调控植物叶片暗呼吸的蛋白及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及调控植物叶片暗呼吸的蛋白及其应用。


背景技术：

2.随着世界人口的快速增长，耕地面积逐渐减少，粮食等作物的安全问题日益严重。例如，水稻是中国重要的粮食作物，提高水稻产量被认为是缓解粮食危机最为重要的因素之一。提高水稻产量的因素除了提高光合效率以外，还要考虑降低呼吸消耗。植物的呼吸作用主要是通过氧气的消耗和co2的释放来实现，这对于维持全球碳平衡也起着关键作用。在生态系统层面，植物呼吸释放的co2可以占大气总co2的65％，余下的co2来源于矿质土壤呼吸(raich and schlesinger，1992)。据估计，全球陆地植被呼吸每年可释放64g吨碳元素，这要比来源于化石燃料和水泥生产所带来的co2环境释放要多10倍以上(schimel，1995)。
3.据报道，每天由于光合进程所释放到大气的co2的2/3来源于植物叶片的暗呼吸(poorter et al.，1990；van der werf et al.，1994；atkin et al.，1996；loveys et al.，2002)。然而，植物叶片的呼吸过程是一个非常复杂的过程，可概况为光照下的呼吸(包括光呼吸和光照增强下的暗呼吸)和黑暗条件下的暗呼吸。其中，光照和温度是影响暗呼吸的主要因素。在白天，由于光合作用，大量的atp和还原力在叶绿体中形成，用于碳和氮的同化进程，并以淀粉等多糖类物质储存在细胞质中。另外，这些同化产物被随后被运输到植物的库器官，例如籽粒中以及通过糖酵解、三羧酸循环以及电子传递链、氧化磷酸化和rubisco的氧化途径(光呼吸)进而形成碳骨架。相比之下，在黑暗条件下，细胞多糖被分解，用于生长呼吸、维持呼吸以及运输和营养同化，这会消耗细胞内部的atp。目前，本领域研究人员在高光效育种，提高光合效率的同时，往往忽略暗呼吸的改良。主要由于缺乏对暗呼吸效率的分子机理的了解，以及缺乏高通量有效的测量手段用于功能基因挖掘。二个阶段。大多数研究者对于提高光合效率只针对某一特定环节，因此对于整体光合效率的改善不大。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供调控植物叶片暗呼吸的蛋白及其应用。
5.在本发明的第一方面，提供一种lrk1或其上调分子的用途，用于：(a)改良植物的性状，(b)制备改良植物性状的制剂或组合物，或(c)制备性状改良的植物；其中，所述改良性状包括：(i)提高植物叶片的暗呼吸速率，(ii)促进植物生长，(iii)增加植物产量、株高或分蘖，或(iv)提高植物高温耐性；其中，所述lrk1包括其同源物。
6.在一个优选例中，所述组合物包括农用组合物。
7.在另一优选例中，所述高温为温度高于25℃，较佳地高于28℃，更佳地高于30℃(如高于32℃，34℃，35℃，36℃，38℃，40℃)。
8.在另一优选例中，述的上调分子包括：与lrk1相互作用、从而提高其表达或活性的上调分子；过表达lrk1的表达盒或表达构建物(如表达载体)；或定点突变的试剂，其靶向于
lrk1基因上游(启动子区)的-242位碱基(相应于seq id no:3所示核苷酸序列(启动子)的第1760位，将其突变为a。
9.在本发明的另一方面，提供一种改良植物性状或制备性状改良的植物的方法，包括：在植物中提高lrk1的表达或活性；其中，改良的性状包括：(i)提高植物叶片的暗呼吸速率，(ii)促进植物生长，(iii)增加植物产量、株高或分蘖，或(iv)提高植物高温耐性；其中，所述lrk1包括其同源物。
10.在一个优选例中，所述的提高lrk1的表达或活性包括：在植物中过表达lrk1；或以突变试剂靶向于lrk1启动子的-242位，将之突变为碱基a。
11.在本发明的另一方面，提供一种植物细胞，其表达外源的lrk1或其同源物的表达盒；较佳地，该表达盒包括：启动子，lrk1或其同源物的编码基因，终止子；较佳地，该表达盒被包含在构建物或表达载体中。
12.在一个优选例中，所述的植物选自下组或所述lrk1或其同源物来自下组：禾本科植物，如水稻(oryza sativa)，小米(setaria italica)，狗尾草(setaria viridis)，panicum hallii var.hallii，黍(panicum miliaceum)，dichanthelium oligosanthes，玉米(zea mays)，高粱(sorghum bicolor)，画眉草(eragrostis curvula)，大麦(hordeum vulgare)，二穗短柄草(brachypodium distachyon)，小麦(triticum aestivum)；十字花科植物，如拟南芥(arabidopsis thaliana)；凤梨科植物，如菠萝(ananas comosus)；兰科植物，如石斛(dendrobium catenatum)；
13.棕榈科植物，如枣椰(phoenix dactylifera)，油棕(elaeis guineensis)；睡莲科植物，如荷花(nelumbo nucifera)；罂粟科植物，如博落回(macleaya cordata)；桃金娘科植物，如syzygium oleosum；茜草科植物，如coffea canephora；茄科植物，如马铃薯(solanum tuberosum)，烟草(nicotiana tabacum)，美花烟草(nicotiana sylvestris)，gapsinam chilense；梧桐科植物，如可可树(theobroma cacao)；豆科植物，如花生(arachis hypogaea)；或大叶藻科植物，如大叶藻(zostera marina)。
14.在另一优选例中，所述的lrk1包括cdna序列、基因组序列、或其组合。
15.在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻。
16.在另一优选例中，所述的lrk1的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)具有seq id no:2所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与seq id no:2所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v)在seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加标签序列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的多肽。
17.在另一优选例中，编码lrk1的核苷酸序列选自下组：(a)编码如seq id no:2所示多肽的多核苷酸；(b)序列如seq id no:1(loc_os03g51440.1)或seq id no:4所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与seq id no:1或seq id no:4所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％或≥99％)的多核苷酸；(d)在seq id no:1或seq id no:4所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
18.在另一优选例中，lrk1基因或其启动子的核苷酸序列中，-242位为a。
19.在另一优选例中，lrk1基因的启动子包括如seq id no:3所示的核苷酸序列，或其同功能活性片段。
20.在本发明的另一方面，提供一种lrk1基因的用途，用作鉴定植物的性状的分子标记物；所述性状包括：(i)植物叶片的暗呼吸速率，(ii)植物生长发育速度，(iii)植物产量、株高或分蘖，或(iv)植物高温耐性；其中，所述lrk1基因包括其同源物。
21.在一个优选例中，通过分析植物中lrk1基因的表达量来确定鉴定植物的性状；若待测植物中lrk1基因的表达量等于或高于该类植物的lrk1基因的平均表达量，则其：(i)植物叶片的暗呼吸速率正常或高，(ii)植物生长发育正常或发育快，(iii)植物产量、株高或分蘖正常或高，或(iv)植物高温耐性正常或高；若待测植物中lrk1基因的表达量等于或低于该类植物的lrk1基因的平均表达量，则其性状不理想。
22.在本发明的另一方面，提供一种定向选择性状改良的植物的方法，所述方法包括：分析植物中lrk1基因的表达量；若待测植物中lrk1基因的表达量高于该类植物的lrk1基因的平均表达量，则其：(i)植物叶片的暗呼吸速率高，(ii)植物生长发育快，(iii)植物产量、株高或分蘖高，或(iv)植物高温耐性好，其为性状改良的植物；其中，所述lrk1基因包括其同源物。
23.在一个优选例中，通过鉴定lrk1基因上游-242位的碱基的类型来鉴定lrk1基因的表达量，若-242位的碱基为a则说明lrk1基因的表达量正常或高，若-242位的碱基为t则说明lrk1基因的表达量低于正常值。
24.在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物中lrk1基因表达量高低的方法，包括：鉴定lrk1基因上游-242位的碱基的类型，若-242位的碱基为a则说明lrk1基因的表达量正常或高，若-242位的碱基为t则说明lrk1基因的表达量低于正常值。
25.在本发明的另一方面，提供一种鉴定禾本科植物水稻的籼稻或粳稻品种的方法，所述方法包括：鉴定测试植物lrk1基因中第-242位、709位、1479位、1806位、2621位的碱基，若-242位为a、709位为a、1479位为a、1806位为g、2621位为g，则该植物为籼稻的概率高(高于90％，较佳地高于92％或94％)。
26.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
27.图1a～d、利用水稻自然小核心群体(minicore)，调查在人工气候室和上海大田环境(field)的夜间暗呼吸速率(rd)，并利用2.3m过滤后的全基因组覆盖的snps进行关联分析，获得rd的曼哈顿图。
28.图2a～b、室内和大田条件下snp峰值分析。
29.图2c、根据snp峰值分析结果，确定候选基因。
30.图2d、通过qpcr分析12个候选基因在极端表型个体材料中的表达差异，以确定目标基因。
31.图3a、根据lrk1基因及其上游基因的序列分析，确定显著关联snp位点，这些显著关联snp可分为2种单倍型。
32.图3b、在minicore群体中，单倍型1(hapi)水稻材料，单倍型2(hapii)水稻材料的数量统计。
33.图3c、按照单倍型1(hapi)、单倍型2(hapii)，对各种品种的水稻进行归类。adm：admix-ture(籼粳混合型)；aro：aromatic(粳稻)；aus：aus(籼稻)；ind：indica(籼稻)；tej：temperate japonica(粳稻)；trj：tropical japonica(粳稻)。
34.图4、lrk1基因编码的蛋白序列在不同物种中存在情况及保守情况。
35.图5a、利用crispr技术靶向敲除lrk1基因水稻材料测序图。
36.图5b、lrk1基因结构及grna识别位点示意图。
37.图5c、25℃室温人工气候室中，基因敲除材料lrk1和野生型材料相比的表型。
38.图5d、25℃室温人工气候室中，基因敲除材料lrk1和野生型材料相比，夜间暗呼吸速率rd显著降低。
39.图6a、水稻单倍型1、单倍型2的生长环境的年平均温度比较。
40.图6b、通过短期不同温度调控，来检测水稻中lrk1基因的表达。
41.图6c、在35℃人工气候室中，突变体材料lrk1和野生型材料相比的表型。
42.图6d、在35℃人工气候室中，突变体材料lrk1和野生型材料相比的夜间暗呼吸rd。
具体实施方式
43.本发明人经过深入的研究和筛选工作，首次筛选到一种leucine rich repeat receptor kinase(lrk1)基因，该lrk1基因编码一个类受体激酶(称为lrk1蛋白)。通过全基因组关联分析，本发明人发现lrk1基因是控制夜间暗呼吸效率的关键基因。当提高lrk1基因的表达时，可显著改善植物的性状，包括：(i)提高植物叶片的暗呼吸速率，(ii)促进植物生长，(iii)增加植物产量、株高或分蘖，或(iv)提高植物高温耐性等。因此，该lrk1基因可以作为调控植物性状的靶标，应用于植物育种中。
44.前期研究中，本发明人利用高精度的licor-6400xt气体交换测定系统，大规模对minicore水稻群体进行测定，该群体具有样本量适中、遗传多态性高以及地理起源广等特点。通过测定minicore群体的夜间暗呼吸效率，利用全基因组关联分析，本发明人发现了所述lrk1基因。并证明了lrk1基因启动子上游242bp有一个snp位点与lrk1基因表达量高度相关。lrk1基因的crispr敲除水稻材料表明暗呼吸速率显著降低，尤其在高温胁迫后，植物生长缓慢，产量降低，暗呼吸仅仅为野生型的30％，暗示着该基因可作为影响暗呼吸效率和经济产量的重要改良靶点。本发明所解决的问题是通过将水稻lrk1基因过量表达，可调控叶片暗呼吸速率，进而增加高温耐性和经济产量，以期为高光效水稻育种提供改良方案。
45.如本文所用，“lrk1蛋白(多肽)”可以是具有seq id no:2所示氨基酸序列的蛋白(多肽)，编码其的基因可以具有seq id no:1所示的核苷酸序列，还包括其同源物。
46.本发明还包括lrk1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的lrk1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个(如1-50个，1-40个，1-30个，1-20个，1-10个，1-5个，1-3个，1-2个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个(如1-50个，1-40个，1-30个，1-20个，1-10个，1-5个，1-3个，1-2个)氨基酸残基
中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
47.任何一种lrk1的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，lrk1的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的lrk1的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长lrk1的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长lrk1的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
48.在本发明中，lrk1还包括具有与lrk1相同功能的、seq id no:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端(特别是n末端)添加或缺失一个或数个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端(特别是n末端)添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
49.多种与所述的lrk1同源性高(比如与seq id no:1所示的序列的同源性为60％或更高、70％或更高、80％或更高；优选的，同源性为85％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有lrk1相同功能的蛋白也包括在本发明内。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸或多肽之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
50.根据本发明人针对lrk1基因的不同物种的进化树分析结果显示，lrk1基因编码的蛋白序列在不同物种中广泛存在，并高度保守(图4)。因此，应理解，虽然本发明的lrk1优选获自水稻，但是获自其它植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)的与水稻中lrk1高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、98％、甚至99％序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内，只要本领域技术人员在阅读了本技术后根据本技术提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该多肽或基因。这些多肽或基因也称为lrk1的“同源物”。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如blast。
51.本发明还涉及编码本发明lrk1或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seq id no:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有seq id no:2的蛋白质，但与seq id no:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。由于密码子的简并性，即使与seq id no:1的碱基序列相同性较低，也能基本编码出如seq id no:2所示的氨基酸序列。
52.编码seq id no:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
53.术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
54.本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或lrk1编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
55.用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、幼胚转化法等。
56.如本文所用，所述的“植物”是存在lrk1或其同源物的植物。较佳地，所述的“植物”包括(但不仅限于)：禾本科植物，如水稻(oryza sativa)，小米(setaria italica)，狗尾草(setaria viridis)，panicum hallii var.hallii，黍(panicum miliaceum)，dichanthelium oligosanthes，玉米(zea mays)，高粱(sorghum bicolor)，画眉草(eragrostis curvula)，大麦(hordeum vulgare)，二穗短柄草(brachypodium distachyon)，小麦(triticum aestivum)；十字花科植物，如拟南芥(arabidopsis thaliana)；凤梨科植物，如菠萝(ananas comosus)；兰科植物，如石斛(dendrobium catenatum)；棕榈科植物，如枣椰(phoenix dactylifera)，油棕(elaeis guineensis)；睡莲科植物，如荷花(nelumbo nucifera)；罂粟科植物，如博落回(macleaya cordata)；桃金娘科植物，如syzygium oleosum；茜草科植物，如coffea canephora；茄科植物，如马铃薯(solanum tuberosum)，烟草(nicotiana tabacum)，美花烟草(nicotiana sylvestris)，gapsinam chilense；梧桐科植物，如可可树(theobroma cacao)；豆科植物，如花生(arachis hypogaea)；或大叶藻科植物，如大叶藻(zostera marina)。
57.本发明提供了一种改良植物的方法，该方法包括提高植物中lrk1的表达。所述的改良植物包括：(i)提高植物叶片的暗呼吸速率，(ii)促进植物生长，(iii)增加植物产量、株高或分蘖，和/或(iv)提高植物高温耐性。在得知了所述的lrk1的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来提高所述的lrk1的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带lrk1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的lrk1蛋白。
58.作为本发明的优选方式，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：(1)将外源的lrk1的编码多核苷酸转入植物组织、器官或组织，获得转化入lrk1的编码多核苷酸的植物组织、器官或种子；和(2)将步骤(1)获得的转入了外源lrk1的编码多核苷酸的植物组织、器官或种子再生成植物植株。
59.其它一些增加lrk1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强lrk1基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、actin基因第一内含子等)来增强该lrk1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的ubi启动子等。
60.可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
61.本发明人发现，lrk1基因启动子区上游242bp处包含一个显著关联snp，另在该基因的第一个外显子上包含2个显著关联snp，分别位于709bp和1479bp处，在第一个和第三个内含子上分别包含1个snp，分别位于下游1806和2621bp处。这些显著关联snp可分为2种单倍型，包括单倍型1(-242位t、709位g、1479位g、1806位a、2621位a)，单倍型2(-242位a、709位a、1479位a、1806位g、2621位g)。同时，单倍型2中大部分(约94.2％或更高)的水稻材料属于籼稻类型。
62.基于本发明人的上述研究发现，在优选的实施方式中，当所述植物为水稻时，可以
通过鉴定特定位置即相应于lrk1序列中第-242位、709位、1479位、1806位、2621位的碱基序列，来确定所述水稻属于籼稻还是粳稻的概率；若-242位a、709位a、1479位a、1806位g、2621位g，则该植物为籼稻的概率高(如概率高于90％，91％，92％，93％或94％)。
63.本领域技术人员可以采用任何本领域公知的或正在发展的多种技术来进行核酸序列的分析，这些技术均可被包含在本发明中。所述的方法例如包括但不限于：测序法，pcr扩增法，探针法，杂交法，限制性酶切分析法，等位基因多态性分析法(如溶解曲线法)进行核酸序列的鉴定，等等。如果需要，本领域技术人员能够设计出鉴定所述分子标记的引物。
64.在大量的研究分析后，本发明人进一步还发现，lrk1基因及其上游启动子区-242位的snp位点，其与lrk1基因表达量高度相关，其碱基为a时相比于其它类型的碱基，lrk1的基因表达大幅度提高。根据这一发现，一方面，可以通过靶向测定该snp位点的碱基情况，来判断相应植物的lrk1基因表达情况，进而判断植物的性状；所述性状包括：(i)植物叶片的暗呼吸速率，(ii)植物生长发育速度，(iii)植物产量、株高或分蘖，或(iv)植物高温耐性。另一方面，当发现-242位的snp位点并非为a时，可以通过定点突变的方式，来改变该snp位点的碱基类型，以提高植物的lrk1基因表达，或者，通过重组表达的形式，利用-242位的snp位点为a的启动子来驱动lrk1基因的表达，从而改良植物的性状，包括提高叶片暗呼吸速率和改善抗高温性等。
65.此外，本发明还涉及利用lrk1或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用lrk1或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中lrk1的表达情况，鉴定植物的性状。在对待测植物进行评估时，可通过测定lrk1的表达量或mrna量，了解待测植物中的表达或mrna量是否高于此类植物的平均值，若是显著高，则其具有改良的性状(包括叶片暗呼吸速率提高和抗高温性改善等)。
66.在得知了本发明的分子机制以及参与该分子机制的基因或蛋白以后，可基于该新发现来筛选能够用于改良植物性状的物质。以蛋白或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如gst沉降技术(gst-pull down)、双分子荧光互补实验、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。
67.本发明的主要优点包括：
68.(1)本发明首次筛选到一种lrk1基因，该基因编码一个类受体激酶，可调节夜间暗呼吸速率进而影响抗高温性。可通过提高夜间暗呼吸效率，增加维持呼吸比例，增加对逆境如高温条件下的抗性，对于培育应对全球气候变化高温增加背景下的水稻品种具有重要作用。同时，所述调控不影响植物在正常条件下的生长发育。
69.(2)本发明首次发现，将lrk1基因启动子区域的启动子区域如seq id no.:3的第223-1914位(优选第242位)的t突变为a，可显著提高水稻的rd。
70.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或
按照制造厂商所建议的条件。
71.通用方法
72.1.植物叶片夜间暗呼吸的测定
73.全基因组关联分析中，以minicore水稻小核心自然群体为材料，该群体包含198个水稻品系或品种(购自美国农业部种质资源库，usda-genetic stocks oryza)，来源于全球97个国家。试验在中国科学院计算生物学研究所人工气候室展开，2018年5月中旬播种，该群体生长在盆栽条件下，每盆3株，每个品系2盆，每周浇水2次。播种后60天开始进行光合和暗呼吸测定。夜间暗呼吸测定时间为凌晨2～5点。人工气候室的室温控制在27℃，光照强度维持在600ppfd左右，湿度维持在65％。测定时，采用4台便携式光合仪(licor-6400xt)同时进行。叶室温度为25℃，光照强度为首先为0ppfd，co2为400ppm。为降低外界环境误差，测定前，将叶室气体流速降低到300μmol min-1
。通过自动程序连续记录数据点。每次测定需要2分钟，在3天内完成全部测定。每个品系至少为4次生物学重复。
74.另外作为验证试验，minicore群体同时种植在田间条件下(上海植物生理生态研究所松江基地)。每个品系种49株(7
×
7株)，行株距控制在20cm
×
20cm。正常的田间管理和除草规范。60天，将每个小区中间植株移入盆中，并放置在室内培养箱过夜后，测定暗呼吸速率。
75.2.全基因组关联分析和候选基因筛选
76.经过质量控制和snp过滤，共获得2.3m snps来用于全基因组关联分析(gwas)。gwas是由gemaa软件(zhou和stephens，2012)来实现，采用混合线性模型算法进行相关性分析。经200次随机抽样，然后界定关联分析的显著性阈值(p值＝6)，随后采用gcta开源软件(jian yang，昆士兰大学，http://cnsgenomics.com/software/gcta/index.html)，计算最高snp峰值(3m29440628)的连锁不平衡距离。曼哈顿和qq图均由开源软件r(r 3.2.1 gui 1.66mavericks build)完成。
77.为深入挖掘候选基因，选取了极端表型rd的高低各6个品系，测定了最高snp附近的12个候选基因(表1)。
[0078][0079]
选取出苗后5周的水稻叶片，样品用液氮保存。rna提取用trizol plus rna纯化试剂盒(英潍捷基生命技术公司)，根据说明书的标准流程进行操作。反转录cdna采用
superscript vilo cdna反转录试剂盒(英潍捷基生命技术公司)。2ug的总rna用于反转录cdna。定量pcr采用sybr green pcr反应体系(美国应用生物系统公司)和abi定量pcr仪器(steponeplus)实现。扩增反应程序为：95℃10s，55℃20s，72℃20s。管家基因为actin。三次生物学重复和三次技术重复。新开发的引物序列如表2。
[0080]
表2、定量pcr(qpcr)的引物序列表
[0081][0082]
3.crispr-cas9载体系统的构建
[0083]
经过密码子优化的hspcas9与玉米的ubiquitin启动子(ubi)共连到pcambia1300双元载体(购自ntcc典型培养物保藏中心-biovector质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心)上。该载体骨架含有潮霉素筛选标记(hpt)。
[0084]
引物筛选序列为：
[0085]
f：tcctcgacatctccggct(seq id no:29)；
[0086]
r：agctgccccgagagtagatt(seq id no:30)。
[0087]
sgrna序列(针对第1外显子，缺失lrk1的基因组序列位置上第508位的“c”)为(识别seq id no:4中第503～525位)：
[0088]5’-
tcaccactctcaacctcgcgggg-3’(seq id no:31)。
[0089]
为构建完整的crispr/cas9双元载体pbgk032，需额外引入osu6启动子，选择标记基因卡那霉素，带有bsai的限制性酶切位点和来源于px260的sgrna序列。识别lrk1基因cds区的特异性序列通过人工合成完成。最后，将10ng的消化后的pbgk032载体和0.05mm oligo
结合子连接，10μl反应体系。测序确认没有发生碱基突变后，进行下一步操作，包括大肠杆菌表达质粒、根癌农杆菌介导的水稻转化和愈伤组织再生系统。
[0090]
4.农杆菌介导的转基因和突变体检测
[0091]
构建好的crispr/cas9通过热激法，在根癌农杆菌菌株eha105(购自ntcc典型培养物保藏中心-biovector质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心)中表达。转化受体的选择一般为野生型水稻(中花11)(购自上海光明种业有限公司)种子成熟胚诱导愈伤组织，经过诱导培养基增减2周后将胚芽剪下，继续培养1周，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。采用农杆菌介导的遗传转化方法(hiei et al.1994)，将含有上述两种质粒载体的eha105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有120mg/lg418的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有120mg/l预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。1个月左右得到抗性转基因植株。
[0092]
5.lrk1序列信息
[0093]
lrk1cds序列(》loc_os03g51440.1；seq id no:1)：
[0094]
atggaggaggaggagatgatgcgggctggtggttgttgttgtggtggtggtggggtctgggcgcggctactgctgctcgtggcggtggtggcggcgcccggggcggtggtggcgcagcaggggaacctcacgtcgcgggcggatctctcggggctctacgcgctgcgcggctcgctcgggctgcgcgcgcgggactggccgcgccgcgccgacccctgcacggcgtgggccggggtgcgctgcagcggcggccgcgtcgtgtcggtcgacctcgccgggctgcgccgcacgcggctggggcgcctggcgccgcggttcgccgtcgacgggctgcgcaacctcacgcggctcgaggccttcagcgcgcccgggttcggcctgccaggctcccttccggcgtggctcggcgcggggctcgcgcccaccttccagctcctcgacatctccggctgcgccgtcacgggggagatccccgcctcggccatcgccggcctcagcaacctcaccactctcaacctcgcggggaatctactctcggggcagctccctggcagtgctctcgccgggctcgctcggctcaagactctcaacctctctggcaatgccttctcaggcgagctacccaaggcggtctggtcgctcccggagctgagcgttctcgatgtgtctcggaccaacctcaccggcgcattgccggatacagggctcgcgcttccatccaatgtacaggtggtggatctgtccgggaacctcttctatggtggcgtgccgggatcctttggccaacttttcggtaggacgaagctggccaatatctctgggaattacttcgacggcaaactgggtgtatccaatggtgatggtgggaatttctcatttgagttgaattgcttcgttgatgtcactggacagcgtagccaggcagaatgtcagcagttctatgctgcacgtggtttgccgtataatgtttcaggtcctgcacccacaccgcagcctgcgatgccagcttcaccgggaaggaaaaaggggcacaagaatttgaagtatatactgattggagccatttgcggcggtgtcctcttggtagctgtgattgctgccattttgtattgcttggtgtgctctgggagtaggaggaatgggagtaggaatgatcagcgggaaagtggcgtgcggaacacacagttgggagcgtctggaactggtgggggtgcagttactgctggcacgcaaccttctgcatcgcctgcaaacttggcaaaggtcggtgattcattcggttatgaccagctcgtcgaagccaccacggactttggagatgataggcttatcaagcatggtcactcaggtgatctttaccttggggcgctccatgatgggacctctgtggttgtgaagaggataacttccagcatggctaagaaagatgcttatatggcggagctagatttatttgccaaaggattgcatgaaaggctggtgccgatcatggggcattgccttgataaagaggaggagaaatttctcgtgtatatatttgtccggaatggcgacttatcaagtgcactgcacagaaagtcaggggaggaagaggaaggcctgcaatctttggactggataaagaggctgaaaattgcaacaggagtggcagaggcactatgctatctccaccacgagtgtaatccaccaatggttcacagggacgtgcaagctagcagtattcttcttgatgataaatttgatgtgcgccttgggagtttgagcgaggtgtgtcctcaagaaggggaaggccaccaaaatgtcatcacaaagctgttgagattttcatcgactgcggatcaaggatcttctggttctccatctgcatcatgttcatatgatgtctattgctttggaaaagttttgttggagctggtgactggaaggctaggtatcagtgcatcaaatgatgctgcaacgaatgagtgg
cttgatcacactctgcgctacattaatatttatgagaaagagctcatgagcaagatcattgatccatcacttataattgatgaggaccatctggaggaagtctgggcaatggcaattgttgcaaagtcctgcttgaatcctaggtcttctaaacggccgccgatgaaatatattctaaaagcactagagaatccgttgaaggtggtgagggaagataacggcggctctagctcagcccgtttgagagccacgtcatcacggggatcatggaatgctgcattcttcgggagttggcggcatagctcgtctgatataggtccttcaagggatgacaacttgttgaaacgctcagagacgatcaaatcatccggagggagcaatggtgaccattcttcctcccgcaggaggcaatcgaaggagatcttccctgagccatctggttcacgtgacaccgaggattaa
[0095]
lrk1蛋白序列(》loc_os03g51440.1，seq id no:2)：
[0096]
meeeemmraggcccggggvwarllllvavvaapgavvaqqgnltsradlsglyalrgslglrardwprradpctawagvrcsggrvvsvdlaglrrtrlgrlaprfavdglrnltrleafsapgfglpgslpawlgaglaptfqlldisgcavtgeipasaiaglsnlttlnlagnllsgqlpgsalaglarlktlnlsgnafsgelpkavwslpelsvldvsrtnltgalpdtglalpsnvqvvdlsgnlfyggvpgsfgqlfgrtklanisgnyfdgklgvsngdggnfsfelncfvdvtgqrsqaecqqfyaarglpynvsgpaptpqpampaspgrkkghknlkyiligaicggvllvaviaailyclvcsgsrrngsrndqresgvrntqlgasgtgggavtagtqpsaspanlakvgdsfgydqlveattdfgddrlikhghsgdlylgalhdgtsvvvkritssmakkdaymaeldlfakglherlvpimghcldkeeekflvyifvrngdlssalhrksgeeeeglqsldwikrlkiatgvaealcylhhecnppmvhrdvqassillddkfdvrlgslsevcpqegeghqnvitkllrfsstadqgssgspsascsydvycfgkvllelvtgrlgisasndaatnewldhtlryiniyekelmskiidpsliidedhleevwamaivaksclnprsskrppmkyilkalenplkvvrednggsssarlratssrgswnaaffgswrhsssdigpsrddnllkrsetikssggsngdhsssrrrqskeifpepsgsrdted*
[0097]
lrk1启动子区序列(》chr3:29432451..29430451，seq id no:3)
[0098]
ggaacagcaccgagaggaatcatgaggattggtaatacaaggaaacatattgacagacatgccatgcatgaaacattgctaacagaatggactacggttcggtggatgggaatgggatacgcctccaccccgccgcggcgccggcgtccgaacgaacgaacgaacgaacgtgacgtgaagggtattgcgttgcgctgcgcctcgcctcgccttgtgcggttttgcgacgccggccgccgcctgtggtggtgggctcgcgcgacgtgccgcgctctcttctgttcgtttttattacctgacgcgtccgacctgggatccacccgtcgcgatggctccaccgcgtagtagtagtagtggcttgtccagtggccaccacaaactagacctgtcattactcattactgccgtgtcaaagccagccgggaaaagaagaaaaaaaagaaggaaaaatcaatggatgctatgaaacgcttgcgggtacagcagcagccaatgcattttgcaattcttctacaacatctcattcccagtccggcaaacctgcagggtgcaaatccagtaatacatcaattccatccgtttaaaaggagaaatcctacattcaatgctcacgtgctagctagcatgaggctggctgcctggctgtggttaattgacactacccctgcacgtaaacaactgtagaaacgaactgtcgtattttcgcctcctaaatgctgccgcccatcaaatgctcgtatcatatcatatcatatctatttagcccgttataatgtcctcccaaaataaagaaaaatatctctacgtgcacagcacacaacataaatctaacattgctctggattacaacacagattatacatccgactttcactcttatctgaagcacaaagaaaaaaagaaaattcaaaaatgaatcagaatcgacatctacgatggttagtggtgtatgaaactgacatagataaagattaaattggtgtttgaataattaagttttaattattataaacttgataaataaatatatttaatattttaaaataaattttacatagaaagttttttttacgaaatacactatttaataatttaaaaagcatgtcaacgaaaatcacgtaaaatctgaatttcaacccacccaaagataacgcgcacgacgcccgcgcccacggccctcgttgacccgcccgaaaaaccccaccaaaccccccctcctcgcaaccggccgtacgtgcagccaccacgcaccgaaccaaacccgccgcgagagcgagacccacccaccacgcgcggccgggttcactcaccctcaccctctcagtggcagccgccggcaattgagccccgcgcaccaggggcagcgccgtcaaaacgcaacgcagccagggagaaaaggcaagttgtgagtgagcgagccagccagtgcacaggga
aatcggggaaatcgtcggggaaatcgcatgccatttcagcccggaagatttgatttcaaaaaaaacatttaacagcttccttaaacaaccgaaaccccccacgatatcagctctctctctctccctcctcccatctcctcgtcttcctcctcctgacctcctcgtcgtcgtcgtctctcttcgccggctccggcggcggcggctgctcgcacccggtggcgtgaccgcggcggcggtggagtggagtggaatttgggttcggatcggcggagagaggaggaggagagggggtaataattgggaggcagttgggggagtgtaactttgggcattgatggcggggtagagaaggtgagcccccaaggaggagggtggtggtggtggtggcttctgtacctgcgaccctgcgttgctctgcgcccctctcctttattgcgtttaatttccctcccaattccgtctctccgctgcctgcctggcttctccgcgattccatccatagtttggagtggggaggaatggggagtggcggcggcggcggaggtggtggtggtggtggtggtgg
[0099]
lrk1基因序列(含内含子)(》chr3:29430451..29426346，seq id no:4)：atggaggaggaggagatgatgcgggctggtggttgttgttgtggtggtggtggggtctgggcgcggctactgctgctcgtggcggtggtggcggcgcccggggcggtggtggcgcagcaggggaacctcacgtcgcgggcggatctctcggggctctacgcgctgcgcggctcgctcgggctgcgcgcgcgggactggccgcgccgcgccgacccctgcacggcgtgggccggggtgcgctgcagcggcggccgcgtcgtgtcggtcgacctcgccgggctgcgccgcacgcggctggggcgcctggcgccgcggttcgccgtcgacgggctgcgcaacctcacgcggctcgaggccttcagcgcgcccgggttcggcctgccaggctcccttccggcgtggctcggcgcggggctcgcgcccaccttccagctcctcgacatctccggctgcgccgtcacgggggagatccccgcctcggccatcgccggcctcagcaacctcaccactctcaacctcgcggggaatctactctcggggcagctccctggcagtgctctcgccgggctcgctcggctcaagactctcaacctctctggcaatgccttctcaggcgagctacccaaggcggtctggtcgctcccggagctgagcgttctcgatgtgtctcggaccaacctcaccggcgcattgccggatacagggctcgcgcttccatccaatgtacaggtggtggatctgtccgggaacctcttctatggtggcgtgccgggatcctttggccaacttttcggtaggacgaagctggccaatatctctgggaattacttcgacggcaaactgggtgtatccaatggtgatggtgggaatttctcatttgagttgaattgcttcgttgatgtcactggacagcgtagccaggcagaatgtcagcagttctatgctgcacgtggtttgccgtataatgtttcaggtcctgcacccacaccgcagcctgcgatgccagcttcaccgggaaggaaaaaggggcacaagaatttgaagtatatactgattggagccatttgcggcggtgtcctcttggtagctgtgattgctgccattttgtattgcttggtgtgctctgggagtaggaggaatgggagtaggaatgatcagcgggaaagtggcgtgcggaacacacagttgggagcgtctggaactggtgggggtgcagttactgctggcacgcaaccttctgcatcgcctgcaaacttggcaaaggtcggtgattcattcggttatgaccagctcgtcgaagccaccacggactttggagatgataggcttatcaagcatggtcactcaggtgatctttaccttggggcgctccatgatgggacctctgtggttgtgaagaggataacttccagcatggctaagaaagatgcttatatggcggagctagatttatttgccaaaggattgcatgaaaggctggtgccgatcatggggcattgccttgataaagaggaggagaaatttctcgtgtatatatttgtccggaatggcgacttatcaagtgcactgcacagaaagtcaggggaggaagaggaaggcctgcaatctttggactggataaagaggctgaaaattgcaacaggagtggcagaggcactatgctatctccaccacgagtgtaatccaccaatggttcacaggtataaacttctttgtatttacatgaatacaaaatttatttcagttggatgtttgcttttcgggtataaacttctttgtatttatgtgaatgaaaaaattatttcagttggaatgctctggccacatatttaatgaatttggatattgctgaattactgctgtgtactaattatacgatccatagcttacttaaaccgaaaaaaatcagaatatgaacagcactgttttttgtttatccacctcgcgggaaatggagggcggttatgtagcattgttttttattggacgttgcaattctgatgagttggcatgctatgttcaggtatacttgctagatcctccatcttatatataggcacttctttattatcatgctattttatagtcaagttaaatctgaatatgtgtgatcaccttgtccgtaattcagttggtccaaatatccttttatgtgactttcaatgagatgtttctatgcactatattactaccaactagacaatgttaaagatttgagcacccctcctgatatcatgcaaatgcatcagaagttctttgttggcttcatttcgctaggaaagcattg
ttttggtattaaagtgaaacatgcagtaaaccatgtgagtaatcttggttgttgaactaatgagatcatgatctgccacagggacgtgcaagctagcagtattcttcttgatgataaatttgatgtgcgccttgggagtttgagcgaggtgtgtcctcaagaaggggaaggccaccaaaatgtcatcacaaagctgttgagattttcatcgtaagttttaacttttagcactgcatactctgtttcttagctctacgtgtaagactcgaatatccataaaatgcttgattgcacttcgctgttcagttcatcatgcctattcattttgctaacatttgaattaaacttgtgctttgagttccgaatatatattagtcaattatactatattatccttcctctcccatgtattgagggtgcagctaagcaaattccaaattggtttctatatgcacaggacaaaaatagtgctagtaggcccgttggtagcgaaagtaattggaaactttctcctagcatttcagatcctgatatggctcatgttctgctgccagtttattttatgtaatttctttttgctgcactgaatgaaattcgtctcattttctaatgttgtgttgttttctgggaaatgtaggactgcggatcaaggatcttctggtaagtccatgcatccatgcttgctttcatttctttcaagtgttagctgcctaatgtttgaaactgatgatgacactgttaaattgtgttgtataactgtatctatagatgttttaggttcatggatgcaagtgcattgacaaacctctaatttaaccaggttctccatctgcatcatgttcatatgatgtctattgctttggaaaagttttgttggagctggtgactggaaggctaggtatcagtgcatcaaatgatgctgcaacgaatgagtggcttgatcacactctgcgctacattaatatttatgagaaagagctcatgagcaagatcattgatccatcacttataattgatgaggaccatctggaggaagtctgggcaatggcaattgttgcaaagtcctgcttgaatcctaggtcttctaaacggccgccgatgaaatatattctaaaagcactagagaatccgttgaaggtggtgagggaagataacggcggctctagctcagcccgtttgagagccacgtcatcacggggatcatggaatgctgcattcttcgggagttggcggcatagctcgtctgatataggtccttcaagggatgacaacttgttgaaacgctcagagacgatcaaatcatccggagggagcaatggtgaccattcttcctcccgcaggaggcaatcgaaggagatcttccctgagccatctggttcacgtgacaccgaggattaaggagctttcttttgtcttgtgacccttttagtgcaaagagaagtccatgaagggtggcagctgtcgaagcgctgctgctaccttgtgattgaattctttcagctgacagatcgaagcgtgaatttcctgcatgtcattgacttcacaggcagcatactggcatcaggggtaccatttttcggggtggactgggaagcgatcgtatagtggattagtggttggtgcccaatgcatgatctggacaaatggcttggcaatgttgttatttttctttcccctcttgattaaaaagaaagaatggcgagctgattctttttcttcttccctactgtaattgattgtttcattgttgatcatagcagaaatgttcgttccattcacgcctggcagtgcctggtttctgtgctgcttttcagaatc
[0100]
实施例1、气孔开关表型全基因组关联分析(gwas)及基因初步筛选
[0101]
本发明人利用217份来自全球97个国家的水稻自然小核心群体(minicore)，通过多年多点试验，来调查2个地点(人工气候室(gr)和上海大田环境(field))夜间暗呼吸速率(rd)，并利用2.3m过滤后的全基因组覆盖的snps进行关联分析，获得rd的曼哈顿图(图1a和图1b)。
[0102]
室内和大田条件下最高snp峰值(3m29440628)位于第三号染色体上p值为2.5e-08(图2a-b)。利用gcta软件计算最高snp峰值的连锁不平衡距离(ld＝50kb)。在该峰值上下游50kb附近，共发现有12个候选基因(图2c)。选取极端rd表型的高低各6份材料，通过qpcr分析12个候选基因在极端表型个体材料中的表达差异(表1)。从获得的这些候选基因中，本发明人筛选到lrk1基因(pair-wise t-test p值＝0.0003)。
[0103]
实施例2、lrk1基因的不同物种的进化树分析
[0104]
通过ncbi蛋白序列比对，发现lrk1基因编码的蛋白序列在不同物种中广泛存在，并高度保守(图4)。与拟南芥中lrk1基因相似度最高(98％)，而与其他主要粮食作物包括玉米、高粱相似度略低，但仍处于同一个亚群中。
[0105]
实施例3、lrk1基因的单倍型分析
[0106]
本发明发现，lrk1基因启动子区上游242bp处包含一个显著关联snp，另在基因的第一个外显子上包含2个显著关联snp，分别位于709bp和1479bp处，在第二个和第四个外显子上分别包含1个snp，分别位于下游1806和2621bp处(图3a)。这些显著关联snp可分为2种单倍型。在minicore群体中，单倍型1(hapi)含有171个水稻材料，单倍型2(hapii)包含35个水稻材料(图3b)。单倍型2中大部分(94.2％)水稻材料属于籼稻类型，而单倍型1中包含不同的水稻亚群体类型(图3c)。
[0107]
实施例4、候选基因的功能验证
[0108]
本发明利用crispr技术敲除lrk1基因的第1个外显子，lrk1的基因组序列位置上第509位(seq id no:4第509位)的“c”缺失；即造成第171位(seq id no:2第171位)氨基酸突变及180位终止编码，因此命名为lrk1(图5a～b)。
[0109]
该敲除材料在正常条件下(25℃室温人工气候室)的表型与野生型(中花11，属于单倍型1)差别不大(图5c)；但夜间暗呼吸速率rd显著降低(图5d)，说明lrk1基因与夜间暗呼吸速率存在直接的联系。
[0110]
实施例5、lrk1基因水稻突变体的高温抗性评估
[0111]
为了证明lrk1基因在夜间暗呼吸的变化与高温的响应能力，本发明人首先比较了2个单倍型与minicore群体原始起源地理气候温度(年均温度)，发现相对于单倍型1，在单倍型2中35个水稻材料所述的生长环境具有显著更高的年平均温度(图6a)。本发明人进一步的分析提示，在单倍型2中，-242位为a起了关键性的作用。-242位t转化成a，可以大幅度上调lrk1的基因表达。
[0112]
本发明人通过短期不同温度调控，来检测水稻中lrk1基因的表达，发现lrk1基因的表达水平明显受到温度刺激而随着温度的上升呈现上调表达(图6b)。在35℃人工气候室(额外配备解热器)条件下，分蘖盛期进行20天高温处理后，突变体材料lrk1具有缓慢的生长发育速度、产量、株高和分蘖数降低(图6c)，同时夜间暗呼吸rd降低的表现更加明显(图6d)，仅仅为野生型(中花11)的约30％，说明lrk1基因参与温度响应的相关分子调控中。而lrk1基因表达高于突变体材料lrk1的野生型植株，则夜间暗呼吸rd及高温耐性比lrk1更理想，生长发育速度、产量、株高和分蘖数比突变体材料lrk1更理想。
[0113]
实施例6、lrk1基因过表达提高叶片暗呼吸速率和高温耐性
[0114]
lrk1基因过表达植株的建立：以pcambia1301作为过表达载体，在其多克隆位点插入lrk1基因的cds序列，构建35s驱动lrk1基因过量表达的重组质粒。该质粒携带有gfp标签蛋白和潮霉素抗性基因，用来后期筛选和蛋白纯化。通过农杆菌法转化水稻，实现在过表达植株中lrk1表达升高，进而显著提高夜间暗呼吸效率，提高高温耐性。
[0115]
实施例7、单独改变lrk1启动子区序列提高叶片暗呼吸效率和抗高温性
[0116]
以pcambia1301作为过表达载体，分别将2种类型启动子(seq id no:3)(上游242bp处携带不同snp)连接lrk1基因(lrk1cds序列(seq id no:1))插入该表达载体，建立以lrk1基因启动子驱动lrk1基因过量表达的重组质粒。
[0117]
以突变体材料lrk1为背景制备转基因植物，比较转基因后代材料的暗呼吸速率。结果提示，-242位为a的启动子，可以显著地上调lrk1的基因表达，从而提高转基因后代材料的暗呼吸速率。
[0118]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独
引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。