一种植物离体水培耐盐性快速鉴定的方法与流程

1.本发明涉及一种植物离体水培耐盐性快速鉴定的方法，属于农业技术领域。


背景技术：

2.土壤盐渍化是一个世界性的生态和环境难题。在我国的东北、华北、西北内陆地区以及长江以北沿海地带，盐碱土分布广泛，严重制约着经济和农业的发展。土壤中盐分过多不仅会抑制植物生长，还会对其产生渗透胁迫、离子毒害和次生胁迫等伤害，会抑制能量的产生以及影响代谢活动，严重威胁植物正常生长发育。但不同植物对盐胁迫的响应机制及敏感程度不同，在盐境条件下，植物自身可以通过提高保护酶活性、合成渗透调节物质和离子区域化等方式避免或减轻盐胁迫造成的危害。因此，探索植物在盐胁迫下的生理特性，开展植物耐盐性研究，选育耐盐植物对丰富盐碱地可利用植物品种，提高盐碱地利用率有着重要的意义。
3.不同植物耐盐胁迫的能力不同，能否在盐碱地应用，首先要对其耐盐性进行鉴定和评价。目前关于植物对盐胁迫的生理生化响应及耐盐性评价的研究众多。杨万鹏等研究认为可溶性糖含量、地径相对生长量、株高相对生长量、相对电导率和sod活性等可作为评价黑果枸杞耐盐能力的参考指标。杨佳鑫等研究认为株高生长量、新梢长度生长量、mda含量、sod和pod活性等可作为评定3个梅花品种幼苗耐盐能力的主要指标。通过筛选与耐盐性相关较大的生长及生理生化指标进行耐盐性评估，能够较为科学、准确地鉴定和评价不同植物基因型之间耐盐性差异。
4.虽然关于植物耐盐鉴定的方法很多，但大多耗费资源较多且需要一定的时间，急需一种快速、准确、简单易操作的植物耐盐性评价方法。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种植物离体水培耐盐性快速鉴定的方法，可有效鉴定植物耐盐性，有利于挖掘耐盐种质，解决了背景技术中存在的问题。
6.本发明采用的技术方案是：
7.一种植物离体水培耐盐性快速鉴定的方法，包括如下步骤：
8.准备多个三角瓶，根据不同植物类型配制不同nacl浓度梯度的盐处理溶液，定量加到准备好的三角瓶中；
9.选取植物当年生生长健壮、无病虫害且长势一致枝条，剪下并剪成一致高度28cm-30cm，插入到装有nacl溶液的三角瓶中进行盐胁迫处理；
10.分别于盐处理后的3d、5d和7d观测植物表型，测定不同盐处理下植物叶片的相对电导率，每处理选取3株相同部位叶片进行测定，试验重复3次，计算平均值。
11.植物叶片相对电导率测定步骤如下：
12.清洗叶片，擦干水分，称量0.1g叶片，剪成大小一致的碎块，放入20ml玻璃试管中，加入15ml蒸馏水，封口，放入25℃恒温箱中，静置30min；用电导率仪测定其电导率c1和所用
蒸馏水作对照的电导率c0；然后沸水浴10min，冷却后测定电导率c2。按下式计算相对电导率(p)：
13.p＝(c
1-c0)/(c
2-c0)
×
100％。
14.利用spss统计分析软件对不同nacl处理浓度与叶片相对电导率之间的关系进行回归曲线分析，用logistic方程y＝k/(1 ae-bx
)来拟合，其中y为相对电导率，x为盐处理浓度，k为细胞伤害率饱和容量，a、b为方程参数；为确定a、b值，可将方程转化为ln(k-y/y)＝lna-bt，令y'＝ln(k-y/y)，则转化成细胞伤害率(y')与处理浓度(x)的直线方程；用方程求二阶导数d2y/dx2＝0，则可以获得拐点即x＝lna/b，x即为半致死浓度(lc
50
)。
15.本发明的有益效果是：一是剪取植物当年生枝条，耗费资源较少，方法简便易操作；二是培养方式为水培，盐胁迫浓度相对恒定；三是7d盐处理试验结束，且可通过拟合logistic方程计算植物半致死浓度，可以快速、精准鉴定植物耐盐性；四是适用于柽柳、接骨木、菊花、天目琼花、多花蔷薇等多种植物。
附图说明
16.图1为本发明不同浓度nacl处理3d柽柳的表型特征；
17.图2为本发明不同浓度nacl处理下5d柽柳的表型特征；
18.图3为本发明不同浓度nacl处理下7d柽柳的表型特征；
19.图4为本发明不同nacl处理3d接骨木的表型特征；
20.图5为本发明不同nacl处理5d接骨木的表型特征；
21.图6为本发明不同nacl处理7d接骨木的表型特征；
22.图7不同nacl处理3d切花菊的表型特征；
23.图8不同nacl处理5d切花菊的表型特征；
24.图9不同nacl处理7d切花菊的表型特征。
具体实施方式
25.下面结合具体方案实例，对本发明做进一步的说明。
26.一种植物离体水培耐盐性快速鉴定的方法，包括如下步骤：
27.准备多个三角瓶，根据不同植物类型配制不同nacl浓度梯度的盐处理溶液，定量加到准备好的三角瓶中；
28.选取植物当年生生长健壮、无病虫害且长势一致枝条，剪下并剪成一致高度28cm-30cm，插入到装有nacl溶液的三角瓶中进行盐胁迫处理；
29.分别于盐处理后的3d、5d和7d观测植物表型，测定不同盐处理下植物叶片的相对电导率，每处理选取3株相同部位叶片进行测定，试验重复3次，计算平均值。
30.植物叶片相对电导率测定步骤如下：
31.清洗叶片，擦干水分，称量0.1g叶片，剪成大小一致的碎块，放入20ml玻璃试管中，加入15ml蒸馏水，封口，放入25℃恒温箱中，静置30min；用电导率仪测定其电导率c1和所用蒸馏水作对照的电导率c0；然后沸水浴10min，冷却后测定电导率c2。按下式计算相对电导率(p)：
32.p＝(c
1-c0)/(c
2-c0)
×
100％。
33.利用spss统计分析软件对不同nacl处理浓度与叶片相对电导率之间的关系进行回归曲线分析，用logistic方程y＝k/(1 ae-bx
)来拟合，其中y为相对电导率，x为盐处理浓度，k为细胞伤害率饱和容量，a、b为方程参数；为确定a、b值，可将方程转化为ln(k-y/y)＝lna-bt，令y'＝ln(k-y/y)，则转化成细胞伤害率(y')与处理浓度(x)的直线方程；用方程求二阶导数d2y/dx2＝0，则可以获得拐点即x＝lna/b，x即为半致死浓度(lc
50
)。
34.实施例1：
35.1、供试材料
36.供试材料为柽柳。
37.2、试验方法
38.试验共设置6个nacl处理，浓度梯度分别为0(ck)、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％和3.0％，每处理3次重复。将配置好的nacl溶液定量放入三角瓶中，剪取柽柳当年生生长健壮、无病虫害且长势一致枝条，剪成一致长度(28-30cm)，插入不同浓度nacl溶液中进行盐胁迫处理，分别于盐处理后的3d、5d和7d观测表型，测定不同处理下植物叶片相对电导率，每处理选取3株相同部位叶片进行测定，试验重复3次，计算平均值。
39.叶片相对电导率测定步骤如下：
40.清洗叶片，擦干水分，称量0.1g叶片，剪成大小一致的碎块，放入20ml玻璃试管中，加入15ml蒸馏水，封口，放入25℃恒温箱中，静置30min；用电导率仪测定其电导率c1和所用蒸馏水作对照的电导率c0；沸水浴10min，冷却后测定电导率c2。按下式计算相对电导率(p):
41.p＝(c
1-c0)/(c
2-c0)
×
100％。
42.利用spss对试验数据进行logistic拟合，拟合方程为y＝k/(1 ae-bx)，其中y为相对电导率，x为盐处理浓度，k为细胞伤害率饱和容量，a、b为方程参数；为确定a、b值，可将方程转化为ln(k-y/y)＝lna-bt，令y'＝ln(k-y/y)，则转化成细胞伤害率(y')与处理浓度(x)的直线方程；用方程求二阶导数d2y/dx2＝0，则可以获得拐点即x＝lna/b，x即为半致死浓度(lc
50
)。
43.3、试验结果
44.(1)不同nacl处理天数对柽柳相对电导率的影响
45.由表1可以看出，在第3d、第5d和第7d，柽柳的叶片电导率总体上均随着nacl浓度的增加而呈现逐渐升高的趋势，且升高幅度随着处理天数的增加而增大。在nacl处理第3d时，各处理均与对照差异显著，表明nacl胁迫对细胞膜透性造成影响，电解质外泄，细胞受到损伤，在1.0％以上nacl浓度下各处理均差异不显著，表明在第3d时，这几个处理对柽柳细胞膜透性均产生影响，但影响相差不大；在nacl处理第5d时，各处理均与对照差异显著，且细胞电导率上升幅度大于第3d处理，表明细胞受到的损伤加剧，在1.0％～2.0％nacl浓度下，各处理对细胞膜胁迫差异不大，但当nacl浓度大于等于2.5％时，与低浓度nacl胁迫处理差异显著，表明在高盐胁迫下，细胞膜的损伤程度加大；在nacl处理第7d时，各处理均与对照差异显著，且细胞电导率增加幅度最大，表明在第7d时，细胞膜的损伤程度最严重，在高浓度盐胁迫下，自身的调节机制已无法减轻盐胁迫对细胞的损伤。由图1、2、3可以看出，在盐胁迫第3d，柽柳已有明显反应，第5d这种胁迫程度加剧，第7d，胁迫程度基本达到最大，对细胞造成严重损伤。
46.表1 不同nacl处理天数对柽柳相对电导率的影响
[0047][0048]
(2)不同nacl处理天数下柽柳的表型特征
[0049]
由图1可以看出，盐处理3d时，1.0％和1.5％nacl处理对柽柳生长状态未产生影响，且与对照相比，小枝更加直立；从2.0％nacl浓度开始，柽柳小枝下垂，且高浓度盐胁迫下柽柳叶片有盐吸出。
[0050]
由图2可以看出，随着nacl处理天数的增加，高浓度盐胁迫下叶片发黄，萎蔫，且从1.5％nacl浓度以上柽柳小枝开始下垂，且叶片有盐吸出。
[0051]
由图3可以看出，随着nacl浓度的增加，1.5％nacl浓度以上柽柳小枝下垂越严重，叶片逐渐干枯萎蔫，有大量盐吸出。
[0052]
(3)拟合logistic方程确定柽柳半致死浓度
[0053]
结合柽柳叶片电导率和表型特征在nacl处理下变化的剧烈程度，选择第7d的试验数据拟合logistic方程，y＝k/(1 ae-bx
)，其中方程参数a值和b值分别为和；k值为33.7968，拟合值r2为0.9553，呈显著水平，表明拟合结果精确度较高。确定拐点浓度(lc
50
)即半致死浓度，为0.807％(表2)。
[0054]
表2 盐胁迫处理7d柽柳的logistic方程及半致死浓度
[0055][0056]
实施例2
[0057]
1、供试材料
[0058]
供试材料为接骨木。
[0059]
2、试验方法
[0060]
试验共设置6个nacl处理，浓度梯度分别为0(ck)、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1.0％，每处理3次重复。将配置好的nacl溶液定量放入三角瓶中，剪取接骨木当年生生长健壮、无病虫害且长势一致枝条，剪成一致长度(28-30cm)，插入不同浓度nacl溶液中进行盐胁迫处理，分别于盐处理后的3d、5d和7d观测表型，测定不同处理下接骨木叶片相对电导率，每处理选取3株相同部位叶片进行测定，试验重复3次，计算平均值。
[0061]
叶片相对电导率测定步骤如下：
[0062]
清洗叶片，擦干水分，称量0.1g叶片，剪成大小一致的碎块，放入20ml玻璃试管中，加入15ml蒸馏水，封口，放入25℃恒温箱中，静置30min；用电导率仪测定其电导率c1和所用蒸馏水作对照的电导率c0；沸水浴10min，冷却后测定电导率c2。按下式计算相对电导率(p):
[0063]
p＝(c
1-c0)/(c
2-c0)
×
100％。
[0064]
利用spss对试验数据进行logistic拟合，拟合方程为y＝k/(1 ae-bx)，其中y为相对电导率，x为盐处理浓度，k为细胞伤害率饱和容量，a、b为方程参数；为确定a、b值，可将方程转化为ln(k-y/y)＝lna-bt，令y'＝ln(k-y/y)，则转化成细胞伤害率(y')与处理浓度(x)的直线方程；用方程求二阶导数d2y/dx2＝0，则可以获得拐点即x＝lna/b，x即为半致死浓度(lc
50
)。
[0065]
3、试验结果
[0066]
(1)不同nacl处理天数对接骨木叶片相对电导率的影响
[0067]
由表3可以看出，在第3d，随着nacl浓度的增加，接骨木叶片电导率呈先升高后降低趋势，在0.2％和0.4％nacl浓度下与对照差异不显著，在0.6％nacl浓度及以上与对照差异显著，并且0.6％、0.8％和1.0％nacl处理间差异不显著，这表明在盐胁迫第3d，低浓度盐胁迫对接骨木叶片细胞膜未造成损伤，在高浓度盐胁迫(0.6％以上)处理下，接骨木细胞膜透性受到损伤，在0.6％～1.0％nacl浓度下损伤程度相差不大。在第5d和第7d，接骨木的叶片电导率总体上均随着nacl浓度的增加而呈现逐渐升高的趋势，且升高幅度随着处理天数的增加而增大。在nacl处理第5d时，在0.2％和0.4％nacl浓度下与对照差异不显著，在0.6％nacl浓度及以上与对照差异显著，但0.6％、0.8％和1.0％nacl处理间差异不显著，这表明在盐胁迫第5d，低浓度盐胁迫对接骨木叶片细胞膜影响不大，在高浓度盐胁迫(0.6％以上)处理下，接骨木细胞膜透性受到损伤，随着浓度的增加损伤程度加大，但差异并不明显；在nacl处理第7d时，在0.2％nacl胁迫浓度下与对照差异不显著，表明在此浓度下，盐胁迫对细胞膜透性的影响不大，在0.4％及以上nacl处理均与对照差异显著，且各处理间差异显著，表明随着盐胁迫时间的增加盐胁迫浓度的加大，细胞膜透性受到损伤，在1.0％时达到最大，表明在此浓度下细胞膜的损伤程度最严重。
[0068]
表3 不同nacl处理天数对接骨木叶片相对电导率的影响
[0069]
[0070]
(2)不同nacl处理天数下接骨木的表型特征
[0071]
由图4可以看出，盐处理3d时，0.2％和0.4％nacl处理从表型上看对接骨木生长影响不大，从0.6％nacl浓度开始，接骨木叶片下垂，0.8％和1.0％nacl处理下接骨木叶片卷曲，1.0％nacl处理下叶片卷曲最严重。
[0072]
由图5可以看出，随着nacl处理天数的增加，0.6％及其以上nacl浓度盐胁迫下叶片发黄，萎蔫，0.8％和1.0％nacl处理叶片卷曲，且1.0％nacl处理下叶片叶缘开始变黑。
[0073]
由图6可以看出，随着nacl处理天数的增加，0.4％nacl处理下叶片下垂，0.6％及其以上nacl浓度盐胁迫下叶片发黄，萎蔫，卷曲，且叶缘开始发黑，随着nacl浓度的增加叶片的受害程度增加。
[0074]
(3)拟合logistic方程确定接骨木半致死浓度
[0075]
结合接骨木叶片电导率和表型特征在nacl处理下变化的剧烈程度，选择第7d的电导率值拟合logistic方程，y＝k/(1 ae-bx
)，其中方程参数a值和b值分别为10.8427和4.7386；k值为52.4862，拟合值r2为0.9629，呈显著水平，表明拟合结果精确度较高。确定拐点浓度(lc
50
)即半致死浓度，为0.502％(表4)。
[0076]
表4 盐胁迫处理7d接骨木的logistic方程及半致死浓度
[0077][0078]
实施例3
[0079]
1、供试材料
[0080]
供试材料为切花菊。
[0081]
2、试验方法
[0082]
试验共设置6个nacl处理，浓度梯度分别为0(ck)、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1.0％，每处理3次重复。将配置好的nacl溶液定量放入三角瓶中，剪取切花菊当年生生长健壮、无病虫害且长势一致枝条，剪成一致长度(28-30cm)，插入不同浓度nacl溶液中进行盐胁迫处理，分别于盐处理后的3d、5d和7d观测表型，测定不同处理下切花菊叶片相对电导率，每处理选取3株相同部位叶片进行测定，试验重复3次，计算平均值。
[0083]
叶片相对电导率测定步骤如下：
[0084]
清洗叶片，擦干水分，称量0.1g叶片，剪成大小一致的碎块，放入20ml玻璃试管中，加入15ml蒸馏水，封口，放入25℃恒温箱中，静置30min；用电导率仪测定其电导率c1和所用蒸馏水作对照的电导率c0；然后沸水浴10min，冷却后测定电导率c2。按下式计算相对电导率(p):
[0085]
p＝(c
1-c0)/(c
2-c0)
×
100％。
[0086]
利用spss对试验数据进行logistic拟合，拟合方程为y＝k/(1 ae-bx)，其中y为相对电导率，x为盐处理浓度，k为细胞伤害率饱和容量，a、b为方程参数；为确定a、b值，可将方程转化为ln(k-y/y)＝lna-bt，令y'＝ln(k-y/y)，则转化成细胞伤害率(y')与处理浓度(x)的直线方程；用方程求二阶导数d2y/dx2＝0，则可以获得拐点即x＝lna/b，x即为半致死浓度(lc
50
)。
[0087]
3、试验结果
[0088]
(1)不同nacl处理天数对切花菊叶片相对电导率的影响
[0089]
由表5可以看出，在第3d，随着nacl浓度的增加，切花菊叶片电导率逐渐升高，在0.2％～0.8％nacl浓度下均与对照差异不显著，在1.0％nacl浓度下与对照差异显著，这表明在盐胁迫第3d时，0.8％及以下nacl浓度盐胁迫对切花菊叶片细胞膜未造成损伤，在1.0％nacl浓度下，切花菊叶片细胞膜透性开始受到损伤。在盐处理第5d和第7d时，切花菊叶片相对电导率均在0.6％及其以上nacl浓度下与对照差异显著，这表明在盐胁迫第5d时，0.6％及其以上nacl浓度对切花菊叶片细胞膜透性产生影响，且随着处理时间的增加，细胞膜透性受到的损伤程度加剧，在1.0％nacl浓度下，达到最大，表明在第7d在1.0％nacl浓度下细胞膜的损伤程度最严重。
[0090]
表5 不同nacl处理天数对切花菊叶片相对电导率的影响
[0091][0092]
(2)不同nacl处理天数下切花菊的表型特征
[0093]
由图7可以看出，盐处理3d时，不同nacl浓度处理下的切花菊从表型上与对照均差异不大，仅1.0％nacl处理下切花菊顶端叶片微卷曲。
[0094]
由图8可以看出，随着nacl处理天数的增加，在0.2％～0.4％nacl处理下切花菊于对照差异不大，顶端叶片与对照相比微微发黄；随着nacl浓度的增加，切花菊顶端叶片发黄明显，且叶片开始卷曲皱缩。
[0095]
由图9可以看出，随着nacl处理天数的增加，在0.2％～0.4％nacl处理下切花菊于对照差异不大，顶端叶片与对照相比微微发黄；随着nacl浓度的增加，切花菊顶端叶片发黄明显，且叶片卷曲皱缩，在1.0％nacl浓度下症状最明显，表明随着nacl浓度的增加叶片的受害程度增加。
[0096]
(3)拟合logistic方程确定切花菊半致死浓度
[0097]
结合切花菊叶片电导率和表型特征在nacl处理下变化的剧烈程度，选择第7d的电导率值拟合logistic方程，y＝k/(1 ae-bx
)，其中方程参数a值和b值分别为5.5912和3.0789；k值为35.1046，拟合值r2为0.9459，呈显著水平，表明拟合结果精确度较高。确定拐点浓度(lc
50
)即半致死浓度，为0.559％(表6)。
[0098]
表6 盐胁迫处理7d切花菊的logistic及半致死浓度
[0099]