肝癌免疫检查点抗体耐药小鼠及细胞株的制备与应用的制作方法

1.本发明涉及一种肝癌免疫检查点抗体耐药小鼠及细胞株的制备与应用，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc，简称肝癌)是世界上最常见的肿瘤之一，其发生率及死亡率分别在肿瘤的第6位及第4位。早期及极早期肝癌以局部消融、手术、移植为主，而中期肝癌治疗以肝动脉栓塞化疗术为主，晚期肝癌患者只能接受全身系统性治疗，主要包含以索拉非尼、仑伐替尼为主的一线治疗及包括瑞戈非尼、卡博替尼、纳武单抗、派姆单抗等在内的二线治疗。即便是作为一线治疗药物，sorafenib中位生存期10.7个月(安慰剂组7.9个月)，lenvatinib中位生存期13.6个月(sorafenib中位生存期12.3个月)，为患者带来的生存获益也是有限的。
3.肝癌是典型的炎症相关肿瘤，不管是乙肝及丙肝相关肝癌，还是酒精性肝炎及非酒精性脂肪性肝病所导致的肝癌，均要经历慢性肝炎、肝硬化直至肝癌的发生过程，癌变的细胞需要逃脱免疫识别及免疫清除阶段，直至免疫逃逸。在此过程中，免疫检查点，包括程序性死亡受体(programmed cell death-1，pd-1)和程序性死亡配体1(programmed cell death ligand-1，pd-l1)发挥着重要作用，这是免疫检查点pd-l1/pd-1抗体用于肝癌治疗的理论基础。免疫检查点抑制剂在晚期黑色素瘤、肺癌、尿路上皮癌、肾细胞癌等恶性肿瘤取得较好的治疗效果，2017年9月，nivolumab被fda批准用于进展期肝癌的治疗，开启了肝癌免疫治疗的新时代。免疫检查点抑制剂pd-l1/pd-1抗体目前在肝癌的应用的有nivolumab(pd-1单抗，opdivo)，pembrolizumab(pd-1单抗，keytruda)和atezolizumab(pd-l1单抗，tecentriq)。nivolumab与pembrolizumab对肝癌的治疗效果是肯定的，然而，checkmate-459的结果显示，pembrolizumab与sorafenib相比，总体生存期未显示显著优势。总体而言，pd-l1/pd-1单抗已经展示在晚期肝癌确切的治疗效果，但其治疗效果有限，仍然受耐药问题的限制。而目前尚未有对pd-l1抗体获得性耐药小鼠模型及耐药细胞株，因此，构建pd-l1抗体获得性耐药小鼠模型及耐药细胞株显得尤为重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为解决如何获得pd-l1抗体获得性耐药小鼠模型及耐药细胞株的技术问题。
5.为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种肝癌免疫检查点抗体获得性耐药小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
6.步骤1：利用鼠源性肝癌细胞系hepa1-6，构建小鼠皮下瘤模型，再给予免疫检查点pd-l1抗体治疗；
7.步骤2：检测用药后的肿瘤大小；获得用药后肿瘤没有缓解的小鼠；
8.步骤3：应用步骤2中获得的用药后肿瘤没有缓解的小鼠的肿瘤组织分别构建小鼠
肝癌皮下瘤及原位瘤模型；给予小鼠模型免疫检查点pd-l1抗体治疗，检测用药后的肿瘤大小；
9.步骤4：重复步骤1至步骤3，直至当免疫检查点pd-l1抗体或pd-1抗体治疗组的肿瘤大小与对照组相比无差异甚至超过对照组时，肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠模型构建成功。
10.本发明提供一种肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠耐药细胞株的构建方法，应用上述的一种肝癌免疫检查点抗体获得性耐药小鼠模型的构建方法获得肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠，提取pd-l1抗体获得性耐药小鼠的肿瘤原代细胞，对原代细胞进行传代培养，获取pd-l1抗体耐药肿瘤的细胞株。
11.本发明提供一种肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠耐药细胞株，应用耐药细胞株构建皮下瘤小鼠模型，在pd-l1抗体治疗后，皮下瘤仍能快速生长；耐药细胞株已于2021年9月1日在中国典型培养物保藏中心保藏，培养物名称为hepa1-6小鼠肝癌细胞res1-6，保藏编号为cctcc no:c2021234。
12.本发明提供一种肝癌免疫检查点抗体获得性耐药小鼠模型在筛选抗肿瘤药物中的应用。
13.本发明提供一种肝癌免疫检查点抗体获得性耐药小鼠模型在制备抗肿瘤药物中的应用。
14.本发明提供一种肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠耐药细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。
15.本发明提供一种肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠耐药细胞株在制备抗肿瘤药物中的应用。
16.本发明提供一种肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠耐药细胞株在评估抗肿瘤药物治疗效果的检测试剂盒中的应用。
17.本发明提供一种肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠耐药细胞株在非诊断方法和非治疗方法上的应用。
18.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
19.通过本发明为研究肿瘤对pd-l1抗体耐药的分子机制和逆转耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物提供了可研究的生物材料；通过本发明可以筛选pd-l1抗体耐药的肿瘤标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等，具有较高的科研和临床应用价值。
20.保藏信息：
21.2021年9月1日保藏在中国典型培养物保藏中心cctcc，中国典型培养物保藏中心的地址位于：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，武汉大学保藏中心，邮编：430072，培养物名称为hepa1-6小鼠肝癌细胞res1-6，保藏编号为cctcc no:c2021234。
附图说明
22.图1为pd-l1抗体获得性耐药皮下瘤模型构建过程中获得的相关图；
23.其中图a为构建小鼠皮下瘤模型过程图；图b为小鼠皮下瘤用药后部分肿瘤完全缓解、部分缓解(8/10)，2只小鼠肿瘤(2/10)没有缓解；图c为同型对照ctrl组肿瘤体积大小增殖图，横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为肿瘤体积(单位：mm3)；图d为pd-l1抗体治疗的肿
瘤体积大小增殖图,横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为肿瘤体积(单位：mm3)；图e为同型对照igg组肿瘤体积大小均值及pd-l1抗体治疗耐药肿瘤体积大小均值增殖图，与同型对照igg组相比，耐药组肿瘤体积与对照组相比没有显著差异,横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为肿瘤体积(单位：mm3)；图f为同型对照igg组肿瘤重量及pd-l1抗体敏感组和不敏感组肿瘤重量，敏感组肿瘤重量与对照组相比显著降低，耐药组与对照组相比没有显著性差异，与敏感组相比肿瘤重量显著增大，横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为肿瘤重量(单位：克)。
24.图2为验证pd-l1抗体耐药肿瘤对pd-l1抗体/pd-1抗体耐药效果相关实验图；
25.其中图a为pd-l1抗体耐药肿瘤对pd-l1抗体/pd-1抗体耐药效果小鼠皮下瘤模型过程图；图b为pd-l1抗体耐药肿瘤皮下瘤组织块传瘤图，横坐标为实验分组，同型对照组ctrl igg，耐药对照组res igg，同型对照pd-l1抗体治疗组ctrl apd-l1，耐药对照pd-l1抗体治疗组res apd-l1，同型对照pd1抗体治疗组ctrl apd1，耐药对照pd1抗体治疗组res apd1；图c为pd-l1抗体耐药皮下瘤组织块体积大小增殖趋势图，横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为肿瘤体积(单位：mm3)；图d为pd-l1抗体耐药皮下瘤组织块重量趋势图，横坐标为实验分组，纵坐标为肿瘤重量(单位：克)。
26.图3为验证原位pd-l1抗体耐药移植瘤对pd-l1抗体耐药效果相关实验图；
27.其中图a为原位瘤验证pd-l1抗体耐药移植瘤对pd-l1抗体耐药效果模式图；图b为pd-l1抗体耐药原位移植瘤图，实验分四组，耐药同型对照组res-igg,耐药pd-l1抗体治疗组res-apd-l1，同型对照组ctrl-igg，同型对照pd-l1抗体治疗组ctrl-apd-l1；图c为原位瘤荷瘤小鼠生存时间生存分析模式图；图d为原位瘤荷瘤小鼠生存时间分析图，横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为剩余生存百分数。
28.图4为验证pd-l1抗体耐药肝癌细胞res1-6耐药效果相关实验图；
29.其中图a为pd-l1抗体耐药肝癌细胞res1-6皮下瘤耐药效果模式图；图b为pd-l1抗体耐药肝癌细胞res1-6皮下瘤图片，实验分四组，同型对照组hepa1-6igg,同型对照pd-l1抗体治疗组hepa1-6 apd-l1，耐药对照组res-igg，耐药pd-l1抗体治疗组res-apd-l1；图c为pd-l1抗体耐药肿瘤细胞res1-6皮下瘤体积大小增殖趋势图，与对照组相比，横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为肿瘤体积(单位：mm3)；图d为pd-l1抗体耐药肿瘤细胞res1-6肿瘤重量趋势图，横坐标为实验分组，纵坐标为肿瘤重量(单位：克)。
具体实施方式
30.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
31.如图1-4所示，本发明提供一种肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠模型及耐药细胞株，并提供该耐药小鼠模型及耐药细胞株的构建方法。
32.本发明利用鼠源性肝癌细胞系hepa1-6，构建小鼠皮下瘤模型，给予免疫检查点pd-l1抗体同型对照igg，3天1次，每次200μg。每3天检测肿瘤大小。用药后肿瘤没有缓解的小鼠，说明该小鼠肿瘤具有pd-l1抗体耐药性潜能。为了验证上述构建的pd-l1抗体耐药模型的确定性及稳定性，将可能耐药的肿瘤组织块剪碎并传至c57bl/6小鼠皮下及肝包膜下，分别构建小鼠肝癌皮下瘤及原位瘤。从第7天开始继续给予pd-l1抗体或pd-1抗体及igg，记录肿瘤体积。反复经过此筛选验证流程，当pd-l1抗体或pd-1抗体治疗组肿瘤大小与对照组相比无差异甚至超过对照组时，肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠模型构建成功。利用肝癌
pd-l1抗体获得性耐药小鼠模型，采用细胞提取试剂盒提取上述的pd-l1抗体耐药的肿瘤原代细胞，并对原代细胞进行传代培养，获取pd-l1抗体耐药肿瘤的细胞系。利用鼠源性肝癌细胞系hepa1-6和pd-l1抗体耐药肿瘤的细胞系分别构建皮下移植瘤，进行pd-l1抗体治疗和计算肿瘤体积，用药后小鼠皮下瘤仍能快速生长，说明该小鼠肝癌细胞系具有pd-l1抗体耐药性。
33.本发明提供了肝癌pd-l1抗体获得性耐药小鼠模型的构建方法，使用鼠源性肝癌细胞系hepa1-6及免疫健全鼠c57bl/6小鼠构建鼠源性肝癌模型。具体如下：
34.①
复苏小鼠肝癌细胞株hepal-6细胞后，用含10％胎牛血清的dmem培养基，于37℃，5％c02培养箱中培养。
②
将处于对数生长期的hepal-6细胞按照细胞传代的方法消化并离心，使用无菌pbs重悬肿瘤细胞。对细胞进行计数，将细胞浓度调整至2
×
10^6/100μl。使用胰岛素针注射100μl至小鼠肋腹部皮下，构建小鼠皮下瘤模型。
③
从第7天开始，20只c57bl/6肝癌hepa1-6荷瘤小鼠随机分成两组，10只作为对照组，给予免疫检查点pd-l1抗体同型对照igg；10只给予pd-l1抗体，3天1次，每次200μg。每3天检测肿瘤大小：使用游标卡尺记录肿瘤长径a及短径b，按照体积v＝1/2ab2计算肿瘤体积。
④
用药后经过分析对照组、肿瘤没有缓解以及缓解的小鼠肿瘤生长曲线，当肿瘤体积与对照组相当。推测该小鼠肿瘤可能具有pd-l1抗体耐药潜能。
④
为了验证上述构建的pd-l1抗体耐药肿瘤的确定性及稳定性，取耐药肿瘤的皮下种植瘤，分别构建小鼠皮下瘤和原位移植瘤模型。皮下瘤模型：将小鼠麻醉，肋腹部使用脱毛膏褪毛。将皮下种植瘤取下，并取周围有活力的肿瘤组织，将其剪成2mm立方的组织。无菌锐剪在待传瘤小鼠右腿大腿处剪开3mm长浅口，使用直无齿镊穿1cm长皮下隧道，将2mm3皮下瘤组织推至隧道根部，观察小鼠至复苏；原位移植瘤模型：将小鼠麻醉，上腹部褪毛。将皮下种植瘤取下，并取周围有活力的肿瘤组织，将其剪成1mm3的组织。使用锐剪在待传瘤小鼠上腹部剑突下剪一1cm长切口，剪开并分离腹膜，暴露肝脏。用精细镊在肝左叶包膜下穿1mm左右切口，将1mm3肿瘤组织送至包膜下并使用医用生物胶封闭切口，逐层间断缝合小鼠上腹部切口。
⑤
从第7天开始按照上述
③
方法分别对皮下瘤和移植瘤小鼠给予pd-l1抗体或pd-1抗体及对照igg，并记录肿瘤体积。当pd-l1抗体/pd-1抗体治疗组肿瘤大小与对照组igg相比无差异甚至超过对照组，说明该小鼠肿瘤具有pd-l1抗体耐药性。
35.本发明提供了肝癌pd-l1抗体耐药细胞株res1-6的构建方法。从pd-l1抗体耐药的小鼠肿瘤中提取肿瘤原代细胞并对原代细胞进行传代培养，获取pd-l1抗体耐药肿瘤细胞系。具体如下：
36.①
使用组织消化液从pd-l1抗体耐药的小鼠肿瘤中机械分离肿瘤组织，并置于装有预冷pbs的50ml离心管中称重后使用5x双抗(青霉素链霉素)的pbs洗三遍；将有活力的肿瘤组织剪碎至2-4mm大小，转移至1.5ml无菌ep管中，使用眼科镊将组织剪成糊状，无菌pbs重悬并转移至50ml离心管中；预冷的组织消化液重悬沉淀，并置于c型管中；将c型管置于美天旎gentlemacs机器上，并运行程序m-imptumor02.01；取下c型管，转移至恒温摇床，37℃220转/分条件下摇40分钟；将c型管置于美天旎gentlemacs机器上，并运行程序m-imptumor03.01；400g离心5min，弃上清并加入5ml dmem重悬，70μm滤网过滤，去除未消化组织；400g离心5min，弃上清，加入2ml预冷的红细胞裂解液裂红2min；加入4ml dmem终止裂红，400g离心5min；弃上清，dmem重悬沉淀，30μm滤网过滤获得单细胞悬液。用含10％胎牛血
清的dmem培养基，于37℃，5％c02培养箱中培养。
②
将上述处于对数生长期的pd-l1抗体耐药肿瘤细胞以及对照hepa1-6细胞按照细胞传代的方法消化并离心，使用无菌pbs重悬肿瘤细胞。对细胞进行计数，将细胞浓度调整至2
×
10^6/100μl。使用胰岛素针注射100μl至小鼠肋腹部皮下，构建小鼠皮下瘤模型。
③
从第7天开始，20只c57bl/6pd-l1抗体耐药肝癌细胞系荷瘤小鼠及对照hepa1-6荷瘤小鼠随机分成两组，10只作为对照组，给予免疫检查点pd-l1抗体同型对照igg；10只给予pd-l1抗体，3天1次，每次200μg。每3天检测肿瘤大小：使用游标卡尺记录肿瘤长径a及短径b，按照体积v＝1/2ab2计算肿瘤体积。
④
用药后分别分析不同组的小鼠肿瘤生长曲线，当用药组肿瘤体积与对照igg组相当，说明该小鼠肿瘤细胞具有pd-l1抗体耐药性。
37.本发明所述的耐药细胞株命名为hepa1-6小鼠肝癌细胞res1-6；(apd-l1 resistant hepa1-6，res1-6)。
38.实施例
39.实施例所用的小鼠肝癌细胞系hepa1-6细胞购买自中国科学院上海细胞库；c57bl/6小鼠购买自上海斯莱克实验动物有限公司，5-6周龄，18-20g；实施例所用的pd-l1抗体为市售的bioxcell公司，pd-l1抗体为市售的cst公司的产品。
40.实施例1：hepa1-6细胞的c57bl/6小鼠皮下瘤种植模型
41.将液氮中含有冻存细胞的hepa1-6细胞冻存管取出，套入透明pe手套中迅速置于37℃恒温水浴箱中并震荡，待其溶解后转移至超净工作台内操作。使用1ml移液枪将其转移至15ml离心管中，并加入2ml完全培养基，1000rpm离心3min，吸引器吸走上清，1ml完全培养基重悬细胞并转移至10cm培养皿中，加入7ml完全培养基，“十字法”摇晃使细胞分布均匀后置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。将处于对数生长期的hepa1-6细胞按照细胞传代的方法消化并离心，使用无菌pbs重悬肿瘤细胞；对细胞进行计数，将细胞浓度调整至2
×
10^6/100μl；使用胰岛素针注射100μl至小鼠肋腹部皮下，构建小鼠皮下瘤模型(如图1a)。
42.实施例2：肝癌pd-l1抗体耐药小鼠模型构建
43.肝癌荷瘤小鼠pd-l1抗体给药；从小鼠荷瘤第7天开始，20只c57bl/6pd-l1抗体耐药肝癌细胞系荷瘤小鼠及对照hepa1-6荷瘤小鼠随机分成两组，每组10只作为对照组，给予免疫检查点pd-l1抗体同型对照igg；10只给予pd-l1抗体。3天1次，每次200μg。每3天检测肿瘤大小：使用游标卡尺记录肿瘤长径a及短径b，按照体积v＝1/2ab2计算肿瘤体积(如图1b，1c)。其中，有2只肿瘤增长速度超过对照组肿瘤，最终肿瘤体积在第31天已经与对照组相当(如图1d,1e,1f；p》0.05)。则推测这2只小鼠肿瘤可能具有pd-l1抗体耐药潜能。处死这两只老鼠及对照组老鼠待用。
44.pd-l1抗体耐药效果验证：
45.pd-l1抗体皮下瘤模型耐药效果：
46.将对照组肿瘤及上述两只可能耐药肿瘤分别构建皮下瘤：将小鼠麻醉，肋腹部使用脱毛膏褪毛。将皮下种植瘤取下，并取周围有活力的肿瘤组织，将其剪成2mm立方的组织。无菌锐剪在待传瘤小鼠右腿大腿处剪开3mm长浅口，使用直无齿镊穿1cm长皮下隧道，将2mm3皮下瘤组织推至隧道根部，观察小鼠至复苏。从第7天开始无菌注射器腹腔注射pd-l1抗体/pd-1抗体及对照igg，每次200μg，3天1次，每3天使用游标卡尺记录肿瘤长径a及短径b，按照体积v＝1/2ab2计算肿瘤体积(如图2a)。
47.皮下瘤结果显示：第28天处死老鼠时，与对照组相比，pd-l1抗体耐药肿瘤对免疫检查点抑制剂pd-l1抗体/pd-1抗体治疗不再敏感(图2b,2c；p》0.05)，其肿瘤重量显著超过igg处理的对照组肿瘤(如图2d，p《0.05)。
48.pd-l1抗体原位移植瘤模型耐药效果：
49.将对照组肿瘤及上述可能耐药肿瘤构建小鼠肝癌原位移植瘤：将小鼠麻醉，上腹部褪毛。将皮下种植瘤取下，并取周围有活力的肿瘤组织，将其剪成1mm3的组织。使用锐剪在待传瘤小鼠上腹部剑突下剪一1cm长切口，剪开并分离腹膜，暴露肝脏。用精细镊在肝左叶包膜下穿1mm左右切口，将1mm3肿瘤组织送至包膜下并使用医用生物胶封闭切口，逐层间断缝合小鼠上腹部切口。从第7天开始无菌注射器腹腔注射pd-l1抗体/pd-1抗体及对照igg，每次200μg，3天1次。处死老鼠时，使用游标卡尺记录肿瘤长径a及短径b，按照体积v＝1/2ab2计算肿瘤体积(如图3a，3b)，同时另外两组计算荷瘤小鼠生存期(如图3c，3d)。
50.原位移植瘤结果显示：pd-l1抗体耐药肿瘤对免疫检查点抑制剂pd-l1抗体/pd-1抗体治疗不响应(如图3b)，且pd-l1抗体/pd-1抗体治疗治疗组与pd-l1抗体同型对照igg治疗组生存期无统计学差异(图3d)
51.实施例3：肝癌pd-l1抗体耐药小鼠细胞系构建(目前已保存在中国典型培养物保藏中心cctcc)
52.肝癌pd-l1抗体耐药小鼠原代细胞(res1-6)获取：
53.准备美天旎组织消化液：在超净工作台中，于gentlemacs c型管中加入2.35ml无血清dmem培养基、100μl的酶d、50μl的酶r及12.5μl酶a。机械分离荷瘤小鼠肿瘤组织，并置于装有预冷pbs的50ml离心管中，称重后使用含有5x双抗(青霉素链霉素)的pbs洗三遍。将上述耐药的肿瘤组织剪碎至2-4mm大小，转移至1.5ml无菌ep管中，使用眼科镊将组织剪成糊状，无菌pbs重悬并转移至50ml离心管中，1000rpm离心3min后弃上清，预冷的组织消化液重悬沉淀，并置于c型管中，将c型管置于美天旎gentlemacs机器上，并运行程序m-imptumor02.01，取下c型管，转移至恒温摇床，37℃220转/分条件下摇40分钟，将c型管再置于美天旎gentlemacs机器上，并运行程序m-imptumor03.01，400g离心5min，弃上清并加入5ml dmem重悬，70μm滤网过滤，去除未消化组织，400g离心5min，弃上清，加入2ml预冷的红细胞裂解液裂红2min，加入4ml dmem终止裂红，400g离心5min。弃上清，dmem重悬沉淀，30μm滤网过滤获得单细胞悬液。置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。
54.皮下瘤种植：
55.将处于对数生长期的res1-6细胞及对照hepa1-6细胞按照细胞传代的方法消化并离心，使用无菌pbs重悬肿瘤细胞；对细胞进行计数，将细胞浓度调整至2
×
10^6/100μl；使用胰岛素针注射100μl至小鼠肋腹部皮下。
56.肝癌pd-l1抗体耐药细胞系res1-6的鉴定：
57.从小鼠荷瘤第7天开始无菌注射器腹腔注射pd-l1抗体或对照igg，每次200μg，3天1次。每3天使用游标卡尺记录肿瘤长径a及短径b，按照体积v＝1/2ab2计算肿瘤体积。皮下瘤结果显示：与对照组相比，pd-l1抗体耐药肿瘤对免疫检查点抑制剂pd-l1抗体/pd-1抗体治疗不再敏感(如图4a,4b；p》0.05)，其肿瘤重量显著超过对照组肿瘤(如图4c,4d；p《0.05)。
58.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，
应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。