一种与番茄SlWUSCArG元件互作的转录因子及其鉴定方法和应用与流程

一种与番茄slwus carg元件互作的转录因子及其鉴定方法和应用
技术领域
1.本发明涉及农业分子技术领域，具体涉及一种与番茄slwus carg元件互作的转录因子及其鉴定方法和应用。


背景技术：

2.番茄是我国设施生产面积最大的蔬菜作物，在蔬菜周年供应中起着重要的作用。然而我国北方冬春设施蔬菜生产过程中易形成大量多心室畸形果，严重影响番茄果实的品质和价值，成为影响设施番茄效益的重要因素之一。番茄多心室畸形果与子房心室数密切相关：即心室数越多，果实越大，畸形果发生率越高。而位于slwus基因3
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utr下游1080bp处的lc位点(順式调控区)是调控番茄心室形成的一个重要qtl。番茄lc位点为1600bp的非编码区，不编码任何蛋白质，该位点的作用特点是不通过调控其它基因一般较难行使调控作用。基因的顺式调控序列(即基因上下游的调控序列)决定了基因特异表达方式，是决定基因型和表型间关系的重要因素之一。尽管近些年研究人员通过多种基因组学的技术预测和鉴定了多种模式植物和作物中潜在的顺式调控元件，但关于它们的功能研究仍然十分匮乏。至于这些顺式调控序列如何影响基因表达进而影响植物表型更是亟待解决的难题。因此，通过分子生物学手段，鉴定番茄slwus carg元件互作转录因子，具有很重要的研究和应用价值。


技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明提供了一种与番茄slwus carg元件互作的转录因子及其鉴定方法和应用，所述转录因子为slap1，所述转录因子slap1通过与slwus carg元件互作调控了番茄果实的心室数，使得心室数增加至2-4个，为番茄果实品质的把握提供了技术支撑。
4.本发明提供了一种与番茄slwus carg元件互作的转录因子，所述转录因子为slap1，所述转录因子的slap1的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码该转录因子的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5.本发明还提供了上述与番茄slwus carg元件互作的转录因子的鉴定方法，包括如下步骤：
6.s1，提取野生型番茄(ailsa craig)茎尖的总rna，反转录合成cdna，然后酶切，去除短片段，克隆到pgadt7三框质粒载体上，形成初级cdna文库，将初级文库转化到酵母y187感受态中，得到酵母cdna文库；
7.s2，选取lc位点的seq id no.3所示的核心序列连接到pabai的多克隆位点上构建成诱饵质粒pabai-lc，转化酵母y1h感受态细胞中，经过sd/-leu/aba平板筛选和酵母阳性克隆插入片段的测序，筛选得到与lc位点互作的转录因子slap1。
8.本发明还提供了上述转录因子在调控番茄果实大小中的应用。
9.进一步地，所述转录因子用于调控番茄果实心室数。
10.进一步地，所述转录因子通过与所述番茄slwus carg元件互作调控番茄果实心室数。
11.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
12.1、本发明提供了一种转录因子slap1，该转录因子通过与番茄slwus carg元件互作从而调控番茄果实心室数，进一步提高番茄的果实品质和产量。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
14.图1为本发明初步筛选到slwus carg元件互作的转录因子slap1；
15.其中，pabai-53表示对照p53菌株，pabai-lc表示酵母诱饵菌株，sd/-leu表示酵母菌sd-leu培养基，sd/-leu/ aba表示酵母菌sd-leu aba培养基；
16.图2为本发明利用酵母单杂交验证slwus carg元件与转录因子slap1体内互作结果；
17.其中，sd/-leu表示酵母菌sd-leu培养基，sd/-leu/ aba表示酵母菌sd/-leu/ aba培养基，ad-empty pabai-lc表示含slwus carg元件诱饵菌株(氨苄抗性)，ad-empty pabai-mlc表示含突变的slwus carg元件诱饵菌株(氨苄抗性)，ad-ap1 pabai-lc表示同时含有ap1和slwus carg元件诱饵菌株(氨苄抗性)，ad-ap1 pabai-mlc表示同时含有ap1和突变的slwus carg元件诱饵菌株(氨苄抗性)；
18.图3为本发明利用emsa验证slwus carg元件与转录因子slap1体外互作结果；
19.其中，pgadt7-ap1表示带有目的基因的载体，pgadt7表示不含目的基因的空载体，hot probe表示热探针，cold probe表示冷探针，mutant probe表示突变探针，free probe表示游离探针。
具体实施方式
20.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
21.实施例1
22.一、与番茄slwus carg元件互作的转录因子的鉴定方法
23.1、选取野生型番茄“ac”(ailsa craig)花芽分化不同时期对茎尖进行取样，用天根的rnaprep pure植物总rna提取试剂盒提取总rna，smart法反转录合成cdna，并对cdna进行均一化处理，对均一化后cdna酶切，去除短片段，克隆到pgadt7三框质粒载体上，形成初级cdna文库，将初级文库转化到酵母y187感受态中，得到酵母cdna文库。
24.2、选取lc位点的核心序列(基因序列如seq id no.3所示)连接到pabai的多克隆
位点上构建成诱饵质粒pabai-lc，转化酵母y1h感受态细胞中，经过sd/-leu/aba平板筛选和酵母阳性克隆插入片段的测序，筛选得到与lc位点互作的转录因子基因序列solyc02g089210(如seq id no.2所示)。solyc02g089210编码slap1，其氨基酸序列如seq id no.1所示，属于mads-box家族转录因子。mads-box基因是真核生物中一类重要的转录调控因子，在生长发育调控和信号传导中发挥着重要作用。
25.seq id no.3：gtttactaattggac。
26.二、酵母单杂交实验验证slwus carg与slap1体内互作
27.1、构建bait质粒：使用clontech酵母单杂交试剂盒。将目的基因启动子序列克隆，并将目的片段与pabai质粒进行双酶切(xho i和sma i)，回收纯化酶切产物。将连接好的质粒转入大肠杆菌topo10中，经培养后，挑单克隆测序。将测序正确的质粒2μg使用bstb i或者bbs i酶切线性化，回收纯化，转入y1hgold酵母菌株中。
28.2、转化：挑取单克隆，用pcr方法确定pbait-abai整合到y1hgold基因组中，pcr阳性菌株在sd/-ura平板划线，30℃培养72h，4℃保存。
29.3、筛选出pbait-abai开始不生长的浓度：通过aba表达测试pbait-abai菌株，配制sd/-ura/aba琼脂糖培养基，其中添加不同浓度的aba(0ng/ml，100ng/ml，150ng/ml，200ng/ml)。
30.4、制作pbait-abai酵母菌株：按照说明书构建pgadt7-ap1克隆载体，测序检测正确后的载体备用。将pgadt7-ap1构建好带有目的基因的载体，采用上述转化方法转入新制作的酵母菌株中。在pbait-abai不生长的abai筛选浓度下，划线培养72h。
31.三、emsa实验验证slwus carg与slap1体外互作。
32.1、样品制备：采用sigma公司的植物核蛋白试剂盒进行样品的提取。将4
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nib缓冲液用去离子水稀释成1倍，混匀。加入dtt以使终浓度达到1mm(保证dtt现用现配)。新鲜的样品放于研钵中，加入适量液氮进行充分研磨。将磨好的样品放入新的离心管中，向其中加入15ml 1
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nib缓冲液，混匀。利用试剂盒中的滤纸将悬浮液进行过滤，滤液收集至50ml离心管中。1,260rpm离心10min后收集上清，加入2ml 1
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nib缓冲液(以体积比为1:100的比例加入蛋白酶抑制剂)。再加入10％triton x-100溶液以使终浓度变为1％。然后向提取液中加入dtt以使终浓度为5mm，并向其中加入体积比为1:100的比例加入蛋白抑制剂(dtt和蛋白酶抑制剂要现用现配)，以制备成提取工作液。加入提取工作液(沉淀体积的2/3)。涡旋机4℃条件下，中速涡旋15-30min。离心机4℃条件下，13,400rpm离心10min。将上清液收集到一个新的离心管中，然后液氮中速冻，-80℃保存。对样品蛋白进行定量，试验中等量加入蛋白。
33.2、探针标记及检测：设计探针进行合成及标记，交由上海英俊生物公司进行生物素标记合成。探针序列如seq id no.4所示：
34.seq id no.4：ttggcatgatgtttactaattggacaattc。
35.3、形成蛋白-探针复合物：按如下顺序加入各个反应物，温和混匀(20μl体系)
[0036][0037]
将混合反应物冰浴5min后，加入1μl探针。(对照组加1μl对照探针)。金属浴中室温(20-23℃)温育30min。
[0038]
4、制备凝胶：制备6.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶：
[0039][0040][0041]
首先，将电泳板按照要求组装好，并再次确认玻璃板底部是否封好，以防止聚丙烯酰胺液的渗漏。然后将上述成分依次加入到50ml烧杯中，使用玻璃棒不断搅拌混匀。将混合液立即用玻璃棒引流灌至两块玻璃板之间，灌胶过程中要避免气泡产生，一次性将混合液全部倒完。灌胶完成后，插入样梳，形成点样孔。30-60min后凝胶聚合完全，并向电泳槽中加入0.5
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tbe缓冲液，以没过点样孔为宜。然后将样梳轻轻拔出，保证点样孔完整未破坏。
[0042]
5、电泳：加样前先进行预电泳30min，目的是赶走点样孔中的气泡以及未凝固的胶液。然后用蒸馏水将胶板冲洗干净。使用移液器将与上样缓冲液混合均匀的的样品加入到点样口中，maker作标准。恒压120v，电泳60min左右或是溴酚蓝指示带距离凝胶边缘2cm时，停止电泳，关闭电源。
[0043]
6、转膜：取出玻璃板，用蒸馏水清洗2次。用启胶板将薄面的玻璃板取开，切掉浓缩胶，放入预冷的0.5
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tbe中浸泡，将预先浸泡好的滤纸贴在整块胶上(滤纸比胶面要大些)，并将另一半玻璃板取出，然后将滤纸平放在摆好的纤维垫上，然后依次加入膜，滤纸、纤维垫。注意膜在正极一侧。转膜缓冲液为预冷的0.5
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tbe，恒压80v转膜1h。
[0044]
7、检测：转膜完成后将膜取出，放入缓冲液中冲洗后，加入封闭液封闭20min。期间置于摇床中轻微晃动。倒掉封闭液，加入适量的streptavidin-hrp conjugate，室温孵育45min。期间放于摇床上轻轻摇晃(勿将酶标记物直接加到膜上)。倒掉酶联物稀释液，用1倍的洗脱液清洗膜3次，每次五分钟。期间摇床中速震荡。用配好的反应底物孵育5min。最后利用化学发光成像系统曝光成像检测。
[0045]
四、结果分析
[0046]
如图1所示，通过构建茎尖酵母杂交cdna文库，把对照p53菌株和诱饵菌株制备成
感受态，将文库转入酵母细胞中。在sd/-leu和sd/-leu/aba200上分别进行转化产物的涂板，30℃培养3到5天，计算克隆数。进一步将获得的酵母单克隆于高浓度的aba缺素培养基上筛选，初步筛选到了slwus carg元件互作的转录因子slap1。
[0047]
如图2所示，利用酵母单杂交试验验证slwus carg元件与转录因子slap1体内互作。可以看到slwus carg元件与slap1能在体内互作，而slwus carg元件突变后，slap1不能与其结合。
[0048]
如图3所示，利用emsa试验验证slwus carg元件与转录因子slap1体外互作。可以看到slwus carg元件与slap1能在体外互作。而slwus carg元件突变后引起调控元件功能缺失，影响了slap1与其的结合。
[0049]
本发明鉴定到了番茄slwus carg元件互作的转录因子slap1，为研究番茄果实心室数调控奠定了基础。
[0050]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0051]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。