人源化抗CD137抗体及其用途的制作方法

人源化抗cd137抗体及其用途
1.相关申请
2.本技术要求于2019年5月10日提交的国际专利申请第pct/cn2019/086364号的权益，所述国际专利申请通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.cd137，也称为4-1bb或肿瘤坏死因子受体亚家族9(tnfrsf9)，是肿瘤坏死因子(tnf)受体家族的成员。它由活化的t细胞(cd8

比cd4

更普遍)以及树突细胞、b细胞、滤泡树突细胞、自然杀伤细胞、粒细胞以及炎症部位的血管壁细胞表达。
4.cd137是活化t细胞的共刺激受体，cd137的交联增强t细胞增殖、il-2分泌、存活和细胞溶解活性。cd137还可以诱导外周单核细胞增殖，增强tcr/cd3触发激活诱导的t细胞凋亡，并调节cd28共刺激，从而促进th1细胞反应。它的表达是由淋巴细胞激活诱导的，并且已经发现tnf受体相关因子(traf)衔接蛋白以及cd137配体(cd137l)与受体结合，导致激活nf-κb的信号转导。
5.已经开发了对cd137具有特异性的拮抗和激动抗体。us 6,569,997、us 8,137,667和fisher et al.,cancer immunol immunother(2012)61:1721-1733。已报道，对cd137特异性的激动剂抗体可增强t细胞功能并促进抗肿瘤活性。fisher et al.,cancer immunol immunother(2012)61:1721-1733。另一方面，也已经报道，对cd137特异性的激动剂抗体在患者中引起显著的肝毒性。segal et al.,clin can res.,2017,23:1929-1936。
6.因此，开发用于治疗应用的有效且安全的cd137激动剂具有重要意义。


技术实现要素：

7.本公开至少部分地基于优越人源化抗cd137抗体的开发，其任选地可以是包含对一种或多种fc受体具有修饰的结合活性的fc变体的全长抗体。此类人源化抗cd137抗体已证明具有以下实施例中报道的各种优越特征。
8.因此，本公开的一个方面提供了结合cd137的人源化抗体。此类抗体可包含(i)重链可变结构域(vh)，和(ii)轻链可变结构域(v
l
)。vh包含与参考抗体371相同的重链互补决定区(cdr)1-3，该重链cdr移植在人ighv1-2*2框架中。v
l
包含与参考抗体371相同的轻链cdr 1-3，该轻链cdr移植到人igkv1-39*01框架中。
9.在一些实施方案中，人源化抗-cd137抗体可包括包含氨基酸序列seq id no:12的重链cdr1(hc cdr1)、包含氨基酸序列seq id no:14的hc cdr2、包含氨基酸序列seq id no:16的hc cdr3。替代地或另外地，人源化抗cd137抗体可包括包含氨基酸序列seq id no:29的轻链cdr1(lc cdr1)、包含氨基酸序列seq id no:31的lc cdr2和包含氨基酸序列seq id no:33的lc cdr3。
10.在一些实施方案中，本文公开的人源化抗cd137抗体可包括重链框架区1(hc fr1)，其包含氨基酸序列seq id no:18或其具有不超过三个回复突变的变体；hc fr2，其包含氨基酸序列seq id no:19或其具有不超过三个回复突变的变体；hc fr3，其包含氨基酸
序列seq id no:20或其具有不超过三个回复突变的变体；和/或hc fr4，其包含氨基酸序列seq id no:21或其具有不超过三个回复突变的变体。
11.替代地或另外地，本文公开的人源化抗cd137抗体可包括轻链框架区1(lc fr1)，其包含氨基酸序列seq id no:35或其具有不超过三个回复突变的变体；lc fr2，其包含氨基酸序列seq id no:36或其具有不超过三个回复突变的变体；lc fr3，其包含氨基酸序列seq id no:37或其具有不超过三个回复突变的变体；和/或lc fr4，其包含氨基酸序列seq id no:38或其具有不超过三个回复突变的变体。
12.在一些实例中，人源化抗-cd137抗体可以是在seq id no:4中的位置k42(例如，k42g)、p44(例如，p44v)、f71(例如，f71y)、y87(例如，y87f)和v104(例如，v104l)包含一个或多个回复突变的人源化轻链可变区。在一个实例中，人源化抗体包括包含氨基酸序列seq id no:35的lc fr1、包含氨基酸序列seq id no:36或seq id no:39的lc fr2、包含选自seq id no：37和seq id no：40的序列的lc fr3、和/或包含seq id no：38或seq id no：41的序列的lc fr4。在具体实例中，权利要求4的人源化抗体包括包含seq id no:35的序列的lc fr1、包含seq id no:39的序列的lc fr2、包含seq id no:40的序列的lc fr3、和包含seq id no:38的序列的lc fr4。
13.在一些实例中，本文公开的人源化抗cd137抗体可包括包含seq id no:3、8或9的氨基酸序列的vh；和/或包含seq id no:4、5或10的氨基酸序列的vl。在具体实例中，人源化抗体可包括包含氨基酸序列seq id no:3的vh和包含氨基酸序列seq id no:5的vl。
14.在一些实施方案中，人源化抗体可以是全长抗体(例如，igg分子，例如igg1分子)。或者，人源化抗体可以是其抗原结合片段。在一些实例中，全长抗体可包含野生型fc区。在其他实例中，全长抗体可包含具有修饰的效应子活性的fc变体。一个例子是包含seq id no:42的氨基酸序列的fc区。在具体实例中，本文公开的人源化抗体可包含具有氨基酸序列seq id no:6的重链和/或具有氨基酸序列seq id no:7的轻链。
15.在一些实施方案中，本文公开的人源化抗cd137抗体可以是多特异性抗体的一部分，其进一步结合fcγriib。
16.在另一方面，本文提供了分离的核酸或核酸组，它们共同编码本文公开的任何人源化抗cd137抗体。在一些实施方案中，分离的核酸或核酸组位于一个载体上。在其他实施方案中，该核酸组位于两个载体上。在一些实例中，一个或多个载体是一个或多个表达载体。
17.在又一方面，本文提供包含本文公开的任何分离的核酸或核酸组的宿主细胞。例如，宿主细胞可包含一种或多种用于产生人源化抗cd137抗体的表达载体。
18.此外，本公开的特征在于一种药物组合物，其包含本文公开的任何人源化抗cd137抗体或编码此类抗体的核酸。
19.在另一方面，本公开提供了一种在受试者中调节免疫应答的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的任何药物组合物，所述药物组合物包含也在本文公开的人源化抗cd137抗体。在一些实施方案中，受试者可能正在接受涉及免疫检查点抑制剂的治疗。在其他实施方案中，该方法还可包括向受试者施用免疫检查点抑制剂。示例性检查点抑制剂包括抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体。一个例子是派姆单抗。
20.在一些实施方案中，待治疗的受试者可以是患有、怀疑患有癌症或有患癌症的风
险的人类患者。例子包括前列腺癌、结肠癌或黑色素瘤。在一些实例中，癌症是晚期、转移性或不可切除的恶性肿瘤。在一些实例中，癌症在组织学或细胞学上得到证实。
21.在一些实施方案中，待治疗的受试者可以是患有、怀疑患有免疫病症或有患免疫病症的风险的人类患者。在一些实例中，免疫病症可以是自身免疫疾病。例子包括类风湿性关节炎(ra)、系统性红斑狼疮(sle)、i型糖尿病、多发性硬化症、乳糜泻和移植物抗宿主(gvh)病。
22.在一些实施方案中，受试者(例如，人类患者)已经或正在接受针对癌症或免疫病症的治疗。
23.在一些实施方案中，人源化抗cd137抗体(例如克隆3712-igg1v)可以约0.3至10mg/kg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，每2-4周一次，任选地每三周一次，向受试者施用人源化抗cd137抗体。
24.此外，本文提供了一种产生人源化抗-cd137抗体的方法，包括：(i)在允许表达抗-cd137抗体的条件下培养包含编码本文公开的任何人源化抗-cd137抗体的一个或多个表达载体的本文公开的宿主细胞；和(ii)从细胞培养物中收获由此产生的抗cd137抗体。在一些实施方案中，该方法还可包括从宿主细胞或从培养物上清液中分离抗体。
25.也在本公开的范围内的是如本文公开的用于治疗癌症或免疫病症的如本文公开的人源化抗cd137，以及此类人源化抗cd137抗体用于制造用于治疗癌症或免疫病症的药物的用途。
26.在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。本发明的其它特征或优点将根据以下附图和对若干个实施方案的详细描述并且还根据所附权利要求书变得显而易见。
附图说明
27.以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本公开的某些方面，通过参考附图并结合本文呈现的具体实施方式的详细描述可以更好地理解本公开的某些方面。
28.图1是显示参考抗体371(鼠/人嵌合)及其人源化形式克隆3711和3712与过表达人cd137的cho细胞结合的facs分析的图。将如图所示以最终浓度连续稀释的抗体与cho-人cd137细胞一起温育。y轴上显示的平均荧光强度(mfi)表示抗体结合。
29.图2是描绘参考抗体371与人源化抗体3711和3712抗体在人cd8 t细胞共刺激测定中的比较的条形图。将如图所示最终浓度为10、20和40ng/ml的连续稀释的抗体添加到板中，在其中人类cd8 t细胞与cho-k1-hufcγriib细胞共培养。y轴上显示的ifnγ浓度表示人cd8 t细胞的激活。
30.图3是显示biacore t200上hucd137-c6his与克隆3712结合的线图。将连续稀释的克隆3712(2.5、5、10、20、40、80、160和320nm，一式两份)依次注射到具有固定化人cd137蛋白的流动细胞中，结合时间为180秒；缓冲液流动维持180秒以进行解离。
31.图4a-4b是显示cd137蛋白和人源化抗体3712结合elisa的结果的图。将x轴所示终浓度的连续稀释的克隆3712或阿瓦斯汀(avastin)(阴性对照)添加到包被有重组人(图4a)或食蟹猴(图4b)cd137蛋白的板中。y轴上显示的吸光度表示抗体结合。
32.图5a-5c是描绘克隆3712和细胞cd137结合facs的图。如x轴所示终浓度的连续稀释的克隆3712或阿瓦斯汀与cho-人cd137(图5a)、cho-食蟹猴cd137(图5b)或亲本cho(图5c)细胞一起温育。y轴上显示的平均荧光强度(mfi)表示抗体结合。
33.图6a-6b是描绘克隆3712通过facs与活化的cd8 t细胞上的内源性cd137结合的图。如x轴所示终浓度的连续稀释的克隆3712或阿瓦斯汀与被抗cd3抗体预激活的人(图6a)或食蟹猴(图6b)pbmc一起温育。y轴上显示的cd8 t细胞的平均荧光强度(mfi)表示抗体结合。
34.图7a-7e是显示克隆3712与过表达人fcγ受体的cho细胞结合的facs分析的图。如x轴所示终浓度的连续稀释的克隆3712或阿瓦斯汀(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563、0.078、0.039、0.0195、0.0098、0.0049、0.0024、0.0012和0.0006μg/ml)与cho-hufcγ受体细胞：cho-hufcγria(图7a)、cho-hufcγriia-r131(图7b)、cho-hufcγriia-h131(图7c)、cho-hufcγiib(图7d)和cho-hufcγiiia(图7e)一起温育。y轴上显示的平均荧光强度(mfi)表示抗体结合。
35.图8a-8b是显示通过elisa测量的克隆3712与fcrn(图8a)和c1q(图8b)的结合的图。在图8a中，将终浓度为10000、5000、2500、1250、625、312.5和156.3ng/ml的fcrn(如x轴所示)加入到用克隆3712或阿瓦斯汀包被的板中。与包被抗体结合的fcrn通过抗his tag-hrp抗体检测。在图8b中，将浓度为0.125、0.25、0.5、1、2、4和8μg/ml(如x轴所示)的克隆3712或阿瓦斯汀包被在elisa板上，并将2mg/ml的c1q添加到板。通过抗人c1q-hrp抗体检测与抗体结合的c1q。
36.图9是显示cd137报告基因活性测定结果的图。将如x轴所示终浓度为25000、6250、1562.5、390.6、97.7、24.4、6.10、1.53、0.381、0.095和0.024ng/ml的连续稀释的克隆3712或阿瓦斯汀添加板中，在其中cd137报告基因细胞与cho-k1-hufcγriib、cho-k1或不含细胞的培养基共培养。y轴上显示的il-8浓度表示cd137报告基因细胞的激活。
37.图10是显示人cd8 t细胞共刺激测定的结果的图。将如x轴所示终浓度为25000、6250、1562.5、390.6、97.7、24.4、6.10、1.53、0.381和0.095ng/ml的连续稀释的克隆3712或阿瓦斯汀添加板中，在其中人cd8 t细胞与cho-k1-hufcγriib、cho-k1或培养基共培养。y轴上显示的ifnγ浓度表示人cd8 t细胞的激活。
38.图11是显示克隆3712在小鼠中的药代动力学的图。描绘了雄性c57bl/6小鼠静脉给药3mg/kg剂量后克隆3712的个体血浆浓度-时间曲线。
39.图12a-12b是显示小鼠肿瘤模型中各组的肿瘤生长曲线的图。在第0天将鼠结肠癌mc38细胞皮下植入到纯合子b-h4-1bb小鼠中。在第7天将具有已建立肿瘤的小鼠分为对照组和治疗组(n＝6)，并且如图所示通过腹膜内注射进行治疗。每周2次通过口径测量肿瘤大小，并且使用0.5
×
长度
×
宽度2的公式计算为肿瘤体积。肿瘤大小的平均值
±
sem显示在图12a中而图12b显示了个体小鼠数据。
40.图13a-13b是显示不同组中肿瘤生长曲线的图。在第0天将鼠结肠癌mc38细胞皮下植入到纯合子b-h4-1bb小鼠中。在第7天将具有已建立肿瘤的小鼠分为对照组和治疗组(n＝6)，并且如图所示通过腹膜内注射进行治疗。图13a将用克隆3712与用文献中报道的两种参考抗体的治疗进行比较。图13b显示了克隆3712的给药效果。每周2次通过口径测量肿瘤大小，并且使用0.5
×
长度
×
宽度2的公式计算为肿瘤体积。示出了肿瘤大小的平均值
±
sem。在prism中使用多重t检验比较平均值。在13a和图13b中当与克隆3712 10mg/kg组相比时，分别用*和**表示统计学显著差异p《0.05和p《0.01。
41.图14是显示克隆3712与抗pd-1抗体在鼠肿瘤模型中的组合功效的图。在第0天，将鼠黑色素瘤b16-ova细胞皮下植入在致命辐射后移植了hpd-1/4-1bb小鼠供体骨髓细胞的wt b6小鼠中。沿3个正交轴(a、b和c)测量肿瘤体积并计算为肿瘤体积＝abc/2。肿瘤形成后(第14天)，将小鼠分为对照组和治疗组(n＝5)，治疗组是在第14、21和28天用100μg抗pd-1抗体，或在第14天通过腹膜内注射施用100μg抗cd137克隆3712，或以单一药剂的相同给药方案联合治疗进行治疗。每周测量两次肿瘤生长。通过将肿瘤大小除以在第14天的初始肿瘤大小来计算相对肿瘤大小。示出了肿瘤大小的平均值
±
sem。在prism中使用多重t检验比较平均值。与单一药剂组相比时，用*表示统计学显著差异p《0.05。
42.图15是显示不同浓度所示人源化抗体的t细胞刺激活性的图。
43.图16a-16d包括显示克隆3712与各种嵌合cd137受体蛋白结合的图。图16a和图16c：相对于人cd137，克隆3712与cd137受体蛋白ly048、ly049和ly050的结合。图16b和图16d：相对于人cd137，克隆3712与cd137受体蛋白ly051、ly052和ly110的结合。
44.图17是显示各种抗cd137抗体与cd137受体结合的图。
45.图18是显示克隆3712-igg1v抑制肿瘤生长的图。
具体实施方式
46.本文提供了能够结合cd137和fcγriib(例如，通过合适的fc部分)并在fcγriib存在下增强由cd137介导的信号传导的人源化激动性抗体。此类抗cd137抗体可源自参考抗cd137抗体克隆371(小鼠亲本)，其在本文中公开。如以下实施例所示，本文公开的人源化抗cd137抗体显示出与亲本克隆相似或优越的生物活性。例如，人源化抗cd137抗体克隆3712(例如，以igg1形式，其可包含igg fc变体)具有可比的cd137结合亲和力、与fcγriib的选择性结合以及优于亲本抗体的t细胞刺激活性，并显示出优越的对已知抗cd137抗体的抗肿瘤活性。正如在动物模型中所研究的，人源化抗体是安全的。预期人源化抗体在人类中显示出安全性。此外，本文所述的人源化抗cd137抗体可与抗pd-1和其他免疫疗法以及癌症疫苗、细胞疗法和/或其他肿瘤学治疗方法组合具有协同活性。
47.cd137(也称为4-1bb或tnfrsf9)是肿瘤坏死因子(tnf)受体家族的成员。它由活化的t细胞(cd8

比cd4

更占主要(gramaglia et al.,eur.j.immunol.,30(2):392-402(2000))以及树突细胞、b细胞、滤泡树突细胞、自然杀伤细胞、粒细胞和炎症部位的血管壁细胞表达。已显示树突细胞上的cd137表达导致il-6和il-12的分泌，以及dc刺激t细胞对同种抗原的反应以及浸润肿瘤的能力增加(pan et al.,j.immunol.,172(8):4779-89(2004))。活化的自然杀伤细胞在用细胞因子刺激后表达cd137，促进自然杀伤细胞的增殖和ifn-γ分泌而不影响细胞溶解活性(wilcox et al.,j.immunol.,169(8):4230-6(2002))。
48.因此，本文描述了人源化抗cd137抗体(例如激动性抗cd137抗体)、编码此类抗体的核酸、包含该抗体或编码核酸的药物组合物，以及此类抗体在治疗应用中的用途。
49.结合cd137的人源化抗体
50.本公开提供了结合cd137，特别是人和/或猴cd137的人源化抗体。此类抗体可以是
激动性抗体，其在与cd137结合后引发由cd137介导的细胞信号传导。
51.抗体(以复数形式可互换地使用)是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点来与靶标例如糖类、多核苷酸、脂质、多肽等特异性结合的免疫球蛋白分子。如本文所使用的，术语“抗体”不但涵盖完整(即，全长)多克隆或单克隆抗体，而且涵盖其抗原结合片段(如fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链(scfv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、纳米抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及包括所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型，所述经修饰构型包含抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和经共价修饰抗体。抗体包含任何类的抗体，如igd、ige、igg、iga或igm(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定类。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同类。存在五大类免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些类中的若干类可以进一步分为亚类(同种型)，例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
52.典型的抗体分子包括重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)，它们通常参与抗原结合。vh和v
l
区可以进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“cdr”)，其散布有更保守的被称为“框架区”(“fr”)的区。每个vh和v
l
通常由按以下顺序从氨基端到羧基端布置的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。框架区和cdr的范围可以使用本领域已知的方法，例如通过kabat定义、chothia定义、abm定义和/或接触定义来精确地鉴定，所有所述定义均是本领域熟知的。参见例如，kabat,e.a.等人,(1991)《免疫学上关注的蛋白质的序列(sequences of proteins of immunological interest)》,第五版,美国卫生与公众服务部(u.s.department of health and human services),nih公开号91-3242；chothia等人,(1989)《自然(nature)》342:877；chothia,c.等人(1987),《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》196:901-917；al-lazikani等人,(1997)《分子生物学杂志(j.molec.biol.)》273:927-948；和almagro,《分子识别杂志(j.mol.recognit.)》17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。
53.人源化抗体是指为特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的抗原结合片段的非人(例如，鼠)抗体的形式。通常，人源化抗体是来自接受者的cdr的残基被来自如小鼠、大鼠或兔等具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)的cdr的残基替代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包括既未在接受者抗体中发现也未在导入的cdr或框架序列中发现但被包含在内以进一步精化和优化抗体性能的残基。通常，人源化抗体将包括至少一个并且通常两个可变结构域中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些区，并且所有或基本上所有fr区是人免疫球蛋白共有序列的那些区。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区或结构域(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区或结构域的至少一部分。抗体可以具有如wo 99/58572中所描述的修饰的fc区。其它形式的人源化抗体具有关于原始抗体改变的一个或多个cdr(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，也称为“源自”来自原始抗体的一个或多个cdr的一个或多个cdr。人源化抗体还可以涉及亲和力成熟。
54.用于构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见例如queen等人,《美国国家
科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》,86:10029-10033(1989)。在一个实例中，按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的vh和v
l
可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来鉴定被预测对形成正确cdr结构具有重要性的框架氨基酸残基。平行地，使用亲本vh和v
l
序列作为搜索查询来从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人vh链和人v
l
链。然后选择人vh受体基因和人v
l
受体基因。
55.可以用来自亲本非人抗体或其功能变体的cdr区替代所选人受体基因内的cdr区。在必要时，可以使用在亲本链的框架区内被预测在与cdr区相互作用时具有重要性的残基来取代人受体基因中的对应残基。
56.在一些实施方案中，本文所述的抗cd137抗体对靶抗原(例如，cd137)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所使用的，“结合亲和力”是指表观缔合常数或ka。ka是解离常数(kd)的倒数。本文所述的抗cd137抗体对于靶抗原或抗原表位的结合亲和力(kd)可以为至少10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
、10-10
m或更低。增大的结合亲和力对应于减小的kd。抗体相对于第二抗原对第一抗原的更高亲和力结合可以通过比用于结合第二抗原的ka(或数值kd)更高的用于结合第一抗原的ka(或更小的数值kd)来指示。在这种情况下，所述抗体相对于第二抗原(例如，第二构象或其模拟物中的相同的第一蛋白质；或第二蛋白质)对第一抗原(例如，第一构象或其模拟物中的第一蛋白质)具有特异性。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其它比较)可以为至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、37.5倍、50倍、70倍、80倍、91倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或105倍。在一些实施方案中，任何抗cd137抗体可以进一步亲和力成熟以增加抗体对靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。
57.可以通过各种方法来确定结合亲和力(或结合特异性)，包含平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、elisa、表面等离子共振或光谱学(例如，使用荧光测定)。用于评估结合亲和力的示例性条件为处于hbs-p缓冲液(10mm hepes ph7.4，150mm nacl，0.005％(v/v)表面活性剂p20)中。这些技术可以用于根据靶蛋白浓度测量结合的结合蛋白的浓度。结合的结合蛋白的浓度([结合(bound)])通常通过以下等式与游离靶蛋白([游离(free)])的浓度相关：
[0058]
[结合]＝[游离]/(kd [游离])
[0059]
然而，并不总是需要对ka进行精确测定，因为有时例如通过功能性测定，例如体外或体内测定中的活性足以获得对亲和力的定量测量、获得对亲和力的定性测量或者获得对亲和力的推断，所述亲和力例如是使用如elisa或facs分析等方法确定的、与ka成正比并且因此可以用于比较，如确定更高的亲和力是否例如高2倍。
[0060]
本文所述的人源化抗cd137抗体可源自抗体克隆371，其vh和v
l
序列在下文中提供，其中cdr是黑体字(由kabat编号确定)。参考抗体371的更多信息可在wo2019/113039中找到，其相关公开内容以引用方式并入本文以用于本文提及的目的或主题。
[0061]
》lyv371_vh(seq id no:1)
[0062][0063]
》lyv371_vl(seq id no:2)
[0064][0065]
源自参考抗体371的人源化抗cd137抗体可包含基本相似的重链和轻链互补区
(cdr)，其可分别移植到合适的人vh框架和合适的v
l
框架中。相对于参考抗体中的相应cdr具有“基本相似”的重链cdr或轻链cdr的抗体是指相对于参考抗体中总体的相应cdr，抗体中的重链或轻链cdr总体包含少于10个氨基酸残基变异(例如，少于9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)。例如，人源化抗体可以在总重链和/或轻链cdr区仅包括至多8个(例如，8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸残基变异，并且以与参考抗体基本上类似的亲和力与cd137的相同表位(例如，具有相同顺序的kd值)结合。
[0066]
在一些情况下，本文公开的人源化抗体可具有与参考抗体371相同的重链cdr3，并且任选地具有与参考抗体相同的轻链cdr3。替代地或另外地，人源化抗体可具有与参考抗体相同的重链cdr1和/或cdr2，并且任选地具有与参考抗体相同的轻链cdr1和/或cdr2。
[0067]
氨基酸残基变异可以是保守的氨基酸残基取代。如本文所使用的，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特性的氨基酸取代。可以根据用于改变本领域的普通技术人员已知的多肽序列的方法来制备变体，所述方法如编制这种方法的参考文献中发现的，所述参考文献例如，《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》,j.sambrook等人编辑,第二版,冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press),冷泉港,纽约,1989或《分子生物学实验室指南(current protocols in molecular biology)》,f.m.ausubel等人编辑,约翰威利父子出版公司(john wiley&sons,inc.),纽约。氨基酸的保守取代包含在以下组中的氨基酸之间进行的取代：(a)m、i、l、v；(b)f、y、w；(c)k、r、h；(d)a、g；(e)s、t；(f)q、n；以及(g)e、d。
[0068]
在一些实施方案中，本文公开的人源化抗cd137抗体包含与参考抗体371相同的重链和轻链cdr。具有相同vh和/或v
l
cdr的两种抗体意味着当通过相同方法(例如，本领域已知的kabat方法、chothia方法、abm方法、contact方法或imgt方法)确定时它们的cdr相同。参见，例如，bioinf.org.uk/abs/)。
[0069]
在一些实施方案中，本文公开的人源化抗cd137抗体包含源自亲本抗体371(基本相似或相同)的重链和轻链cdr，其可移植到合适的受体人vh基因和v
l
基因的框架中。在一些实例中，受体人vh基因可以是igh1-2*02。替代地或另外地，受体人v
l
基因可以是vκ基因，其可以是igkv1-39*01。
[0070]
在一些实施方案中，可以将来自克隆371的重链和轻链cdr移植到合适的受体vh和v
l
基因的框架中，而不将进一步的突变引入框架区。在其他实施方案中，可以将一个或多个回复突变引入框架区以增强结合活性、稳定性和/或其他优选性质。如本文所用，“回复突变”是指将人受体vh或v
l
框架中特定位置处的氨基酸残基转化回小鼠亲本抗体框架中相应位置处的氨基酸残基。
[0071]
下面提供了源自参考抗体371的示例性人源化vh和vl链(遵循kabat编号方案的cdr为粗体，回复突变为粗体和下划线)：
[0072]
》lyv371_vh-1(seq id no:3)
[0073][0074]
》lyv371_vh-2(seq id no:8)
[0075]
[0076]
》lyv371_vh-3(seq id no:9)
[0077][0078]
》lyv371_vl-1(seq id no:4)
[0079][0080]
》lyv371_vl-2(seq id no:5)
[0081][0082]
》lyv371_vl-3(seq id no:10)
[0083][0084]
下面的表1和2提供了亲本抗体的重链和轻链框架区(fr)和cdr序列以及源自其的示例性人源化vh和v
l
链：
[0085]
表1：重链fr和cdr
[0086][0087]
表2：轻链fr和cdr
[0088][0089][0090]
在一些实施方案中，本文公开的人源化抗cd137抗体包括包含seq id no:12的序列的重链cdr1(hc cdr1)、包含seq id no:14的序列的hc cdr2、包含seq id no:16的序列的hc cdr3，和/或包含seq id no:29的序列的轻链cdr1(lc cdr1)、包含seq id no:31的序列的lc cdr2和包含seq id no:33的序列的lc cdr3。
[0091]
在一些实施方案中，本文公开的人源化抗cd137抗体可进一步包含与lyv371_vh-1(例如，seq id no：18)相同的重链框架区1(hc fr1)或其具有不超过一个、两个或三个回复突变的变体。替代地或另外地，人源化抗cd137抗体还可包含与lyv371_vh-1(例如，seq id no：19)相同的hc fr2或其具有不超过一个、两个或三个回复突变的变体。替代地或另外地，人源化抗cd137抗体还可包含与lyv371_vh-1(例如，seq id no：20)相同的hc fr3或其具有不超过一个、两个或三个回复突变的变体。替代地或另外地，人源化抗cd137抗体可包含与lyv371_vh-1(例如，seq id no：21)相同的hc fr4或其具有不超过一个、两个或三个回复突变的变体。示例性回复突变可以发生在以下位置中的一个或多个：fr1中的k12(例如，k12v)、v20(例如，v20l)，fr2中的v37(例如，v37i)、e46(例如，e46g)和w48(例如，w48i)，fr3中的v68(例如v68a)、m70(例如，m70l)、r72(例如，r72a)和a97(例如，a97t)。
[0092]
在一些实施方案中，本文公开的人源化抗cd137抗体包含：(i)seq id no:18、seq id no:22或seq id no:25的hc fr1；(ii)seq id no:19、seq id no:23或seq id no:26的hc fr2，(iii)seq id no:20、seq id no:24或seq id no:27的hc fr3；和/或(iv)seq id no:21的hc fr4。在一些实例中，人源化抗cd137抗体具有与表1中所示的vh-1、vh-2或vh-3相同的重链fr1、fr2、fr3和fr4。
[0093]
在一些实施方案中，本文公开的人源化抗cd137抗体可进一步包含轻链框架区1
(lc fr1)，如lyv371_vl-1(例如，seq id no：35)或其具有不超过一个、两个或三回突变的变体。替代地或另外地，本文公开的人源化抗cd137抗体还可包含与c lyv371_vl-1(例如，seq id no：36)相同的lc fr2或其具有不超过一个、两个或三个回复突变的变体。替代地或另外地，人源化抗cd137抗体还可包含与lyv371_vl-1(例如，seq id no：37)相同的lc fr3或其具有不超过一个、两个或三个回复突变的变体。替代地或另外地，人源化抗cd137抗体还可包含与lyv371_vl-1(例如，seq id no：338)相同的lc fr4或其具有不超过一个、两个或三个回复突变的变体。
[0094]
在一些实施方案中，本文公开的人源化抗cd137抗体包含人源化轻链可变区，其在以下的一个或多个位置包含一个或多个(例如1、2、3或4个)回复突变)：fr2中的k42(例如，k42g)和p44(例如，p44v)，fr3中的f71(例如，f71y)和y87(例如，y87f)，以及fr4中的v104(例如，v104l)。
[0095]
在一些实施方案中，本文公开的人源化抗cd137抗体进一步包含：(i)包含seq id no:35的序列的lc fr1，(ii)包含seq id no:36或seq id no:39的序列的lc fr2,(iii)包含seq id no:37或seq id no:40的序列的lc fr3，和/或(iv)包含seq id no:41的序列的lc fr4。在一些实例中，人源化抗cd137抗体包含与表2中所示的vl-1、vl-2或vl-3相同的lc fr1、lc fr2、lc fr3和lc fr4。
[0096]
在具体实例中，本文公开的人源化抗cd137抗体包括包含氨基酸序列seq id no:3、seq id no:8或seq id no:9的vh链。替代地或另外地，本文公开的人源化抗cd137抗体包括包含氨基酸序列seq id no:4、seq id no:5或seq id no:10的vl链。本文提供的示例性人源化抗cd137抗体包括克隆3711、3712、3713、3714、3715、3716、3717、3718和3719。这些示例性人源化抗cd137抗体的vh和vl成分参见下表3。此类示例性抗体可以是本文公开的任何抗体形式，例如单链抗体、fab片段或全长抗体。
[0097]
在一些实施方案中，如本文所述的任何抗cd137抗体的重链还可包含重链恒定区(ch)或其部分(例如，ch1、ch2、ch3或其组合)。本文所述抗体的重链恒定区可包含单个结构域(例如，ch1、ch2或ch3)或任何单个结构域的组合。
[0098]
在一个具体实例中，重链恒定区来自如本文所述的任何igg亚家族的人igg(γ重链)。在一个实例中，恒定区来自人ig分子，例如igg1。本文公开的任何人源化抗cd137抗体的fc区可以是野生型fc结构域。或者，fc结构域可以是包含一个或多个相对于野生型对应物的突变以调节一种或多种效应子活性的fc变体。例如，它可以包含免疫学惰性的修饰恒定区，例如，不触发补体介导的裂解，或不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。adcc活性可以使用美国专利5,500,362中公开的方法进行评估。在其他实施方案中，如在eur.j.immunol.(1999)29:2613-2624；pct申请pct/gb99/01441；和/或uk专利申请9809951.8中所述修饰恒定区。在一些实施方案中，与野生型对应物相比，本文所述的抗cd137抗体可包含突变的fc区，使得该抗体对fc受体例如fcγriib(cd32b)具有更高的结合亲和力。此类抗体可与fcγriib表达细胞有效接合，从而提高治疗效果。在其他实施方案中，与野生型对应物相比，本文所述的抗cd137抗体可包含突变的fc区，使得该抗体对fc受体例如fcγriib(cd32b)具有选择性的结合亲和力。此类抗体可与fcγriib表达细胞选择性地和有效地接合，从而提高治疗效果。
[0099]
用于制备人源化抗-cd137抗体的fc变体可以在例如wo2018/183520中找到，其相
关公开内容通过引用并入本文以用于本文引用的主题。在某些情况下，fc变体可在第228位(eu编号)处包含s/p取代。在一个实例中，本文公开的人源化抗cd137抗体可包括包含以下氨基酸序列的fc结构域，其提供如下(seq id no:42)：
[0100]
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellgpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvehedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0101]
本文所述的任何抗cd137抗体可包括进一步包含轻链恒定区的轻链，其可为本领域已知的任何cl。在一些实例中，cl是κ轻链。
[0102]
抗体重链和轻链恒定区是本领域熟知的，例如，在imgt数据库(imgt.org)或vbase2.org/vbstat.php.中提供的那些，两者均通过引用并入本文。
[0103]
下面提供了一种示例性全长人源化抗cd137抗体克隆3712(igg1v/κ)的氨基酸序列：
[0104]
克隆3712-igg1v的重链
[0105][0106]
克隆3712-igg1v的轻链
[0107][0108]
在一些实施方案中，抗cd137抗体是能够结合cd137和fcγriib二者的双特异性抗体(不通过fc-fcr相互作用)。此类双特异性抗体可包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其各自可包含vh/v
l
对。第一抗原结合区结合cd137而第二抗原结合区结合fcγriib。
[0109]
在一些实施方案中，抗cd137抗体是能够结合cd137和一种或多种其他感兴趣抗原的双特异性或多特异性(例如，三特异性)抗体。此类双特异性或多特异性抗体可包含第一抗原结合区、第二抗原结合区和任选的第三抗原结合区，其中每一个可包含vh/v
l
对。第一抗原结合区结合cd137，而第二抗原结合区结合另一个感兴趣的抗原。
[0110]
人源化抗cd137抗体的制备
[0111]
用于构建人源化抗体的方法是本领域熟知的。参见例如queen et al.,proc.natl.acad.sci.usa,86:10029-10033(1989)。在一个实例中，按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的vh和v
l
可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来鉴定被预测对形成正确cdr结构具有重要性的框架氨基酸残基。平行地，使用亲本vh和v
l
序列作为搜索查询来从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同
源的氨基酸序列的人vh链和人v
l
链。然后选择人vh受体基因和人v
l
受体基因。
[0112]
可以用来自亲本非人抗体或其功能变体的cdr区替代所选人受体基因内的cdr区。在必要时，可以使用在亲本链的框架区内被预测在与cdr区相互作用时具有重要性的残基(参见以上描述)来取代人受体基因中的对应残基。
[0113]
在一些实例中，如本文所公开的人源化抗cd137抗体可以通过如下例示的重组技术来制备。
[0114]
可以将对本文所述的抗cd137抗体的重链和轻链进行编码的核酸克隆到一个表达载体中，每个核苷酸序列与合适的启动子可操作地连接。在一个实例中，对重链和轻链进行编码的核苷酸序列中的每个核苷酸序列与不同的启动子可操作地连接。可替代地，对重链和轻链进行编码的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链和轻链两者均从同一启动子表达。在必要时，可以在对重链和轻链进行编码的序列之间插入内部核糖体进入位点(ires)。
[0115]
在一些实例中，将对抗体的两条链进行编码的核苷酸序列克隆到两个载体中，所述载体可以被引入到相同或不同的细胞中。当在不同的细胞中表达这两条链时，其中的每条链均可以从表达这种链的宿主细胞中分离，并且分离的重链和轻链可以混合并在允许形成抗体的合适条件下温育。
[0116]
通常，可以使用本领域已知的方法将对抗体的一条或所有链进行编码的核酸序列克隆到合适的表达载体中、与合适的启动子可操作地连接。例如，可以在合适条件下使核苷酸序列和载体与限制酶相接触，以在每个分子上产生可以彼此配对并且用连接酶连接在一起的互补端。可替代地，可以将合成核酸连接子与基因的末端连接。这些合成连接子含有对应于载体中的特定限制性位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
[0117]
可以使用各种启动子来表达本文所述的抗体，所述启动子包含但不限于巨细胞病毒(cmv)中间早期启动子、如劳斯肉瘤(rous sarcoma)病毒ltr、hiv-ltr、htlv-1ltr等病毒ltr、猿猴病毒40(sv40)早期启动子、大肠杆菌(e.coli)lac uv5启动子和单纯性疱疹tk病毒启动子。
[0118]
还可以使用可调节的启动子。这些可调节的启动子包含使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节剂对携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录进行调节的那些启动子[brown,m.等人,《细胞(cell)》,49:603-612(1987)]、使用四环素阻遏物(tetr)的那些启动子[gossen,m.和bujard,h.,《美国国家科学院院刊》89:5547-5551(1992)；yao,f.等人,《人类基因疗法(human gene therapy)》,9:1939-1950(1998)；shockelt,p.等人,《美国国家科学院院刊》,92:6522-6526(1995)]。其它系统包含fk506二聚体、使用雌二醇(astradiol)的vp16或p65、ru486、二元酚米乐甾酮(diphenol murislerone)或雷帕霉素(rapamycin)。诱导型系统可从英杰公司(invitrogen)、克隆技术公司(clontech)和阿瑞雅德公司(ariad)获得。
[0119]
可以使用包含具有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施方案中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可以用作转录调节剂对携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录进行调节[m.brown等人，《细胞》49:603-612(1987)；gossen和bujard(1992)；m.gossen等人,《美国国家科学院院刊》,89:5547-5551(1992)]，所述携带有lac操纵基因的哺乳动物
细胞启动子将四环素阻遏物(tetr)与转录激活子(vp 16)组合，以产生tetr-哺乳动物细胞转录激活子融合蛋白tta(tetr-vp 16)，携带有teto的哺乳动物启动子源自人巨细胞病毒(hcmv)主要立即早期启动子以用于产生tetr-tet操纵基因系统来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施方案中，使用四环素诱导型开关。当四环素操纵基因适当地定位在cmvie启动子的tata元件下游时，四环素阻遏物(tetr)而非tetr-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物可以单独用作强效反式调节剂来调节哺乳动物细胞中的基因表达(yao等人,《人类基因疗法》10(16):1392-1399(2003))。这个四环素诱导型开关的一个特别的优点是其不需要使用四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白来实现其可调节作用，在一些情况下，所述四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白可能对细胞有毒(gossen等人,《美国国家科学院院刊》,89:5547-5551(1992)；shockett等人,《美国国家科学院院刊》,92:6522-6526(1995))。
[0120]
另外，载体可以含有例如以下中的一些或全部：可选标志基因，如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人cmv的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mrna稳定性的来自sv40的转录终止和rna加工信号；用于适当的游离型复制的sv40多瘤复制起点和cole1；内部核糖体结合位点(ires)、通用多克隆位点；以及用于正义和反义rna的体外转录的t7和sp6 rna启动子。用于产生含有转基因的载体的合适的载体和方法是本领域熟知并且可获得的。
[0121]
可用于实践本文所述的方法的聚腺苷酸化信号的实例包含但不限于人胶原i聚腺苷酸化信号、人胶原ii聚腺苷酸化信号和sv40聚腺苷酸化信号。
[0122]
可以将包括对抗体中的任何抗体进行编码的核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)引入到合适的宿主细胞中以用于产生抗体。可以在合适的条件下培养宿主细胞以用于表达抗体或其任何多肽链。可以通过常规方法，例如亲和力纯化通过培养的细胞(例如，来自细胞或培养上清液)来回收这种抗体或其多肽链。如果有必要，可以在合适的条件下在允许产生抗体的合适时间段内温育抗体的多肽链。
[0123]
在一些实施方案中，用于制备本文所述的抗体的方法涉及对也如本文所述的抗cd137抗体的重链和轻链进行编码的重组表达载体。可以通过常规方法，例如磷酸钙介导的转染将重组表达载体引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-cho细胞)中。可以选择并在允许表达形成抗体的这两条多肽链的合适条件下培养阳性转化体宿主细胞，这两条多肽链可以从细胞或从培养基中回收。在必要时，可以在允许形成抗体的合适条件下培育从宿主细胞中回收的这两条链。
[0124]
在一个实例中，提供了两种重组表达载体，一种重组表达载体对抗cd137抗体的重链进行编码并且另一种重组表达载体对抗cd137抗体的轻链进行编码。可以通过常规方法，例如磷酸钙介导的转染将这两种重组表达载体都引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-cho细胞)中。可替代地，可以将表达载体中的每种表达载体均引入到合适的宿主细胞中。可以选择并在允许表达抗体的多肽链的合适条件下培养阳性转化体。在将这两种表达载体引入到相同的宿主细胞中时，可以从宿主细胞或从培养基中回收其中产生的抗体。如果有必要，可以从宿主细胞或从培养基中回收多肽链，并且然后在允许形成抗体的合适条件下温育多肽链。当将这两种表达载体引入到不同的宿主细胞中时，所述两种表达载体中的每种表达载体可以从对应的宿主细胞或从对应的培养基中回收。然后可以在合适的条件下温育这两
条多肽链以用于形成抗体。
[0125]
使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。例如，可以用蛋白质a或蛋白质g偶联基质通过亲和色谱法来分离一些抗体。
[0126]
编码如本文所述的抗cd137抗体的重链、轻链或两者的任何核酸；包含其的载体(例如，表达载体)；和包含载体的宿主细胞在本公开的范围内。
[0127]
可以使用本领域已知的方法表征由此制备的抗cd137抗体，由此检测和/或测量cd137生物活性的增加。例如，elisa型测定可适用于cd137促进t细胞增殖的定性或定量测量。
[0128]
治疗方法
[0129]
本公开提供了通过施用治疗有效量的抗cd137抗体来治疗疾病例如癌症或免疫紊乱如自身免疫疾病的方法。在一些情况下，本文公开的任何人源化抗cd137抗体可以与免疫检查点抑制剂例如抗pd-1抗体共同使用。在一个实例中，抗pd-1抗体可以是在wo2017087599中公开的抗pd-1抗体ssi-361，其相关公开内容通过引用并入用于本文提及的主题和目的，纳武单抗帕博利珠单抗(pembrolizumab)阿维鲁单抗(avelumab)德瓦鲁单抗(durvalumab)或阿特珠单抗(atezolizumab)特别地，抗pd-1抗体可以是帕博利珠单抗。
[0130]
药物组合物
[0131]
可以将本文所述的抗体以及编码核酸或核酸组、包含其的载体或包含载体的宿主细胞与药学上可接受的载体(赋形剂)混合以形成用于治疗目标疾病的药物组合物。“可接受的”意指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载体)包含缓冲液，所述缓冲液是本领域熟知的。参见例如，《雷明顿：药学科学与实践(remington:the science and practice of pharmacy)》第20版,(2000),利平科特
·
威廉姆斯&威尔金斯公司(lippincott williams and wilkins),k.e.hoover编辑。
[0132]
用于本发明方法的药物组合物可以包括冻干调配物或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。(《雷明顿：药学科学与实践》第20版,(2000),利平科特
·
威廉姆斯&威尔金斯公司,k.e.hoover编辑)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如edta；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0133]
在一些实例中，本文所述的药物组合物包括含有抗体(或编码核酸)的脂质体，所
述脂质体可以通过本领域已知的方法制备，如以下文献中所描述的方法：epstein等人,《美国国家科学院院刊》82:3688(1985)；hwang等人,《美国国家科学院院刊》77:4030(1980)；以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号。美国专利第5,013,556号中公开了具有增强的循环时间的脂质体。可以用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生化磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂质组合物来通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。通过具有限定孔径的过滤器将脂质体挤出以产生具有期望直径的脂质体。
[0134]
还可以将抗体或一种或多种编码核酸包埋在例如通过凝聚法技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中。这些技术都是本领域已知的，参见例如，《雷明顿：药学科学与实践》第20版,马克出版公司(mack publishing)(2000)。
[0135]
在其它实例中，可以以缓释型格式调配本文所述的药物组合物。缓释型制剂的合适的实例包含含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品，例如薄膜或微胶囊的形式。缓释型基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、l-谷氨酸和l-谷氨酸-7-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、如lupron depot
tm
(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)等可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。
[0136]
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这通过例如无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常将治疗性抗体组合物放置在具有无菌进口端的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶中。
[0137]
本文所述的药物组合物可以采用单位剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液或悬浮液或栓剂，以用于口服、肠胃外或直肠施用或者通过吸入或吹入施用。
[0138]
为了制备如片剂等固体组合物，可以将主要活性成分与药物载体例如常规压片成分(如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和如水等其它药物稀释剂混合，以形成含有本发明的化合物的均相混合物固体预调配组合物或无毒的其药学上可接受的盐。在称这些预调配组合物均相时，这意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成等效单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将这个固体预调配组合物细分成上述类型的单位剂型，所述单位剂型含有0.1至约500mg本发明的活性成分。可以包覆或以其它方式配混新组合物的片剂或丸剂以提供给出延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量组分和外剂量组分，后者在前者之上采用包膜的形式。这两种组分可以通过肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗胃中的崩解并且允许内组分完整地传递进入十二指肠或被延迟释放。多种材料可以用于这种肠溶层或包衣，这种材料包含多种聚合酸以及聚合酸与如虫胶、十六醇和乙酸纤维素等此类材料的混合物。
[0139]
合适的表面活性剂具体地包含非离子剂，如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，tween
tm 20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如，span
tm
20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括介于0.05％与5％之间的表面活性剂，并且可以介于0.1％与2.5％之间。应当理解，如果有必要，可以添加其它成分，例如甘露醇或其它药学上可接受的媒剂。
[0140]
可以使用如intralipid
tm
、liposyn
tm
、infonutrol
tm
、lipofundin
tm
和lipiphysan
tm
等可商购获得的脂肪乳剂来制备合适的乳剂。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者可替代地，活性成分可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成的乳剂中。应当理解，可以添加其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂通常将含有高达20％的油，例如，介于5％与20％之间。脂肪乳剂可以包括介于0.1与1.0μm之间、具体地0.1与0.5μm之间的脂肪滴，并且ph范围为5.5到8.0。
[0141]
乳剂组合物可以是通过将抗体与intralipid
tm
或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些乳剂组合物。
[0142]
用于吸入或吹入的药物组合物包含药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上文所列出的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，通过口服或鼻腔呼吸途径施用组合物以产生局部或全身作用。
[0143]
可以通过使用气体来雾化优选地无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置中呼吸雾化溶液，或者雾化装置可以附着到面罩、帐篷或间歇正压呼吸机。可以从以适当方式递送调配物的装置优选地通过口服或鼻腔施用溶液、悬浮液或粉末组合物。
[0144]
治疗应用
[0145]
为了实践本文所公开的方法，可以通过合适的途径向需要治疗的受试者(例如，人)施用有效量的本文所述的药物组合物，所述合适的途径如静脉内施用(例如，如推注或通过一段时间内的连续输注)、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。包含喷射雾化器和超声雾化器的用于液体调配物的可商购获得的雾化器可用于施用。液体调配物可以直接雾化并且冻干粉可以在重构之后雾化。可替代地，本文所述的抗体可以使用碳氟化合物调配物和计量吸入器来雾化或者作为冻干粉和研磨粉吸入。
[0146]
待通过本文所述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物包含但不限于家畜、运动动物(sport animal)、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是患有、有风险或怀疑患有目标疾病/病症例如癌症、免疫病症例如自身免疫疾病或感染的人类患者。在一些实施方案中，包含人源化抗cd137抗体的药物组合物用于增强受试者的免疫反应，这也在本公开的范围内。
[0147]
癌症的实例包含但不限于乳腺癌；胆管癌；膀胱癌；脑癌，包含成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌(gastric cancer)；血液肿瘤，包含急性淋巴细胞白血病和骨髓性白血病，例如b细胞cll；t细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤；毛细胞白血病；慢性骨髓性白血病，多发性骨髓瘤；aids相关白血病和成人t细胞白血病/淋巴瘤；上皮内肿瘤，包含博文氏病(bowen's disease)和佩吉特氏病(paget's disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包含霍奇金氏病(hodgkin's disease)和淋巴细胞性淋巴瘤；成神经细胞瘤；口腔癌，包含鳞状细胞癌；卵巢癌，包含由以下引起的那些:上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包含平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包含黑色素瘤、梅克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)、卡波西肉瘤(kaposi's sarcoma)、基底细胞癌和鳞状细胞癌；
睾丸癌，包含胚组织瘤，如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌，包含甲状腺腺癌和髓样癌；和肾癌，包含腺癌和威尔姆氏肿瘤(wilms tumor)。
[0148]
在一个实例中，癌症可以是晚期、转移性或不可切除的恶性肿瘤。可以通过组织学或细胞学确认恶性肿瘤。特别是，恶性肿瘤可能是晚期或转移性的。
[0149]
患有目标癌症的受试者可以通过常规医学检查，例如实验室测试、器官功能测试、ct扫描或超声波来鉴定。还可以在组织学和/或细胞学上鉴定目标癌症。在一些实施方案中，通过本文所述的方法待治疗的受试者可以是已经经历或正经受抗癌疗法(例如，化学疗法、放射疗法、免疫疗法或外科手术)的人癌症患者。
[0150]
在一些实施方案中，要通过本文公开的方法(例如，涉及克隆3712-igg1v)治疗的受试者可以是18岁或以上的人类患者。患者可能：(i)具有组织学或细胞学证实的转移性或不可切除的恶性肿瘤，(ii)具有足够的骨髓、肝和肾功能，和/或(iii)从先前抗癌治疗的所有可逆ae中恢复到基线。如果疾病在有效治疗的控制之下，则感染hiv的患者可以通过本文公开的方法进行治疗。
[0151]
替代地或另外地，受试者可以是不具有以下一项或多项的人类患者：(1)接受本文公开的抗cd137抗体的第一剂的全身性抗癌疗法5个半衰期；(2)本文公开的抗cd137抗体的第一剂的14天内的先前放射治疗；(3)具有活性cns转移和/或癌性脑膜炎；(4)30天内接受过活病毒疫苗；(5)对单克隆抗体治疗有≥3级的过敏反应；(6)qt间期或综合征异常；(7)具有≥3级的免疫相关ae(irae)或irae的病史；(8)因任何原因正在接受基于免疫学的治疗；(9)在第一剂抗cd137抗体前4周内使用全身免疫刺激剂治疗；(10)患有活性慢性自身免疫性疾病，该疾病在过去2年内需要全身治疗，或正在接受自身免疫性疾病或炎症性疾病的全身治疗；(11)6个月内有临床显著心脏病，包括不稳定型心绞痛、急性心肌梗塞；(12)在第一剂抗cd137抗体前14天内有需要静脉注射(i.v.)抗感染药物的活性感染；(13)显示需要治疗例如口服或静脉注射糖皮质激素以协助管理的间质性肺病或活性非感染性肺炎的当前证据或病史；(14)显示严重或不受控制的全身性疾病的证据；(15)有其他疾病或实验室参数有临床显著的异常；和/或(16)之前曾接受过干细胞或骨髓或实体器官移植。
[0152]
在一些实施方案中，本文公开的方法用于治疗免疫病症。免疫病症是指免疫系统功能障碍。例子包括自身免疫性疾病、免疫缺陷或过敏。在一些实施方案中，用于治疗的目标疾病是自身免疫性疾病。实例包含但不限于类风湿性关节炎(ra)、系统性红斑狼疮(sle)、重症肌无力(mg)、格雷夫氏病(graves'disease)、特发性血小板减少性紫癜(itp)、格林-巴利综合征(guillain-barre syndrome)、自身免疫性心肌炎、膜性肾小球肾炎、糖尿病、i型或ii型糖尿病、多发性硬化症、雷诺氏综合征(reynaud's syndrome)、自身免疫性甲状腺炎、胃炎、乳糜泻、白癜风、肝炎、原发性胆汁性肝硬化、炎症性肠病、脊椎关节病变、实验性自身免疫性脑脊髓炎、免疫性中性粒细胞减少症、青少年型糖尿病、和与常见于结核病、结节病和多肌炎中的由细胞因子、t淋巴细胞介导的迟发型超敏反应相关的免疫应答、多动脉炎、皮肤血管炎、天疱疮、类天疱疮(pemphigold)、古德帕斯彻氏综合征(goodpasture's syndrome)、川崎氏病(kawasaki's disease)、系统性硬化症、抗磷脂综合征、干燥综合征(sjogren's syndrome)、移植物抗宿主(gvh)疾病和免疫性血小板减少症。
[0153]
可以通过常规医学检查，例如，存在抗核抗体、抗线粒体自身抗体、抗中性粒细胞
胞质抗体、抗磷脂抗体、抗瓜氨酸肽(抗ccp)、抗类风湿因子、免疫球蛋白a、c反应蛋白测试、补体测试、红细胞沉降率(esr)测试、凝血曲线和蛋白质电泳/免疫固定电泳等，鉴定患有目标自身免疫病的受试者。在一些实施方案中，通过本文所述的方法待治疗的受试者可以是患有自身免疫病症的人类受试者，所述人类受试者已经经历或正经受自身免疫病症治疗，例如免疫抑制介导、激素替代疗法、输血、抗炎药物和/或疼痛药物。
[0154]
疑似患有任何这样的目标疾病/疾患的受试者可能示出该疾病/疾患的一种或多种症状。处于疾病/疾患风险的受试者可以是具有该疾病/疾患的一种或多种风险因素的受试者。
[0155]
如本文所使用的，“有效量”是指单独地或与一种或多种其它活性剂组合地赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。在一些实施方案中，治疗效果是增加的cd137活性、增加的t细胞增殖和存活和/或增加的抗肿瘤免疫反应。确定抗体的量是否达到治疗效果对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的。如本领域的技术人员所认识到的，有效量有所不同，这取决于正在治疗的特定病状、病状的严重程度、包含年龄、身体状况、大小、性别和体重在内的个体患者参数、治疗持续时间、同时疗法的性质(如果有的话)、具体施用途径和在健康从业者的知识和专业技能内的相似因素。这些因素是本领域的普通技术人员所熟知的并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用个别组分或其组合的最大剂量，也就是说，根据合理的医学判断的最高安全剂量。
[0156]
如半衰期等经验性考虑通常将有助于确定剂量。例如，可以使用如人源化抗体或完全人抗体等与人免疫系统相容的抗体来延长抗体的半衰期并且防止抗体受到宿主的免疫系统的攻击。施用频率可以在治疗过程中确定并进行调整，并且通常但不一定是基于目标疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替代地，抗体的持续连续释放调配物可以是适当的。用于实现持续释放的各种调配物和装置是本领域已知的。
[0157]
在一个实例中，本文所述的抗体的剂量可以在给予一次或多次抗体施用的个体中凭经验确定。给予个体递增剂量的激动剂。为了评估激动剂的功效，可以遵循疾病/病症的指标。
[0158]
通常，对于施用本文所述的任何抗体，初始候选剂量可以为约2mg/kg。出于本公开的目的，典型的日剂量的范围根据上述因素可以为约0.1μg/kg到3μg/kg、到30μg/kg、到300μg/kg、到3mg/kg、到30mg/kg、到100mg/kg或更多中的任何剂量。在一些实施方案中，日剂量可以是10mg/kg。对于在若干天或更长时间内的重复施用，根据病状持续治疗，直至出现期望的症状抑制或直至达到足以减轻目标疾病或病症或其症状的治疗水平。示例性给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，之后施用约1mg/kg抗体的每周维持剂量或者之后每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。然而，根据从业者希望实现的药代动力学衰变模式，其它剂量方案可能是有用的。例如，设想每周给药一到四次。在一些实施方案中，可以使用的剂量范围为约3μg/mg到约2mg/kg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约2mg/kg)。在一些实施方案中，给药频率为每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次或每3个月一次或更久一次。每个这样的时段可以称为一个周期。在一些实施方案中，可以施用多达40个周期，特别是35个周期。通过常规技术和测定，容易地监测这一疗法的进展。给药方案(包含使用的抗体)可以随时间推移而变化。
[0159]
在一个例子中，给药频率是每3周一次。特别地，可以每3周一次施用0.3至10mg/kg的本文公开的人源化抗cd137抗体(例如，克隆3712-igg1v)。可以施用多达35个周期。这些实施方案中的施用方式可以是静脉内的。
[0160]
在一些实施方案中，对于正常体重的成年患者，可以施用的剂量范围为约0.3到5.00mg/kg。在一些实例中，如本文所述的抗cd137抗体的剂量可以为10mg/kg。特定的给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定个体和所述个体的病史以及个别药剂的性质(如药剂的半衰期和本领域所熟知的其它考虑)。
[0161]
出于本公开的目的，本文所述的抗体的适当剂量将取决于所采用的特异性抗体、抗体和/或非抗体肽(或其组合物)、疾病/病症的类型和严重程度、抗体是否出于预防或治疗目的而施用、既往疗法、患者的临床病史和对激动剂的应答以及主治医生的判定。通常，临床医生将施用抗体，直到达到实现期望的结果的剂量为止。在一些实施方案中，期望的结果是肿瘤微环境中抗肿瘤免疫反应的增加。确定剂量是否产生期望结果的方法对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的。一种或多种抗体的施用可以是连续或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用目的是治疗性的还是预防性的以及熟练从业者已知的其它因素。抗体的施用可以在预选时间段内基本上是连续的，或者可以例如在发展目标疾病或病症之前、期间或之后采用一系列间隔剂量。
[0162]
如本文所使用的，术语“治疗”是指向受试者施加或施用包含一种或多种活性剂的组合物，所述受试者患有目标疾病或病症、疾病/病症的症状或对疾病/症状有易感性，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病的症状或对疾病或病症的易感性。
[0163]
减轻目标疾病/病症包含延迟疾病的发展或进展或者降低疾病严重程度或延长存活。减轻疾病或延长存活不一定需要治愈效果。如本文所使用的，“延迟”目标疾病或病症的发展意指推迟、阻碍、减缓、放缓、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或正在治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或者延迟疾病的发作的方法是降低在给定时间帧内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或与不使用所述方法相比在给定时间帧内降低症状的程度的方法。这种比较通常是基于临床研究，使用足以给出统计学上显著的结果的许多受试者。
[0164]
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或后续进展。疾病的发展可以是可检测到的并且可以使用如本领域熟知的标准临床技术进行评估。然而，发展还指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包含发生、复发和发作。如本文所使用的，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包含初始发作和/或复发。
[0165]
在一些实施方案中，在体内以足以增强cd137(和/或t细胞增殖)的活性至少10％(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大)的量向需要治疗的受试者施用本文所述的抗体。
[0166]
根据待治疗的疾病的类型或疾病的位点，可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法来向受试者施用药物组合物。这种组合物还可以通过其它常规途径施用，例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、颊、阴道或通过植入式储药器施用。如本文所使用的术语“肠胃外”包含皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、
鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，可以通过可注射的贮库施用途径向受试者施用组合物，如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或可生物降解材料和方法。在一些实例中，眼内或玻璃体内施用药物组合物。
[0167]
可注射组合物可以含有各种载体，如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注方法施用水溶性抗体，由此输注含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物调配物。生理学上可接受的赋形剂可以包含例如5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液(ringer's solution)或其它合适的赋形剂。肌肉内制剂(例如，抗体的合适的可溶性盐形式的无菌调配物)可以在如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液等药物赋形剂中溶解和施用。
[0168]
在一个实施方案中，通过位点特异性或靶向局部递送技术施用抗体。定位或靶向局部递送技术的实例包括抗体的各种可植入的长效来源或局部递送导管，诸如输注导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜包裹、分流器和支架或其他可植入装置、定位的载体、直接注射或直接施加。参见例如，pct公开号wo 00/53211和美国专利号5,981,568。
[0169]
也可以使用含有反义多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的dna递送技术在例如findeis et al.,trends biotechnol.(1993)11:202；chiou et al.,gene therapeutics:methods and applications of direct gene transfer(j.a.wolff,ed.)(1994)；wu et al.,j.biol.chem.(1988)263:621；wu et al.,j.biol.chem.(1994)269:542；zenke et al.,proc.natl.acad.sci.usa(1990)87:3655；wu et al.,j.biol.chem.(1991)266:338中描述。
[0170]
含有多核苷酸(例如，编码本文所述抗体的那些)的治疗组合物以约100ng至约200mg dna的范围施用，用于基因治疗方案中的局部施用。在一些实施方案中，在基因治疗方案期间也可以使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg和约20μg至约100μg或更多的浓度范围。
[0171]
本文所述的治疗性多核苷酸和多肽可以使用基因递送载体递送。基因递送载体可以是病毒或非病毒来源的(一般参见，jolly,cancer gene therapy(1994)1:51；kimura,human gene therapy(1994)5:845；connelly,human gene therapy(1995)1:185；和kaplitt,nature genetics(1994)6:148)。可以使用内源哺乳动物或异源启动子和/或增强子诱导此类编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成型的或受调控的。
[0172]
用于递送期望的多核苷酸并在期望细胞中表达的基于病毒的载体是本领域公知的。示例性的基于病毒的载体包括但不限于重组逆转录病毒(参见，例如，pct公开号wo 90/07936；wo 94/03622；wo 93/25698；wo 93/25234；wo 93/11230；wo 93/10218；wo 91/02805；美国专利号5,219,740和4,777,127；英国专利号2,200,651；和欧洲专利号0 345 242)，基于甲病毒的载体(例如，sindbis病毒载体、semliki森林病毒)(atcc vr-67；atcc vr-1247)，罗斯河病毒(atcc vr-373；atcc vr-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(atcc vr-923；atcc vr-1250；atcc vr 1249；atcc vr-532))和腺相关病毒(aav)载体(参见例如pct公开号wo 94/12649、wo 93/03769；wo 93/19191；wo 94/28938；wo 95/11984和wo 95/00655)。也可以使用如curiel,hum.gene ther.(1992)3:147中所述的施用与被杀死的腺病毒相关的dna。
[0173]
也可以使用非病毒递送载体和方法，包括但不限于，单独与杀死的腺病毒连接或不连接的聚阳离子缩合dna(参见，例如，curiel,hum.gene ther.(1992)3:147)；配体连接的dna(参见，例如，wu,j.biol.chem.(1989)264:16985)；真核细胞递送载体细胞(参见，例如，美国专利号5,814,482；pct公开号wo 95/07994；wo 96/17072；wo 95/30763；和wo 97/42338)和核酸电荷中和或与细胞膜融合。也可以使用裸dna。示例性的裸dna引入方法描述于pct公开号wo 90/11092和美国专利第5,580,859号。可以充当基因递送载体的脂质体描述于美国专利5,422,120；pct公开号wo 95/13796；wo 94/23697；wo 91/14445；和欧洲专利0524968。其他方法描述于philip,mol.cell.biol.(1994)14:2411和woffendin,proc.natl.acad.sci.(1994)91:1581。
[0174]
本文所述的方法中使用的特定给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定受试者和所述受试者的病史。
[0175]
在一些实施方案中，可以向需要治疗的受试者施用多于一种抗体或抗体与另一种合适的治疗剂的组合。抗体还可以与用于增强和/或补充药剂有效性的其它药剂结合使用。
[0176]
可以通过本领域熟知的方法对目标疾病/病症的治疗功效进行评估。
[0177]
联合疗法
[0178]
本文所述的抗cd137抗体可以与用于如癌症、免疫病症或感染等目标疾病的其它类型的疗法结合使用。
[0179]
当如本文所述的抗cd137抗体用于治疗癌症时，它可以与例如本领域已知的那些抗癌疗法联合。另外的抗癌疗法包含化学疗法、外科手术、辐射、免疫疗法、基因疗法等。此类疗法可以与根据本公开的免疫疗法同时地或顺序地(以任何顺序)施用。
[0180]
在一些实施方案中，抗cd137抗体可以与其他免疫调节治疗联合，例如检查点分子(例如pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、cd40、lag3、tim)-3或a2ar)的抑制剂。如图14所示，抗cd137抗体和抗pd-1抗体的联合治疗产生协同效应：与单独使用两种治疗中的任一种相比，小鼠模型中的肿瘤生长得到显著抑制。
[0181]
可替代地或另外地，本公开的治疗可以与以下联合：化学治疗剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)和阿糖胞苷)、嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin)和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包含如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)等天然产物、如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛(docetaxel))、长春新碱、长春碱、诺考达唑(nocodazole)、埃博霉素(epothilone)和诺维本(navelbine)等微管破坏剂、表鬼臼毒素(依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、dna损伤剂(放线菌素、安吖啶(amsacrine)、蒽环霉素(anthracycline)、博莱霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、卡铂、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(cytoxan)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、六轻甲基蜜胺(hexamethyhnelamine)、奥沙利铂(oxaliplatin)、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、二氯甲基二乙胺(merchlorehtamine)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、亚硝基脲、普卡霉素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉酚(taxol)、泰索帝(taxotere)、替尼泊苷、三乙烯硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和依托泊苷
(vp16))；抗生素，如更生霉素(放线菌素d)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、伊达比星(idarubicin)、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素(mithramycin))和丝裂霉素；酶(系统地代谢l-天冬酰胺并且剥夺不具有合成其自身的天冬酰胺的能力的细胞的l-天冬酰胺酶)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，如氮芥(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(carmustine)(bcnu)和类似物、链脲霉素(streptozocin))、三氮烯-达卡巴嗪(trazenes-dacarbazinine)(dtic)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦(mitotane)、氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素、激素类似物(雌激素、三苯氧胺(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(nilutamide))和芳香酶抑制剂(来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole))；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和其它凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林(aspirin)、双嘧达莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抗分泌剂(贝莱维定(breveldin))；免疫抑制剂(环孢菌素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)(fk-506)、西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如，tnp-470、染料木黄酮、贝伐单抗(bevacizumab))和生长因子抑制剂(例如，成纤维细胞生长因子(fgf)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗(trastuzumab))；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸(tretinoin))；mtor抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、京尼平苷(eniposide)、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))、皮质类固醇(可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基强的松龙(methylpednisolone)、强的松(prednisone)和泼尼松龙(prednisolone))；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和胱天蛋白酶激活剂；以及染色质破坏剂。
[0182]
当本文所述的抗cd137抗体用于治疗免疫病症时，它可以与其他免疫调节治疗共同使用，例如治疗性疫苗(包括但不限于gvax、基于dc的疫苗等)。在某些情况下，抗体可以与另一种自身免疫疾病疗法联合使用。实例包括但不限于，静脉ig治疗；非甾体抗炎药(nsaid)；皮质类固醇；环孢菌素、雷帕霉素、子囊霉素；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；布喹那(brequinar)；fty 720；来氟米特；咪唑立滨；霉酚酸；吗替麦考酚酯；15-脱氧精胍；免疫抑制剂或粘附分子抑制剂。
[0183]
关于另外的有用药剂的实例，还参见：《内科医生案头参考(physician's desk reference)》,补充第59版,(2005),thomson p d r,montvale n.j.；gennaro等人编辑,《雷明顿药学科学与实践》,补充第20版,(2000),马里兰州巴尔的摩的利平科特
·
威廉姆斯&威尔金斯公司(lippincott williams and wilkins,baltimore md.)；braunwald等人编辑,《哈里森内科医学原理(harrison's principles of internal medicine)》,补充第15版,(2001),麦格劳
·
希尔公司(mcgraw hill),纽约；berkow等人编辑,《默克诊断与疗法手册(the merck manual of diagnosis and therapy)》,(1992),默克研究实验室(merck research laboratories),拉威(rahway),新泽西州(n.j.)。
[0184]
当与另外的治疗剂共同施用时，可以根据相加作用或协同效应降低每种药剂的合适的治疗有效剂量。
[0185]
用于治疗疾病的试剂盒
[0186]
本公开还提供了用于治疗或减轻如本文所述的目标疾病例如癌症、免疫紊乱或感染的试剂盒。此类试剂盒可包括一个或多个容器，其包含抗cd137抗体，例如本文所述的那些的任一种，以及任选地与抗cd137抗体共同使用的第二治疗剂，其也在本文中描述。
[0187]
在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于根据本文所述的任何方法使用的说明书。包含的说明书可以包括对施用用于治疗、延迟发作或减轻如本文所述的那些目标疾病等目标疾病的抗cd137抗体和任选的第二治疗剂的描述。试剂盒可以进一步包括对基于例如采用本文所述的诊断方法鉴定个体是否患有目标疾病来选择适于治疗的所述个体的描述。在仍其它实施方案中，说明书包括对向具有目标疾病风险的个体施用抗体的描述。
[0188]
与抗cd137抗体的使用有关的说明书通常包含关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的用法说明通常是在标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸张)上的书面用法说明，但是机器可读的用法说明(例如，载于磁盘或光存储磁盘上的用法说明)也是可接受的。
[0189]
标签或包装插页指示组合物用于治疗、延迟发作和/或减轻如癌症、免疫病症(例如自身免疫疾病)或感染疾病等疾病。可以提供说明书以用于实践本文所述的任何方法。
[0190]
本发明的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包含但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的密拉(mylar)或塑料袋)等。还设想了与具体装置(如吸入器、鼻腔施用装置(例如，雾化器)或输注装置(如微型泵))组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器也可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的那些抗cd137抗体。
[0191]
试剂盒可以任选地提供如缓冲液等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施方案中，本发明提供了包括上文所述的试剂盒的内容物的制品。
[0192]
一般技术
[0193]
除非另有指示，否则本发明的实践将采用在本领域技术范围内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在如以下文献中有充分解释：《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》,第二版(sambrook等人,1989),冷泉港出版社；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编辑,1984)；《分子生物学方法(methods in molecular biology)》,胡玛纳出版社(humana press)；《细胞生物学：实验室手册(cell biology:a laboratory notebook)》(j.e.cellis编辑,1998),学术出版社；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编辑,1987)；《细胞和组织培养导论(introduction to cell and tissue culture)》(j.p.mather和p.e.roberts,1998),普莱南出版社(plenum press)；《细胞和组织培养：实验室程序(cell and tissue culture:laboratory procedures)》(a.doyle,j.b.griffiths和d.g.newell编辑,1993-8),约翰
·
威利父子出版
公司(j.wiley and sons)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编辑)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编辑,1987)；《分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology)》(f.m.ausubel等人编辑,1987)；《pcr：聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编辑,1994)；《免疫学实验指南(current protocols in immunology)》(j.e.coligan等人编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(short protocols in molecular biology)》(约翰威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(immunobiology)》(c.a.janeway和p.travers,1997)；《抗体(antibodies)》(p.finch,1997)；《抗体：实用方法(antibodies:a practical approach)》(d.catty.编辑,irl出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(monoclonal antibodies:a practical approach)》(p.shepherd和c.dean编辑,牛津大学出版社(oxford university press),2000)；《使用抗体：实验室手册(using antibodies:a laboratory manual)》(e.harlow和d.lane(冷泉港实验室出版社,1999))；《抗体》(m.zanetti和j.d.capra编辑，哈伍德学术出版社(harwood academic publishers)，1995)。
[0194]
无需进一步详细阐述，相信本领域的技术人员可以基于以上描述在最大程度上利用本发明。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。
[0195]
实施例
[0196]
实施例1：人源化抗cd137抗体的产生
[0197]
人性化和回复突变设计
[0198]
如下所述将参考抗体371人源化。产生了比较参考抗体371可变结构域与人种系的序列比对(glanville j.et al.pnas 2009；106(48)20216
–
21)。基于整体序列同一性、匹配的界面位置和类似分类的cdr规范位置，每个轻链和重链的种系家族被鉴定为包含最合适的受体框架：对于轻链，igkv1-39*01和对于重链，ighv1-2*02。鉴定的人重链和轻链可变受体框架氨基酸序列提供如下：
[0199]vh
氨基酸序列(aap97932.1)：
[0200]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarttgttyfdywgqgtlvtvss(seq id no:43)
[0201]vl
氨基酸序列(bah04687.1):
[0202]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystpltfgggtkveir(seq id no:44)
[0203]
克隆371的人源化通过cdr移植到选定的人框架(重链和轻链分别为seq id no：3和4)来进行。
[0204]
进行了371抗体fv片段的同源建模。针对蛋白质数据库(pdb)抗体数据库对克隆371序列进行blast搜索，以识别fv片段的模板并构建结构域界面。选择结构模板1nmb(malby et al.,structure,1994aug 15；2(8):733-46)，因为其同一性为78％。参考抗体371抗体(断裂前的seq id no：2和断裂后的seq id no：1)与1nmb模板(seq id no：45)之间的氨基酸序列比对如下所示，其中
│
是链断裂和*表示两个序列中相同的氨基酸残基。
[0205][0206]
同源模型是使用定制的构建同源模型方案构建的。二硫键被指定和连接。使用dope方法优化循环。基于1nmb的同源模型，分析了参考抗体371的序列。鉴定了被认为对于结合活性重要的框架区(fr)残基，即规范fr残基，以及抗体的v
h-v
l
界面残基。进一步分析了内核中的框架残基。鉴定了参考抗体371_v
l-1(接枝的参考抗体371_v
l
；seq id no:2)的四个残基的回复突变：k42(具有侧链电荷的掩蔽残基)、p44(在vh/v
l
界面的掩蔽残基)、f71(掩蔽的规范残基)和y87(在vh/v
l
界面的掩蔽残基)。人源化变体，参考抗体371_v
l-2(seq id no:5)被设计为将鉴定的残基回复为参考抗体371残基(k42g、p44v、f71y和y87f)，以测试这些残基是否需要保持最佳活性。
[0207]
人源化参考抗体371抗体的重组全人igg4/κ是用含有铰链s228p(eu编号；kabat编号241)稳定突变(angal et al.,mol.immunol 30:105,1993)和人κ轻链恒定区的人igg4构建的。人源化参考抗体371，克隆3711是没有回复突变的v
h-1和v
l-1的cdr-接枝的371，而克隆3712具有v
h-1和v
l-2，其包含四个氨基酸残基对应物(k42g、p44v、f71y和y87f)的回复突变。
[0208]
还构建了额外的人源化vh链(v
h-2和v
h-3)和v
l
链(v
l-3)。上文提供了亲本克隆371的vh和v
l
的氨基酸序列，以及从其衍生的所有人源化vh和v
l
链。
[0209]
构建了包含上文所列人源化vh和v
l
链的随机组合的人源化抗cd137抗体。见下表3。
[0210]
表3.抗cd137抗体克隆的vh和v
l
链
[0211]
克隆idvhvl371(嵌合体)lyv371_vh(seq id no:1)lyv371_v
l
(seq id no:2)3711lyv371_v
h-1(seq id no:3)lyv371_v
l-1(seq id no:4)3712lyv371_v
h-1(seq id no:3)lyv371_v
l-2(seq id no:5)3713lyv371_v
h-1(seq id no:3)lyv371_v
l-3(seq id no:10)3714lyv371_v
h-2(seq id no:8)lyv371_v
l-1(seq id no:4)3715lyv371_v
h-2(seq id no:8)lyv371_v
l-2(seq id no:5)3716lyv371_v
h-2(seq id no:8)lyv371_v
l-3(seq id no:10)3717lyv371_v
h-3(seq id no:9)lyv371_v
l-1(seq id no:4)
3718lyv371_v
h-3(seq id no:9)lyv371_v
l-2(seq id no:5)3719lyv371_v
h-3(seq id no:9)lyv371_v
l-3(seq id no:10)
[0212]
将编码抗cd137抗体可变结构域序列的cdna序列合成为含有铰链s228p(eu编号；kabat编号241)稳定突变的人igg4重链恒定区(angal et al.,mol.immunol 30:105,1993)或人κ轻链恒定区的嵌合体。用含有对应的重链序列和轻链序列的质粒进行hek293和/或cho瞬时表达。这些嵌合抗体和人源化抗体通过蛋白质亲和层析纯化。检查纯化抗体的内毒素(《5eu/mg)和单体化(》95％)。
[0213]
实施例2：抗cd137人源化抗体的评估
[0214]
cd137抗原结合的kd测量
[0215]
在octet red 96上的抗原结合测定中测试嵌合抗体和人源化抗体以估计结合动力学。将抗体加载到抗人fc(ahc)生物传感器上。将加载的传感器浸入测定缓冲液(含0.1％bsa、0.02％tween-20(ph 7.2)的pbs)中连续稀释的cd137蛋白(300nm，1:3下降，7个点)中。使用单价(1:1)模型计算的动力学常数显示在下表4中。人源化抗体3711显示出与亲本嵌合参考抗体371相似的结合动力学。具有回复突变的抗体3712由于解离率高3倍而表现出较低的亲和力。
[0216]
表4.抗cd137抗体的动力学常数
[0217]
抗体kd(m)k
on
(1/ms)k
dis
(1/s)371(嵌合体)3.9e-092.8e 051.1e-033711(cdr接枝的)2.4e-091.9e 054.6e-043712(带回复突变)1.0e-083.1e 053.1e-03
[0218]
cd137结合facs
[0219]
使用胰蛋白酶-edta部分消化，随后在1000g下离心3分钟，收获cho细胞过表达性人cd137。将细胞以5x106/ml重悬于冷pbs-bsa(2％)中并且等分为100微升/管。将抗cd137抗体在pbs-bsa中稀释三次(最终浓度为0.01、0.1、1和10μg/ml)，并且向cho-cd137细胞中添加50μl的每种浓度。将细胞溶液混合并且在4℃下在黑暗中温育2小时。然后将细胞用pbs-bsa洗涤两次。以1μg/ml 100μl/孔的浓度添加二级抗体缀合物(山羊f(ab')2抗人igg-fc(pe)，预吸附的(ab98596))并且将细胞混合并在4℃下在黑暗中温育1小时。然后将细胞用pbs-bsa洗涤两次，随后固定在含2％pfa中，并且然后进行facs分析。如图1所示，参考抗体371和人源化抗体3711和3712对过表达人cd137的cho细胞表现出相似的结合亲和力。
[0220]
t细胞功能测定
[0221]
从四名健康志愿者中分离出新鲜的pbmc，并以1x106/ml重新悬浮在含有10％fbs的prmi-1640中。使用easysep
tm
人cd8

t细胞分离试剂盒(stemcell,17953)从样品中分离cd8 t细胞。将所得t细胞在rpmi 1640(10％fbs)中稀释成5x105/ml的浓度。
[0222]
在与表达人fcγriib的cho细胞共培养下进行人cd8阳性t细胞的共刺激测定。为了进行共培养测定，将被设计为表达人fcγriib的cho细胞以2.5x104个细胞/孔的浓度接种在96孔培养板中。在37℃和5％co2的细胞培养箱中过夜温育期间允许细胞附着。来自四个供体的人cd8 t细胞以1x105个细胞/孔加入，okt3以0.1μg/ml加入，cd137抗体以0、0.01、0.02和0.04μg/ml终浓度加入。将培养板在细胞培养箱中在37℃和5％co2下温育3天。通过elisa(ebioscience，88-7316-88)测定培养上清液中ifn-γ的含量。如图2所示，嵌合抗体
和人源化抗体在表达fcγriib的cho细胞的存在下显示出共刺激人cd8阳性t淋巴细胞的能力。注意到，出乎意料地，抗体3711显示出比亲本参考抗体371和克隆3712(回复突变)更弱的效力。因此，选择轻链可变区含有回复突变的人源化抗体克隆3712作为fc工程化期望的人源化序列。
[0223]
实施例3:抗cd137人源化抗体的fc工程化和表征
[0224]
具有fc点突变的抗体克隆3712的制备
[0225]
上述克隆3712的人源化序列用于构建包含人iggl/κ的fc区(seq id nos:6和7)的cd137抗体克隆3712，其包含人iggl的fc变体(克隆3712-igglv/κ)。将克隆3712克隆到表达载体中，用于在瞬时表达cho细胞和稳定cho细胞系中生产。
[0226]
biacore上cd137抗原结合的kd测量
[0227]
将cm5传感器芯片(ge healthcare life sciences)的流动池用新鲜混合的50mmol/l nhs和200mmol/l edc激活420秒(10μl/min)。然后，将10mmol/l naac(ph 5.0)中的hucd137-c6his注射到激活的流动池(10μl/min)中，其中hbs-ep(10mm hepes、150mm nacl、3mm edta和0.05％p20，ph 7.4)作为运行缓冲液。剩余的活性偶联位点用420秒的1mol/l乙醇胺进样封闭。测量在25℃下进行，使用hbs-ep作为运行缓冲液。每个运行周期都包括注入测试分析物和cm5传感器芯片的表面再生。将连续稀释的克隆3712(2.5、5、10、20、40、80、160和320nm)依次注射到两个细胞上，结合时间约为180秒。缓冲液流维持大约180秒以进行解离。为了去除测试的抗体，注射10mm甘氨酸-hcl约30秒用于再生。对每个浓度的连续稀释的测试抗体重复上述程序。使用biacore t200评估软件3.1，用1:1结合模型，评估表面等离子体共振实验的原始数据。流通池1用作参考流通池。实验的亲和力和动力学数据示于表5，原始数据在图3提供。克隆3712与人cd137蛋白的亲和力(kd值)为18.9nm，具有快速启动和快速关闭动力学。
[0228]
表5.动力学数据(克隆3712-igg1v与人cd137蛋白的结合)
[0229][0230]
ka：结合常数；kd：解离常数；kd：亲和力常数
[0231]
cd137结合elisa
[0232]
还以标准elisa格式分析了克隆3712-igg1v与重组cd137受体蛋白的结合。将人或食蟹猴cd137受体蛋白在dpbs中稀释至1μg/ml，然后以体积为100μl(0.1μg)或50μl(0.05μg)/孔包被到elisa板(corning，目录号：9018，高度结合)中，并在4℃温育过夜。将板倾倒并洗涤一次；以200μl/孔添加测定稀释剂。在室温下温育一小时后，将板用pbst洗涤一次。将克隆3712在测定稀释剂中稀释至10μg/ml，然后在测定稀释剂中进行3倍连续稀释11个点，最终浓度为10000、3333.3、1111.1、370.4、123.5、41.2、13.7、4.6、1.52、0.51和0.17ng/ml。将稀释的克隆3712-igg1v加入测定板，50μl/孔，一式两份。将板在室温下温育一小时，然后用pbst洗涤三次。以1:100,000稀释度偶联的山羊抗人igg-h l hrp以100μl/孔添加到板中。然后将板在室温下温育一小时，然后用pbst洗涤四次。将tmb底物溶液以100μl/孔加入。
使颜色显色15分钟，并用100μl/孔2n h2so4终止。由tecan f200 pro读数器测定450nm和620nm处的吸光度。
[0233]
为了确定克隆3712-igg1v是否结合小鼠或大鼠cd137受体和其他人类蛋白质，例如人pd-1、lag-3、vista、b7-h3、b7-h4、gitr、cd40、tigit、pd-l1、cd20、cd47、cd19、cd27和ltbr，将蛋白质样品在dpbs中稀释至1μg/ml，然后以100μl(0.1μg)或50μl(0.05μg)/孔包被到elisa板(corning，目录号：9018，高度结合)中，并在4℃温育过夜。将板倾倒并洗涤一次；以200μl/孔添加测定稀释剂。在室温下温育1小时后，将板用pbst洗涤一次。将用作阳性参考/对照的靶标特异性抗体在测定稀释剂中稀释至10μg/ml；将克隆3712-igg1v在测定稀释剂中稀释至10μg/ml和1μg/ml；将阴性对照阿瓦斯汀在测定稀释剂中稀释至10μg/ml。将这些样品以50μl/孔添加到板中。将板在室温下温育1小时，然后用pbst洗涤三次。以1:100,000稀释度偶联的山羊抗人igg-h l hrp或以1:50,000稀释的山羊抗小鼠igg(h l)二抗hrp，以100μl/孔添加到板中。将板在室温下温育1小时，然后用pbst洗涤四次。将tmb底物溶液以100μl/孔加入。使颜色显色15分钟，然后加入100μl/孔的2n h2so4以终止反应。由tecan f200 pro读数器测定450nm和620nm处的吸光度。
[0234]
使用graphpad 7.0，“[激动剂]vs.响应——可变斜率(四个参数)”绘制结合数据并计算结合ec
50
值。代表性数据如图4a-4b所示。表6中列出了结合ec50值的汇总。阿瓦斯汀用作这些测定的对照抗体。这些研究的结果表明，克隆3712-igg1v的平均结合ec
50
值对人和食蟹猴cd137分别是0.37nm(即52.9ng/ml)和0.33nm(即47.4ng/ml)。克隆3712-igg1v对小鼠或大鼠cd137蛋白没有显示结合亲和力。
[0235]
此外，其他人类蛋白质，包括pd-1、lag-3、vista、b7-h3、b7-h4、gitr、cd40、tigit、pd-l1、cd20、cd47、cd19、cd27和ltβr，也使用elisa测定法进行了测试以确定克隆3712-igg1v结合。没有观察到结合亲和力。该研究证明了克隆3712与人类和食蟹猴cd137受体的特异性结合。
[0236]
表6.elisa结合结果汇总
[0237][0238]
*测试的蛋白质包括pd-1、lag-3、vista、b7-h3、b7-h4、gitr、cd40、tigit、pd-l1、cd20、cd47、cd19、cd27和ltβr
[0239]
cd137结合facs
[0240]
过表达人或食蟹猴cd137的cho细胞和cho亲本细胞通过1000g离心3分钟收获。将细胞以2*10^6/ml重悬于冰冷的测定缓冲液中，并以100μl/孔转移至96孔v型底板。将克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀抗体在检测缓冲液中稀释至300μg/ml，然后在检测缓冲液中进行3倍系列稀释，以制备15个点，其浓度为300000、100000、33333.3、11111.1、3703.7、1234.6、411.5、137.2、45.7、15.2、5.08、1.69、0.56、0.19和0.063ng/ml，3x终浓度。将稀释的克隆
3712-igg1v或阿瓦斯汀以50μl/孔添加到测定板中。将板混合并在黑暗中在4℃下温育2小时。通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤3次，然后重新悬浮在含有山羊f(ab')2抗人igg-fc(pe)的冰冷测定缓冲液中，100μl/孔。将板在黑暗中在4℃下再温育1小时。通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤2次，并重新悬浮在含有2％pfa的冰冷测定缓冲液中。然后立即将细胞置于流式细胞仪上。
[0241]
为了确定克隆3712-igg1v是否结合小鼠cd137受体和其他人类细胞靶标，例如人类lag-3、vista、b7-h3、b7-h4、gitr、cd40、tigit、pd-l1、cd20、cd47、cd19、cd27、ltbr、btla、cd160和cd200r1，通过以1000g离心3分钟收获过表达这些靶标的cho细胞。将细胞以2*10^6/ml重悬于冰冷的测定缓冲液中，并以100μl/孔转移至96孔v型底板。将靶标特异性抗体在测定缓冲液中以30μg/ml或6μg/ml稀释，将克隆3712-igg1v在测定缓冲液中以30μg/ml或3μg/ml稀释，将阿瓦斯汀在测定缓冲液中以30μg/ml稀释。将稀释的靶标特异性抗体克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀以50μl/孔添加到检测板中。将板在黑暗中在4℃下温育2小时。通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤3次，然后重新悬浮在含有山羊f(ab')2抗人igg-fc(pe)或pe山羊抗小鼠igg抗体的100μl冰冷测定缓冲液中。将板在黑暗中在4℃下再温育1小时。通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤2次，并重新悬浮在含有2％pfa的冰冷测定缓冲液中，并立即在流式细胞仪上进行分析。
[0242]
平均荧光强度(mfi)是根据fcm实验中的总细胞群计算的。使用graphpad 7.0，“[激动剂]vs.响应——可变斜率(四个参数)”在剂量反应中绘制结合mfi并计算fcm结合ec
50
值。克隆3712-igg1v显示与fcm在cho上过表达的人和食蟹猴cd137的有效结合。未观察到与亲本cho细胞的结合。参考抗体阿瓦斯汀用作对照以显示cd137结合的特异性。代表性数据如图5a-5c所示，结果汇总在表7中。
[0243]
表7.cho表达系统中克隆3712的fcm分析汇总
[0244][0245]
*测试的其他受体包括lag-3、vista、b7-h3、b7-h4、gitr、cd40、tigit、pd-l1、cd20、cd47、cd19、cd27、ltbr、btla、cd160、cd200r1和pd-1。
[0246]
为了证明克隆3712-igg1v对cd137的特异性，通过fcm测试过度表达其他人类受体蛋白例如lag-3、vista、b7-h3、b7-h4、gitr、cd40、tigit、pd-l1、cd20、cd47、cd19、cd27、ltbr、btla、cd160、cd200r1和pd-1的cho细胞。没有观察到克隆3712的结合信号，这与上述蛋白质elisa实验中证明的特异性一致。正如elisa数据所预期的，克隆3712-igg1v不结合鼠细胞cd137。
[0247]
与活化的cd8 t细胞上的内源性cd137结合
[0248]
为了确定克隆3712-igg1v可以结合内源性人和食蟹猴cd137，检查了由固定化抗
cd3抗体激活的pbmc的结合。为了在人pbmc中获得激活的t细胞，将24孔板包被上300μl dpbs，其含有2μg/ml affinipure山羊抗小鼠igg，在4℃下特异性的fcγ片段。用dpbs洗涤板3次。将抗体okt3以1μg/ml、100μl/孔添加到板中。将板在37℃下温育1小时。将一瓶刚解冻的人pbmc转移到含有25ml预热培养基(含有10％fbs的rpmi1640)的50ml管中，并以250g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于2ml完全培养基(培养基含有50um 2-me)中，并在完全培养基中将细胞密度调至3.3*10^6个细胞/ml，然后将900μl/孔细胞悬液转移至板。将培养物在37℃、5％co2下培养约48小时。温育后，收获细胞并用dpbs洗涤一次。将细胞沉淀重悬于冷测定缓冲液中，并将细胞密度调整为2*10^6个细胞/ml。将100μl细胞悬液转移至96孔v型底的板中。将克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀抗体在测定缓冲液中稀释至300μg/ml，然后在测定缓冲液中进行10倍系列稀释以制备300000、30000、3000、300、30、3、0.3和0.03ng/ml的浓度，3x终浓度。将稀释的克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀以50μl/孔添加到测定板中。将板在黑暗中在4℃下温育30分钟。通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤3次，然后重悬于50μl冰冷的测定缓冲液中，该缓冲液含有fitc抗人cd3抗体、pe抗人cd8a抗体和apc抗人igg fc抗体。将板在黑暗中在4℃下再温育30分钟。然后通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤2次，并重新悬浮在含有7-aad的100μl冰冷测定缓冲液中。在4℃下在黑暗中温育5分钟后，立即在流式细胞仪上分析细胞。
[0249]
为了在食蟹猴的pbmc中获得激活的t细胞，将24孔板用300μl dpbs包被过夜，dpbs含有2μg/ml affinipure f(ab')2片段山羊抗人igg，在4℃下特异性的fcγ片段。用dpbs洗涤板3次。将能够结合和激活食蟹猴cd3的抗cd3抗体ly305以3μg/ml、100μl/孔添加到板中。将板在37℃下温育1小时。将一瓶刚解冻的食蟹猴pbmc转移到含有15ml预热培养基(含有10％fbs的rpmi1640)的50ml管中，并以250g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于2ml培养基中，并在完全培养基中调整至细胞密度为3.3*10^6个细胞/ml，并将900μl/孔细胞悬液转移至板中。将培养物在37℃、5％co2下培养约48小时。温育后，收获细胞并用dpbs洗涤一次。将细胞沉淀重悬于冷测定缓冲液中，并将细胞密度调整为2*10^6个细胞/ml。将100μl细胞悬液转移至96孔v型底的板中。将克隆3712-igg1v-生物素或阿瓦斯汀-生物素抗体在测定缓冲液中稀释至300μg/ml，然后在测定缓冲液中进行10倍系列稀释以制备300000、30000、3000、300、30、3、0.3和0.03ng/ml的浓度，3x终浓度。将稀释的克隆3712-igg1v-生物素或阿瓦斯汀-生物素以50μl/孔添加到测定板中。将板在黑暗中在4℃下温育60分钟。通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤3次，然后重悬于含有fitc抗人cd8抗体(克隆：sk1)和apc链霉亲和素的50μl冰冷测定缓冲液中。将板在黑暗中在4℃下再温育60分钟。然后通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤2次，并重新悬浮在含有7-aad的100μl冰冷测定缓冲液中。将板在黑暗中在4℃下温育5分钟，然后立即在流式细胞仪上进行分析。
[0250]
如图6a-6b所示，克隆3712-igg1v显示出与激活的人类或食蟹猴cd8 t细胞的剂量依赖性结合。发现克隆3712-igg1v与人类和食蟹猴细胞cd137受体结合，具有相似的ec
50
值(37-50ng/ml或～0.3nm)。还发现克隆3712-igg1v以剂量依赖性方式与人或食蟹猴的活化cd8 t细胞上的内源性cd137结合。因此，克隆3712通过fcm显示出对cd137的高度特异性，如本文所述的elisa研究所预期的。
[0251]
fc受体和补体c1q结合
[0252]
fcγri结合测定
[0253]
通过1000g离心3分钟收获cho-k1-hufcγri细胞。将细胞以2*10^6/ml重悬于冰冷的测定缓冲液中，并以100μl/孔转移至96孔v型底的板。将克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀抗体在检测缓冲液中稀释至30μg/ml，然后在检测缓冲液中进行2倍系列稀释，以制备15个点，其浓度为30000、15000、7500、3750、1875、937.5、468.8、234.4、117.2、58.6、29.3、14.6、7.32、3.66和1.83ng/ml，3x终浓度。将稀释的克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀以50μl/孔添加到测定板中。将板混合并在黑暗中在4℃下温育2小时。通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤3次，然后重新悬浮在含有山羊f(ab')2抗人igg-fc(pe)二抗的冰冷测定缓冲液中，100μl/孔。将板在黑暗中在4℃下再温育1小时。通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤2次，并重新悬浮在含有2％pfa的冰冷测定缓冲液中。立即对细胞进行流式细胞术分析。
[0254]
cho-k1-hufcγri细胞表达高水平的人fcγri，其对igg1具有高亲和力(ravetch和bolland 2001，roopenian和akilesh 2007),用于fcγri结合测定3712-igg1v。通过多种浓度的抗体检查结合，包括10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563、0.078、0.039、0.0195、0.0098、0.0049、0.0024、0.0012和0.0006μg/ml(从上10μg/ml，2倍连续稀释，15个稀释点)。使用pe缀合的多克隆抗人fc f(ab')2片段通过流式细胞术检测结合。进行了三个独立的实验。图7a显示了克隆3712-igg1v的代表性数据，显示出不与fcγri结合，而参考人igg1抗体阿瓦斯汀显示出高结合亲和力，ec
50
值为32.2ng/ml(～0.2nm)。
[0255]
fcγriia结合测定
[0256]
通过1000g离心3分钟收获cho-k1-hufcγriia-arg131和cho-k1-hufcγriia-his131细胞。将细胞以2*10^6/ml重悬于冰冷的测定缓冲液中，并以100μl/孔转移至96孔v型底的板。将克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀抗体在测定缓冲液中稀释至300μg/ml，然后在测定缓冲液中进行2倍系列稀释以制备300000、150000、75000、37500、18750、9375、4688、2344、1172、586、293、146、73.2、36.6和18.3ng/ml的浓度，3x终浓度。将稀释的克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀以50μl/孔添加到测定板中。将板混合并在黑暗中在4℃下温育2小时。通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤3次，然后以100μl/孔重新悬浮在含有山羊f(ab')2抗人igg-fc(pe)二抗的冰冷测定缓冲液中。将板在黑暗中在4℃下温育另一小时。通过以1000g离心3分钟将细胞洗涤两次，并重新悬浮在含有2％pfa的冰冷测定缓冲液中。立即对细胞进行流式细胞术。
[0257]
cho-k1-hufcγriia-arg131和cho-k1-hufcγriia-his131细胞表达激活fcγriia受体，其对igg1具有低结合亲和力。对两者都研究了fcγriia结合测定。在一系列浓度下检查结合，包括：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195、0.098、0.049、0.024、0.012和0.006μg/ml(从上100μg/ml，2倍连续稀释，15个稀释点)。再次使用pe缀合的多克隆抗人fc f(ab')2片段通过流式细胞术检测结合。至少进行了三个独立的实验。图7b和7c显示了克隆3712-igg1v的代表性数据,其显示出与hufcγriia-arg131的结合弱且不与hufcγriia-his131结合。正如正常人igg1所预期的，参考对照阿瓦斯汀在两种测定中均表现出中等结合。
[0258]
fcγriib结合测定
[0259]
通过1000g离心3分钟收获cho-k1-hufcγriib-ile232细胞。将细胞以2*10^6/ml重悬于冰冷的测定缓冲液中，并以100μl/孔转移至96孔v型底的板。将克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀抗体在测定缓冲液中稀释至300μg/ml，然后在测定缓冲液中使用2倍系列稀释以制
f200 pro读数器测定450nmnm和620nmnm处的吸光度。
[0267]
通过elisa测定fcrn与克隆3712-igg1v和人igg1阿瓦斯汀的结合。将克隆3712-igg1v和阿瓦斯汀分别包被到塑料elisa板上，然后与带有his标签的人fcrn蛋白温育，浓度为10000、5000、2500、1250、625、312.5和156.3ng/ml(2倍连续稀释，7个稀释点)。通过抗his标签-hrp抗体检测与包被抗体结合的fcrn。进行了三个独立实验，代表性数据显示在图8a中。克隆3712-igg1v证明了与fcrn的预期结合，尽管与参考抗体阿瓦斯汀相比信号强度弱。还进行了3712和人fcrn的biacore结合，结果证实了阳性结合，动力学类似于人igg1和igg4。
[0268]
c1q elisa
[0269]
将克隆3712和对照igg1单克隆抗体(阿瓦斯汀)在dpbs中稀释至8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，并包被到elisa板(corning，目录号：9018，高结合)上，100μl/孔，一式两份，在4℃过夜。将板倾倒并洗涤一次；以200μl/孔添加测定稀释剂。在室温下温育1小时后，将板用pbst洗涤一次。将人c1q蛋白在测定稀释剂中稀释至2μg/ml。将稀释的c1q蛋白以50μl/孔添加到测定板中。将板在室温下温育1小时，然后用pbst洗涤三次。将以1:800稀释度偶联的羊抗人c1q抗体hrp以100μl/孔添加到板中。将板在室温下温育1小时，然后用pbst洗涤四次。将tmb底物溶液以100μl/孔加入。显色7分钟，加入100μl/孔的2n h2so4以终止反应。由tecan f200 pro读数器测定450nmnm和620nmnm处的吸光度。
[0270]
经由经典途径的补体激活和细胞裂解是通过c1q与igg分子的fc部分的结合而启动的。通过elisa测定c1q与克隆3712-igg1v和人igg1阿瓦斯汀的结合。将克隆3712-igg1v和阿瓦斯汀分别以多种浓度包被到塑料elisa板上：0.125、0.25、0.5、1、2、4和8μg/ml，然后与浓度为2μg/ml的带有his标签的重组人c1q温育。通过抗人c1q-hrp抗体检测与抗体结合的c1q。进行了三个独立实验，代表性数据如图8b所示。将克隆3712-igg1v与参考抗体阿瓦斯汀相比，显示与c1q的结合降低。
[0271]
克隆3712-igg1v是一种在fc区具有点突变的人源化重组igg1/κ，其经过工程改造以减少与c1q和活化fcγ受体的结合，以最小化fc效应子活性。工程改造的fc旨在保留与fcrγiib和fcrn的结合。此处描述的实验表明，克隆3712与人fcγri、fcγriia-arg131、fcγriia-his131、fcγriiia和补体c1q显示没有或最少结合，而参考人igg1抗体阿瓦斯汀显示出与文献中预期的结合特征。克隆3712表现出与人fcγriib和fcrn的结合。结果与克隆3712-igg1v中工程化fc的预期特征一致：保留与人fcγriib和fcrn的结合，但失去与其他fc受体和c1q的结合。
[0272]
报告基因测定中cd137信号传导的激活
[0273]
通过250g离心5分钟收获cho-k1或cho-k1-hufcγriib-ile232细胞。在2.5*10^6个细胞/ml下将细胞重悬于含有1％fbs的预热f12k培养基中，并以100μl/孔转移至96孔细胞培养板。同时，将含有1％fbs的100μl/孔f12k培养基添加到第三个细胞培养板中。将dpbs添加到细胞培养板的边缘。将培养板在5％co2中37℃下温育过夜。第二天，在以250g离心5分钟后收获gs-h2-hucd137细胞。将gs-h2-hucd137细胞以6*10^4个细胞/m重悬于含有1％fbs的预热mem培养基中，并将50μl/孔细胞悬液加入细胞培养板中。将3712-igg1v或阿瓦斯汀抗体稀释于含1％fbs的mem培养基中至25μg/ml，然后在测定缓冲液中进行4倍系列稀释，制备25000、6250、1562.5、390.625、97.65625、24.414、6.104、1.526、0.381、0.095和
0.024ng/ml的终浓度。将稀释的克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀以50μl/孔添加到细胞培养板中。将板混合并在5％co2中37℃下温育约18小时。温育后，使用来自cisbio的人il-8测定试剂盒对细胞培养物上清液进行il-8检测。
[0274]
克隆3712-igg1v在交联条件下表现出剂量依赖性激动活性。当cd137报告细胞与cho-k1-hufcγriib细胞共培养时，克隆3712诱导cd137活化，导致报告细胞分泌il8。克隆3712-igg1v在没有交联的情况下不激活cd137(与对照cho细胞共培养或不共培养)。阿瓦斯汀用作对照以显示cd137激活的特异性。对培养上清液中的il-8浓度进行量化并用于评估cd137报告细胞的活化。代表性数据如图9所示。至少进行了3次独立实验，结果具有可比性。从克隆3712-igg1v的cd137报告基因剂量反应曲线计算的平均ec
50
值为44.4ng/ml(～0.31nm；n＝6)。
[0275]
人cd8 t细胞共刺激测定
[0276]
通过250g离心5分钟收获cho-k1或cho-k1-hufcγriib-ile232细胞。将细胞以2.5*10^6个细胞/ml重新悬浮在含有10％fbs的预热f12k培养基中，并以100μl/孔转移至96孔细胞培养板。同时，将含有10％fbs的100μl/孔f12k培养基添加到第三个细胞培养板中。将dpbs添加到细胞培养板的边缘。将培养板在5％co2中37℃下温育过夜。第二天，将一瓶刚解冻的人cd8 t细胞转移到含有25ml预热培养基(含有10％fbs的rpmi1640)的50ml管中，并以250g离心10分钟。将细胞沉淀以0.5-1*10^6个细胞/ml重悬于2ml培养基中，并将50μl/孔细胞悬液加入板中。将克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀抗体在含有10％fbs和0.4μg/ml okt3的rpmi培养基中稀释至100μg/ml，然后在测定缓冲液中制备4倍连续稀释，产生的最终浓度为100000、25000、6250、1562.5、390.6、97.7、24.4、6.1、1.53和0.38ng/ml，4x终浓度。将稀释的克隆3712-igg1v或阿瓦斯汀以50μl/孔添加到细胞培养板中。将板混合并在5％co2中37℃下温育约72小时。温育后，使用来自cisbio的人ifn-γ测定试剂盒对细胞培养物上清液进行ifn-γ检测。
[0277]
克隆3712-igg1v当与cho-k1-hufcγriib细胞共培养时显示出激活人cd8 t细胞的剂量依赖性激动活性。当人cd8 t细胞与cho-k1细胞或培养基共培养时，没有观察到克隆3712的活性。阿瓦斯汀用作对照以显示cd137激活的特异性。至少三个独立实验的代表性数据如图10所示。测试了来自6个供体的cd8 t细胞，结果具有可比性。从克隆3712的cd8 t细胞共刺激测定剂量反应曲线计算的平均ec
50
值为30.6ng/ml(～0.21nm；n＝12)。
[0278]
实施例4：人源化抗体的药代动力学研究
[0279]
将c57bl/6小鼠(6-7周龄，19-20g，雄性，购自slac laboratory animal co.ltd)用于研究。在pbs中配制抗体，并以4只小鼠为一组中通过尾静脉注射以3mg/kg施用。在整个生命研究期间未观察到异常临床症状。
[0280]
通过连续出血在给药前、1h、2h、4h、8h、1d、2d、3d、5d、8d、11d、15d和21d进行采血。每个时间点将10μl血液添加到40ul pbs-bsa溶液中。然后将样品充分混合并在4℃下以2000g离心5分钟。收集后立即将上清液置于干冰上，并在大约-70℃下储存直至分析。通过elisa测定血液抗体浓度。图11显示单次静脉注射3mg/kg后的克隆3712-igg1v的血液抗体浓度。结果和药代动力学参数总结在下表8中。
[0281]
表8.雄性c57bl/6小鼠静脉给药3mg/kg后克隆3712的个体和平均血浆浓度-时间数据。
[0282][0283][0284]
实施例5：人源化抗体功效的体内评价
[0285]
材料和方法
[0286]
小鼠
[0287]
人cd137敲入小鼠(c57bl/6,b-h4-1bb)和cd137/pd-1双敲入小鼠(c57bl/6,b-hpd-1/h4-1bb)购自biocytogen,inc(中国北京)。c57bl/6j小鼠购自北京维塔河实验动物科技有限公司(中国北京)。所有小鼠都保持在无特定病原体的条件下。动物护理和使用符合机构和nih协议和指南，所有研究均获得相关机构的动物护理和使用委员会的批准。
[0288]
细胞系
[0289]
鼠结肠癌mc38细胞购自顺然生物技术公司(中国上海)并在5％co2中培养并在补充有10％热灭活胎牛血清的dmem中体外维持。将b16-ova在5％co2中培养，并在补充有10％热灭活胎牛血清(gibco)、2mmol/l l-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem中体外维持。
[0290]
功效研究
[0291]
将鼠结肠癌mc38细胞(0.1ml pbs中的0.5x10^6个细胞)皮下植入纯合b-h4-1bb小鼠中。当肿瘤大小约为150
±
50mm3时，将小鼠分为对照组和治疗组(n＝5-6)。通过腹膜内注射进行治疗。每周两次通过卡尺测量肿瘤大小，并且使用公式0.5
×
长度
×
宽度2计算为肿瘤体积。图12a和12b示出了肿瘤大小的平均值
±
sem。
[0292]
在给药期间肿瘤生长抑制(tgi)由下式确定：tgi＝(ct-tt)/(ct-c0)x 100，其中ct＝时间t时对照的平均肿瘤体积，tt＝在时间t治疗的平均肿瘤体积，c0＝在时间0时对照的平均肿瘤体积，其对于所有随机化组都是相同的。
[0293]
抗cd137抗体在同系小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤功效已得到充分证明(melero et al.1997,murillo et al.2008)。克隆3712不与鼠cd137发生交叉反应，因此使用具有敲入以替换鼠序列的人cd137细胞外结构域的小鼠来检查克隆3712的抗肿瘤活性。
[0294]
给药方案
[0295]
第一项研究比较了克隆3712-igg1v在鼠mc38同源肿瘤模型中的给药方案,如图12a和12b所示。当以3mg/kg腹腔施用仅一次或在每周两次方案中多剂施用时，克隆3712对已建立的肿瘤显示出相当的抗肿瘤作用，在第21天实验结束时单剂组和多剂组的肿瘤生长抑制分别为100％和103％(表9)。执行excel中t.test的p值以比较治疗组和载体对照组。
[0296]
各个小鼠数据如图12b所示。单次注射3mg/kg克隆3712-igg1v能够控制预先建立的mc38癌的生长3周，这表明克隆3712-igg1v在临床前肿瘤模型中强大的抗肿瘤活性。
[0297]
表9.如图12所示的各组肿瘤生长数据
[0298][0299]
克隆3712与乌瑞芦单抗(urelumab)和乌托米单抗(utomilumab)类似物相比的疗效
[0300]
接下来的实验比较了克隆3712-igg1v和根据已发表的序列内部制备的参考抗体乌瑞芦单抗及乌托米单抗类似物的功效。当在第7天以10mg/kg给药一次时，克隆3712和乌瑞芦单抗显示出相当的肿瘤生长抑制，而乌托米单抗与克隆3712相比较较差(图13a)。如下表6所示，以10mg/kg施用的乌瑞芦单抗类似物、乌托米单抗类似物和克隆3712在实验结束
时(注射单剂量后第21天)分别导致61％、80％和91％的肿瘤生长抑制。
[0301]
在研究中还进行了克隆3712-igg1v的剂量滴定。如图13b所示，克隆3712-igg1v以3、5和10mg/kg施用仅一次显示出相当的肿瘤生长抑制，但1mg/kg的剂量是不够的，因为tgi在所有时间点都低于50％。tgi的详细肿瘤体积和分析数据列于表10中。执行excel中t.test的p值以比较治疗组和载体对照组。
[0302]
表10.如图13所示的各组肿瘤生长数据
[0303]
[0304][0305]
克隆3712与抗pd-1抗体组合的抗肿瘤作用
[0306]
已报道了cd137激动剂抗体和pd-1阻断抗体之间可能的协同抗肿瘤活性(tolcher et al.2017,azpilikueta et al.2016)。b16黑色素瘤同基因肿瘤模型用于测试克隆3712-igg1v和抗pd-1组合。用950rads的单剂量对七至八周大的wt b6小鼠进行致死照射。第二天，用2-3x10
6 hpd-1/4-1bb小鼠供体骨髓细胞过继转移受照射的小鼠。在开始肿瘤功效实验之前，在重构后，将小鼠维持在饮用水中稀释的磺胺甲噁唑和甲氧苄啶(bactrim)抗生素4周。将大约1x10^6个b16-ova细胞在右侧皮下注射到骨髓嵌合体小鼠中。沿3个正交轴(a、b和c)测量肿瘤体积并计算为肿瘤体积＝abc/2。在肿瘤形成后(～9-12天，～100mm3)，将小鼠在第14、21和28天用100μg(～5mg/kg)抗pd-1抗体，或在第14天通过腹膜内注射施用100μg(～5mg/kg)抗4-1bb抗体，或联合治疗，进行治疗，如所示。每周测量两次肿瘤生长。通过将肿瘤大小除以在第14天的初始肿瘤大小来计算相对肿瘤大小。如图14所示，克隆3712-igg1v和抗pd-1的组合与任一单一药物治疗组相比，导致对肿瘤生长的更显著抑制。单药物抗pd-1、克隆3712-igg1v和联合组的第52天研究终止的tgi值分别为42％、66％和91％。
[0307]
实施例6：cd137抗体的表位图
[0308]
cd137受体蛋白的细胞外部分由四个结构域组成。cd137受体人/小鼠嵌合体的基因使用标准实验室技术合成。不同的嵌合体是通过将人cd137受体的结构域或模块与相应的小鼠cd137受体交换而设计的。嵌合体是基于人类和小鼠序列的评估以及人类cd137受体的3d研究而设计的。合成的基因被分配了项目特定的id号(见表11)。
[0309]
表11.嵌合构建体的身份
[0310][0311][0312]
以标准elisa格式分析了克隆3712-igg1v与嵌合cd137受体蛋白的结合。对于图16a-b中显示的数据，将克隆3712-igg1v在dpbs中稀释至1μg/ml，然后以体积为50μl(0.05μg)/孔包被到elisa板(corning，目录号：9018，高度结合)中，并在4℃温育过夜。将板倾倒并洗涤一次；以200μl/孔添加测定稀释剂。在室温下温育一小时后，将板用pbst洗涤一次。将cd137受体人/小鼠嵌合体在测定稀释剂中稀释至100或10μg/ml，然后在测定稀释剂中连续
稀释4倍11个点，最终浓度为100000、25000、6250、1562.5、390.63、97.66、24.41、6.10、1.53、0.38和0.095ng/ml，或10000、2500、625、156.25、39.06、9.77、2.44、0.61、0.15、0.038和0.0095ng/ml。将稀释的cd137受体加入测定板，50μl/孔，一式两份。将板在室温下温育一小时，然后用pbst洗涤三次。以1:100,000 20稀释度偶联的山羊抗人igg-h l hrp以100μl/孔添加到板中。然后将板在室温下温育一小时，然后用pbst洗涤四次。将tmb底物溶液以100μl/孔加入。使颜色显色15分钟，并用100μl/孔2n h2so4终止。由tecan f200 pro读数器测定450nm和620nm处的吸光度。
[0313]
对于图16c-d中显示的数据，将嵌合cd137受体蛋白样品在dpbs中稀释至5μg/ml，然后以50μl(0.25μg)/孔包被到elisa板(corning，目录号：9018，高结合)上，并在4℃温育过夜。将板倾倒并洗涤一次；以200μl/孔添加测定稀释剂。在室温下温育1小时后，将板用pbst洗涤一次。将克隆3712在测定稀释剂中稀释至100或10μg/ml，然后在测定稀释剂中连续稀释4倍11个点，最终浓度为100000、25000、6250、1562.5、390.63、97.66、24.41、6.10、1.53、0.38和0.095ng/ml，或10000、2500、625、156.25、39.06、9.77、2.44、0.61、0.15、0.038和0.0095ng/ml。将稀释的克隆3712加入测定板，50μl/孔，一式两份。将板在室温下温育1小时，然后用pbst洗涤三次。以1:100,000稀释度偶联的山羊抗人igg-h l hrp或以1:50,000稀释的山羊抗小鼠igg(h l)二抗hrp，10，以100μl/孔添加到板中。将板在室温下温育1小时，然后用pbst洗涤四次。将tmb底物溶液以100μl/孔加入。使颜色显色15分钟，然后加入100μl/孔的2n h2so4以终止反应。由tecan f200 pro读数器测定450nm和620nm处的吸光度。
[0314]
测试的人cd137抗体均不与鼠cd137结合。因此，如果给定抗体不与特定嵌合体结合，则表明该抗体对在该嵌合体中已被鼠结构域取代的结构域之一具有特异性。
[0315]
克隆3712的结合模式表明，对结合至关重要的氨基酸残基可能位于结构域2和3(crd2-3)，与分别与crd3-4和crd1-2结合的乌瑞芦单抗和乌托米单抗(chin et al.,2018；li et al.,2018)形成对比。
[0316]
实施例7:其他抗cd137人源化抗体的评估
[0317]
(i)结合亲和力
[0318]
cd137抗原结合的kd测量根据上面实施例2中描述的方案进行。在octet red 96上的抗原结合测定中测试嵌合抗体和人源化抗体以估计结合动力学。将抗体加载到抗人fc(ahc)生物传感器上。将加载的传感器浸入测定缓冲液(含0.1％bsa、0.02％tween-20(ph7.2)的pbs)中连续稀释的cd137蛋白(300nm，1:3下降，7个点)中。使用单价(1:1)模型计算的动力学常数显示在下表12中。除了克隆3714，与亲本嵌合参考抗体371相比，所有人源化抗体都显示出相似或略低但可接受的亲和力。
[0319]
表12.人源化抗cd137抗体的动力学常数
[0320]
加载样品idkd(m)on(1/ms)kdis(1/s)371(嵌合体)3.9e-092.8e 051.1e-0337112.50e-091.90e 054.60e-0437121.00e-083.10e 053.10e-0337133.80e-092.90e 051.10e-033714《1.0e-121.30e 05《1.0e-0737155.90e-093.10e 051.80e-03
37167.00e-093.20e 052.20e-0337172.30e-091.50e 053.40e-0437188.30e-093.10e 052.60e-0337198.50e-093.10e 052.60e-03
[0321]
根据实施例2中描述的方案通过t细胞功能测定对抗体进行评估。克隆3711、3714和3717表现出低t细胞刺激活性(图15)。
[0322]
(ii)克隆3712和cd137配体与cd137受体的竞争性结合
[0323]
cd137l和克隆3712与cd137受体结合的竞争以标准elisa格式确定。将克隆3712与cd137受体的竞争性结合特性与参考抗cd137抗体371、370、372、375、390和402的那些进行比较(参见wo2019/113039，其相关公开内容以引用方式并入以用于在此提及的主题和目的)。将cd137受体在dpbs中稀释至1μg/ml，然后以体积为50μl(0.05μg)/孔包被到elisa板(corning，目录号：9018，高度结合)中，并在4℃温育过夜。将板倾倒并洗涤一次；以200μl/孔添加测定稀释剂。在室温温育一小时后，用pbst洗涤板一次。将克隆3712、371、370、372、375、390、402和ssi-361(阴性对照抗体)在测定稀释剂中稀释至9μg/ml，然后在测定稀释剂中连续稀释11个点至终浓度为9000、3000、900、300、90、30、9、3、0.9、0.3和0.09ng/ml。将稀释的cd137受体加入测定板，50μl/孔，一式两份。将板在室温下温育一小时。将cd137l在测定稀释剂中稀释至6μg/ml，然后在测定稀释剂中连续稀释11个点至终浓度为6000、2000、600、200、60、20、6、2、0.6、0.2、0.06ng/ml，达到这些系列浓度，或稀释至40ng/ml的终浓度。将稀释的cd137l加入测定板，50μl/孔，一式两份。将板在室温下温育一小时，然后用pbst洗涤三次。以1:100,000 20稀释度偶联的山羊抗人igg-h l hrp以100μl/孔添加到板中。然后将板在室温下温育一小时，然后用pbst洗涤四次。将tmb底物溶液以100μl/孔加入。使颜色显色15分钟，并用100μl/孔2n h2so4终止。由tecan f200 pro读数器测定450nm和620nm处的吸光度。
[0324]
图17中显示的结果表明，克隆3712与cd137受体的结合部分阻断了cd137受体与cd137l的结合。
[0325]
实施例8：克隆3712在a375 npg小鼠体内黑色素瘤模型中的功效评估
[0326]
将上述克隆3712的人源化vh和v
l
序列用于构建包含人iggl/κ的fc区(seq id no：6和7)的抗cd137抗体(上文实施例3中公开的克隆3712-igg1v))，其包含人igg1的fc变体。根据上面实施例3中描述的方法，将3712-igg1v克隆到表达载体中，用于在瞬时表达cho细胞和稳定cho细胞系中生产。
[0327]
细胞培养
[0328]
a375细胞系获自icell bioscience inc，并作为单层培养物在补充有10％热灭活胎牛血清的dmem培养基中在37℃、在空气中5％co2的气氛中体外维持。将肿瘤细胞通过胰蛋白酶-edta处理每3-5天常规传代培养一次。收获生长在指数生长期的细胞并计数用于肿瘤移植。
[0329]
动物
[0330]
将joinn实验室公司提供的npg(nod-prkdc
scid
il2rg
null
)小鼠用于该研究，其全部是雄性，4周龄，体重约19-31g。总共20只小鼠按体重随机分为3组。
[0331]
人免疫细胞和肿瘤移植
[0332]
通过磁激活细胞分选(macs)从外周血干细胞(pbsc)中分离出g-csf动员的外周血cd34( )造血干细胞，然后通过骨髓腔移植，移植到亚致死剂量x射线照射的npg小鼠中。移植后12周后，在每只小鼠的右侧皮下移植在0.2ml pbs中的2
×
106个a375细胞。
[0333]
免疫调节剂处理
[0334]
第1组小鼠用pbs处理，第2组小鼠用克隆3712-igg1v以5mg/kg每周两次通过静脉注射处理，从第1天开始，第4天、第8天、第11天、第15天、第18天、第22天、第25天和第29天，总共9剂。
[0335]
终点
[0336]
从第4天开始，使用游标卡尺在两个维度上每周测量两次肿瘤，使用公式v＝0.5a
×
b2以mm3为单位表示体积，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。该研究的主要终点是肿瘤生长抑制(tgi)。tgi表示为：tgi(％)＝100
×
(1-t/c)。t和c分别是治疗组和对照组在第29天的平均肿瘤体积。
[0337]
如图18所示，与pbs处理的对照组(组1)相比，3712-igg1v(组2)的处理表现出显著的肿瘤生长抑制(tgi＝41％，p＝0.09)。
[0338]
实施例9：细胞因子释放活性评估
[0339]
使用人全血和pbmc的体外细胞因子释放分析表明，3712-igg1v(无论是可溶性形式还是固体形式)诱导细胞因子释放风暴的风险较低，并且是与cd28激动性抗体(tgn1412)和cd3激动性抗体(okt3)相比。
[0340]
(i)可溶性3712-igg1v诱导的高密度预培养pbmc的细胞因子释放
[0341]
在高密度培养实验中测试了来自四名健康供体的pbmc，以评估可溶性3712-igg1v诱导细胞因子的潜在风险。cd28激动剂抗体tgn1412和cd3抗体okt3用作阳性对照，而阿瓦斯汀用作阴性对照。分析抗体处理后2和24小时的培养物上清液的ifn-γ、tnf-α、il-6和il-2的水平。在2小时时间点，测试的抗体均未诱导这些细胞因子的变化。在24小时，tgn1412和/或okt3导致所有供体的ifn-γ、tnf-α、il-6和il-2升高，但3712-igg1v以及阿瓦斯汀在很宽的浓度范围内(从3ng/ml至300μg/ml)未引起任何明显变化。数据表明，3712-igg1v诱发细胞因子风暴的风险可以低。
[0342]
(ii)板结合3712-igg1v诱导pbmc的细胞因子释放
[0343]
将板结合的3712-igg1v在具有来自四名健康供体的pbmc的培养物中进行了测试，以评估其诱导细胞因子产生的能力。cd28激动剂抗体tgn1412和cd3抗体okt3用作阳性对照，而阿瓦斯汀用作阴性对照。分析温育后2和24小时的培养物上清液的ifn-γ、tnf-α、il-6和il-2的水平。在2小时时间点，测试的抗体均未诱导这些细胞因子的变化。在24小时，tgn1412和/或okt3导致所有供体的ifn-γ、tnf-α、il-6和il-2升高，供体1中tnf-α和il-6例外，但3712-igg1v以及阿瓦斯汀在很宽的浓度范围内(从0.1ng/ml至100μg/ml)未引起任何明显变化。数据表明，3712-igg1v诱发细胞因子风暴的风险可以低。
[0344]
(iii)可溶性3712-igg1v诱导全血细胞因子释放
[0345]
3712-igg1v(lyv1)的免疫调节活性也使用来自15名健康供体的组的全血样本进行了检查。将抽血后4小时内的全血与3712-igg1v或对照温育。使用luminex平台评估血浆中细胞因子的水平。用pwm培养的全血用作阳性对照，用pbs培养的全血用于确定背景反应。检查血浆样品的il-6、il-8、il-10、ifn-γ和tnf-α。正如预期的，与用pbs温育的全血相比，
用阳性对照pwm温育全血导致所有细胞因子的分泌显著增加。
[0346]
为了根据临床报告的数据对样本生成的数据进行基准测试，并行运行两种具有已知细胞因子释放率的临床抗体lemtrada和erbitux。erbitux被认为具有低水平的输液相关反应，并被用于设定阳性细胞因子释放的基线。相比之下，lemtrada与临床中的高输液反应率有关(bugelski,achuthanandam,capocasale,treacy,&bouman-thio,2009)，并被用于建立高反应临床对照。
[0347]
用lemtrada处理全血后的il-6、il-8、il-10、ifn-γ和tnf-α的平均水平显著高于3712-igg1v或处理的培养物。统计分析显示，与相比时，响应于3712-igg1v产生的il-6、il-10、ifn-γ和tnf-α水平之间没有显著差异，无论浓度如何。
[0348]
总之，3712-igg1v对细胞因子释放的影响在一组综合体外试验中考察了24小时，包括在细胞因子释放测定前的人pbmc的高密度预培养，以及健康供体的人全血。将3712-igg1v包被到培养板上后进行测试，然后与人pbmc一起培养2小时和24小时，然后进行细胞因子检测。3712-igg1v以及临床参考抗体或在这些测定中没有显示出明显的诱导细胞因子释放的活性，这表明3712-igg1v在人体中诱导细胞因子风暴的风险较低。
[0349]
实施例10：食蟹猴的药代动力学和毒理学研究
[0350]
基于靶序列同源性、保守的结合亲和力和fcγriib依赖性cd137激动作用，食蟹猴被确定为唯一用于评估3712-igg1v的pk和安全性的药理学相关非临床物种。
[0351]
药代动力学研究
[0352]
为了了解静脉输注后3712-igg1v的pk曲线，在人中的预期施用途径，两项单剂量(3、10或30mg/kg，或0、10、30或100mg/kg)研究和一项重复剂量研究(0、10、30或100mg/kg)，在幼稚食蟹猴中进行。
[0353]
单剂量药代动力学
[0354]
在单次静脉注射3712-igg1v后，所有动物均达到全身暴露，无显著性别差异。剂量归一化全身暴露(auc和c
max
)数据表明，在3-100mg/kg剂量范围内呈线性动力学模式。平均t
1/2
范围为64.6至133小时，cl范围为0.355至0.488ml/hr/kg，平均vdss范围为54.9至69.7ml/kg，剂量范围为3-30mg/kg，表明3712-igg1v推测分布在血液中并从循环中缓慢消除。在大多数动物中检测到抗3712-igg1v抗体(ada)的形成，在接受较低剂量的动物中发生率较高，表明3712-igg1v在猴子中具有免疫原性。
[0355]
重复剂量药代动力学
[0356]
重复剂量pk与在食蟹猴中进行的重复剂量毒理学研究相结合进行评估。重复静脉注射3712-igg1v(qw
×
5，0、10、30或100mg/kg)后，在10和30mg/kg组动物中观察到全身暴露显著减少，这可能是由于增加的清除率和ada的影响。ada的形成主要在低剂量组中检测到，因为10、30和100mg/kg组中的10/10、8/10和2/10动物分别在第29天发现呈阳性。ada在10和30mg/kg组中的高发生率损害了我们准确评估pk的能力。在大多数动物为ada阴性的100mg/kg剂量组中，注意到轻度积累，雄性的积累比(ar)为1.6，雌性的为1.7。
[0357]
毒理学研究
[0358]
对接受3712-igg1v的人类的潜在风险的评估是在两项符合us-glp的毒理学研究中对幼稚食蟹猴进行的。第一项是单剂量研究，以评估静脉输注3712-igg1v(0、10、30或
100mg/kg)的潜在急性毒性并确定最大耐受剂量(mtd)。第二项是关键的29天重复给药毒性研究，通过五次静脉输注进行，施用0、10、30或100mg/kg，qw，持续29天，恢复期为6周。评估了潜在的靶器官和亚慢性毒性，以及任何毒性的可逆性、持久性或延迟发生。作为重复给药一般毒理学研究的一部分，还评估了安全药理学和注射部位反应。
[0359]
单剂量毒性
[0360]
进行了一项符合us-glp的单剂量毒理学研究，以评估3712-igg1v在幼稚食蟹猴中的潜在急性毒性。总共八只猴子被分配到4个组(1/性别/组)并通过60分钟的静脉内输注接受0(载体)、10、30或100mg/kg的3712-igg1v。给药后观察动物14天，以评估生存力、临床观察、体重、食物消耗、临床病理学(血液学、血清化学、凝血和尿液分析)、毒代动力学(tk)和免疫原性。此外，还进行了免疫毒性(细胞因子)、淋巴细胞表型和可溶性靶抗原的非glp兼容分析。在第15天，对所有动物进行尸体剖检并进行大体(宏观)和组织病理学(微观)检查。
[0361]
在研究过程中没有意外死亡。未观察到对临床观察、体重、食物消耗、临床病理、免疫毒性或淋巴细胞表型的治疗相关影响。此外，尸检没有发现与测试品相关的宏观或微观发现。
[0362]
3712-igg1v的全身暴露(c
max
和auc
0-168
)表现出随着剂量的增加成比例增加，并且在任何剂量水平的全身暴露中都没有观察到明显的性别差异。分别地，ada在接受0、10、30和100mg/kg 3712-igg1v的动物的1/2、1/2、1/2和1/2中呈阳性。然而，在10mg/kg组中，除一只雌性动物外，其他所有动物的效价都非常低(0、10、30和100mg/kg组在第14天的值分别为36、1120、70和12))。静脉输注克隆3712-igg1v后，血清cd137蛋白呈剂量依赖方式从基线水平0.1ng/ml增加至1.3ng/ml，表明在食蟹猴的循环中3712-igg1v可以结合并稳定cd137蛋白。
[0363]
总之，单次静脉输注10、30、100mg/kg的3712-igg1v耐受性良好。因此，认为食蟹猴中单次静脉注射3712-igg1v的mtd不低于100mg/kg。
[0364]
重复剂量毒性
[0365]
3712-igg1v的潜在亚慢性毒性作用在符合us-glp的29天重复给药毒理学研究中对食蟹猴进行了研究。研究设计包括42天的恢复阶段，以评估不良影响的可逆性、持续性或任何延迟发生。总共40只猴子被分为4组(5只/性别/组)，并接收0(载体)、10、30和100mg/kg的3712-igg1v的60分钟静脉内输注，每周一次，持续29天(qw
×
5)。在开始给药时，猴子的年龄约为2.5至3.5岁，体重范围为2.0至2.7kg。在第30天，对主要组动物(3只/性别/组)实施安乐死并进行尸检，而对恢复组动物(2只/性别/组)再观察42天，直到第71天实施安乐死。
[0366]
对动物的死亡率、临床观察(包括注射部位观察)、体重、食物消耗、体温、安全药理学(ecg、心率、血压、呼吸参数和神经学检查)、眼科检查、临床病理学(血液学、凝血、血清化学和尿液分析)、tk、免疫原性(ada分析)、器官重量和大体病理学和组织病理学检查进行评估。此外，还进行了免疫毒性(细胞因子)、淋巴细胞表型和可溶性靶抗原的非glp兼容分析。
[0367]
在所有动物中都实现了全身暴露。第1次静脉输注后全身暴露没有性别差异，并且全身暴露(auc0-168h和cmax)按剂量成比例增加。在第29天，分别在10、30和100mg/kg组的10/10、8/10和2/10只动物中检测到ada的形成。在第4次给药后，在10mg/kg组中观察到全身暴露减少，其中ada形成对药物暴露的影响显著。然而，在100mg/kg组中观察到轻度积累，其中大多数动物是ada阴性。
[0368]
在研究过程中没有发生意外死亡。在临床观察、注射部位的局部刺激、体重、食物消耗、体温、安全药理学、眼科检查、临床病理学(血液学、凝血、凝血和尿液分析)、安全性药理学(心电图、血压、心率、呼吸和神经系统检查)、免疫学(b和t淋巴细胞表型、细胞因子分析)或病理变化(器官重量、宏观和微观观察)方面，没有与试验品相关的变化。在临床病理学和免疫学参数中观察到的所有差异都不被认为与测试品相关，因为它们的幅度很小，与剂量无关，和/或在该实验室的历史参考范围内。
[0369]
总之，重复静脉输注3712-igg1v至雄性和雌性食蟹猴10、30或100mg/kg，持续29天(qw
×
5)，耐受性良好。未发现与测试品相关的毒性或毒性器官。在本研究中，未观察到不良反应水平(noael)被认为是100mg/kg。在该剂量水平，第4次给药后的平均c
max
和auc
0-168
分别对雄性为4930μg/ml和355000μg
·
h/ml，对雌性为4010μg/ml和300000μg
·
h/ml。
[0370]
其它实施方案
[0371]
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合来组合。本说明书中公开的每个特征可以通过充当相同、等效或类似目的的替代性特征替代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是等效或类似特征的通用系列的实例。
[0372]
通过以上描述，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特性，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，其它实施方案也在权利要求范围内。
[0373]
等效物
[0374]
尽管本文已经描述和展示了若干个本发明实施方案，但本领域的普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得结果和/或本文所述的优点中的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且此类变异和/或修改中的每一个均被视为在本文所述的本发明实施方案的范围内。更一般地，本领域的技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置意味着示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明教导的一种或多种具体应用。仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所述的具体本发明实施方案的许多等效物。因此，应理解，前述实施方案仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，可以以不同于具体描述的和要求保护的方式来实践本发明实施方案。本公开的本发明实施方案涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包含在本公开的发明范围内。
[0375]
本文中定义和使用的所有定义都应当理解为对字典定义的控制、通过引用并入的文件中的定义和/或定义术语的普通含义。
[0376]
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请相对于各自所引用的主题而并入本文，在一些情况下，其可能涵盖整个文件。
[0377]
除非清楚地相反地指出，否则如本文中在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”应理解为意指“至少一个”。
[0378]
如本文中在说明书和权利要求中所使用的，短语“和/或”应当理解为意指如此联合的要素中的“任一个或两个”，即要素在一些情况下结合地存在而在其它情况下分开存在。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式理解，即如此联合的要素中的“一个或多
个”。除了通过“和/或”从句具体标识的要素之外，还可以任选地存在其它要素，而无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言，如“包括”结合使用时，对“a和/或b”的引用在一个实施方案中可以仅指代a(任选地包含除了b之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指代b(任选地包含除了a之外的要素)；在又另一个实施方案中，指代a和b两者(任选地包含其它要素)；等。
[0379]
如本文中在说明书和权利要求中所使用的，“或”应被理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包含多个要素或要素列表中的至少一个要素、但是还包含多于一个要素，以及任选地另外未列出的项。只有明确地指示相反的术语，如
“……
中的仅一个”或
“……
中的恰好一个”或者在权利要求中使用时“由
……
组成”将指代包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。通常，当之前有排他性术语，如“任一个”、
“……
之一”、
“……
中的仅一个”或
“……
中的恰好一个”时，如本文中所使用的术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代方案(即“一个或另一个而非两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由
……
组成”应具有如在专利法领域中所使用的普通含义。
[0380]
如本文中在说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应被理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不必要包含要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个并且不排除要素列表中的要素的任何组合。这个定义还允许可以任选地存在除了短语“至少一个”所指代的要素列表内具体标识的要素之外的要素，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“a和b中的至少一个”(或等效地，“a或b中的至少一个”，或等效地“a和/或b中的至少一个”)在一个实施方案中可以指代至少一个，任选地包含多于一个a，而不存在b(并且任选地包含除了b之外的要素)；在另一个实施方案中指代至少一个、任选地包含多于一个b，而不存在a(并且任选地包含除了a之外的要素)；在又另一个实施方案中指代至少一个、任选地包含多于一个a，以及至少一个、任选地包含多于一个b(并且任选地包含其它要素)；等。
[0381]
还应该理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包含多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述方法的步骤或动作的顺序。