的区别仅在于，步骤(2)所述电场的强度为0.005v/cm，施加时间为400min，其他条件和步骤均与实施例3相同。
93.对比例3
94.一种鲜牛奶的杀菌方法，采用巴氏杀菌法(63℃杀菌30min)进行杀菌。
95.性能测试：
96.(1)菌落总数：参照gb4789.2-2016提供的测试方法进行测试；
97.(2)糠氨酸含量：参照nyt939-2016提供的测试方法进行测试；
98.(3)色泽：使用色差计测试样品处理前后的明度值、红绿色度值、黄蓝色度值，并通过下式计算得到色差值；
99.δe＝[(δl)2 (δa)2 (δb)2]1/2；
[0100]
其中：δe＝色差值，δl＝明度值，δa＝红绿色度值，δb＝黄蓝色度值；
[0101]
(4)粒径：使用马尔文动态光散射粒度仪nano zs测定处理前后牛奶中蛋白粒径的大小
[0102]
(5)感官评价：选取10名经过培训的专业人员依据gb 25190-2010提供的测试方法对处理后牛奶的状态进行评定；
[0103]
(6)能耗：使用origin软件对电流电压曲线进行积分，按照公式q＝uit进行计算得到能耗；
[0104]
(7)霉菌、酵母菌含量：参照gb4789.15-2016第一法
[0105]
(8)ph值：在25℃下，使用ph计测定处理前后样品的ph值
[0106]
(9)浊度：使用狭缝比色皿(2mm光程)的紫外可见分光光度计测λ＝860nm处的吸光度；
[0107]
(10)沙门氏菌含量：参照gb4789.4-2010提供的测试方法进行测试；
[0108]
(11)金黄色葡萄球菌：参照gb4789.10-2016第三法提供的测试方法进行测试；
[0109]
(12)大肠杆菌o157:h7含量：参照gb4789.2-2016提供的测试方法进行测试；
[0110]
(13)乳清蛋白变性率：将鲜牛奶在4000rpm、4℃条件下离心去脂肪，再用1mol/l的盐酸溶液调节ph至4.6后进行离心去沉淀，所得的上清液即为未变性乳清蛋白；采用bca试剂盒测未处理和处理后上清中的蛋白含量，通过差量法计算乳清蛋白变形率。计算公式为：乳清蛋白变性率(％)＝(未处理蛋白含量-处理蛋白含量)/未处理蛋白含量。
[0111]
按照上述测试方法(1)～(6)对实施例1～5、实施例9～11和对比例1～3得到的杀菌后的鲜牛奶进行测试，测试结果如表1所示：
[0112]
表1
[0113][0114][0115]
根据表1可以看出，采用本发明提供的杀菌方法可以有效降低鲜牛奶中的菌落总数，且不会影响鲜牛奶的色泽和感观，同时能耗较低；
[0116]
具体而言，实施例1～5和9～11提供的杀菌方法得到的鲜牛奶中的菌落数最高为4.2log，均未检测出糠氨酸，色泽为1.2～2.6，粒径为352～365nm，乳白色且无异味；且实施例1～5和9～11提供的杀菌方法的能耗为5
×
10-5
～0.9度。
[0117]
比较实施例1和对比例1～3可以发现，电场的强度较高的杀菌方法(对比例1)会影响鲜牛奶的色泽和感观；而电场强度较低的杀菌方法(对比例2)的杀菌效果不理想；而对比例3提供的巴氏杀菌法得到的鲜牛奶中的糠氨酸含量较多。
[0118]
按照上述测试方法(13)对实施例3～5、实施例9～11和对比例1～3得到的杀菌后的鲜牛奶进行测试，测试结果如图2所示，从图2可以看出，对比例3提供的巴氏杀菌法得到的鲜牛奶中乳清蛋白变性率很高，会影响鲜牛奶的营养价值。
[0119]
按照上述测试方法(1)、(3)、(5)、(6)～(8)对实施例6得到的杀菌后的苹果汁进行测试，测试结果如表2所示：
[0120]
表2
[0121][0122]
根据表2可以看出，本发明提供的杀菌方法对苹果汁进行杀菌处理同样有效，且不会影响苹果汁的感观。
[0123]
按照上述测试方法(1)、(5)、(6)、(9)、(10)和(11)对实施例6得到的杀菌后的啤酒进行测试，测试结果如表3所示：
[0124]
表3
[0125][0126]
根据表3可以看出，本发明提供的杀菌方法对啤酒进行杀菌处理同样有效，且不会影响啤酒的感观。
[0127]
按照上述测试方法(1)、(5)、(6)、(8)和(11)对实施例8得到的杀菌后的水进行测试，测试结果如表4所示：
[0128]
表4
[0129] 菌落总数(log)大肠杆菌ph感观能耗(度)实施例8《1未检出7无杂物0.003
[0130]
根据表4可以看出：本发明提供的杀菌方法对水进行杀菌处理同样有效，且不会带来杂质。
[0131]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明一种生物材料的杀菌方法及其应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。