一株防治荔枝霜疫病的内生生防菌株HN075及其应用的制作方法

一株防治荔枝霜疫病的内生生防菌株hn075及其应用
技术领域
1.本发明属于农作物病害防治技术领域，具体涉及一株防治荔枝霜疫病的内生生防菌株 hn075及其应用。


背景技术：

2.由荔枝霜疫霉(peronophythora litchii chen ex ko et al)引起的荔枝霜疫病严重威胁着我国荔枝产业的健康发展，是荔枝生产及采后危害最为严重、影响最为广泛的病害。该病可以侵染嫩叶、嫩枝、花穗及果实，引起大量花穗和果实腐烂，一般年份可造成10％-30％的产量损失，流行年份可造成80％的产量损失，在广东、广西、福建，海南等地发生尤为严重，严重影响我国荔枝产业发展，造成重大的经济损失。
3.目前缺乏抗荔枝霜疫病的品种，防治该病的主要还是依赖使用化学药剂，其中栽培抗病品种是防治该病最经济、最有效、最简便的方法，但是在短时间内选育出抗荔枝霜疫病的新品种是非常困难的。农药对农业的发展虽然起着重要的作用，但随着社会的发展，伴随化学农药引起的安全及环境问题也日益凸显。使用化学农药不仅缺乏长期的有效性，而且对食品和环境的污染，对人类健康潜在的危害、对非靶标生物的影响以及导致病原菌抗药性产生等问题，现已受到越来越多的质疑。因此，生物防治尤其是拮抗微生物的利用受到普遍关注和重视，探索有效的生防途径无疑有着重大的理论意义和实用价值。
4.芽孢杆菌(bacillus spp.)是土壤和植物微生态区系的优势生物种群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在植物的根、茎部。目前该菌已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示出很好的病害防治效果。由于枯草芽孢杆菌具有生长快、营养简单以及产生耐热、抗逆芽孢等突出特征，而使其不仅有利于生防菌剂在生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，并且批量生产工艺简单，成本较低，施用方便，储存期长，现已成为一种理想的生防细菌。许多性状优良的天然分离株已成功应用于植物病害的生物防治。芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。其主要防治对象为丝状真菌及卵菌所引起的植物病害。芽孢杆菌是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有极强的抗逆能力。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术的不足，本发明针对目前荔枝霜疫病严重发生，且面积逐年扩大，化学防治造成环境污染的问题，提供一株防治荔枝霜疫病的内生生防菌株hn075及其应用。
6.本发明技术方案主要包括以下内容：
7.一株防治荔枝霜疫病的内生生防菌株hn075，经形态观察、培养特征观察和分子生
物学研究鉴定为芽孢杆菌(bacillus spp.)，已于2020年11月30月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no.21270。
8.本发明还提供了由所述内生生防菌株hn075发酵制成的生防菌剂，其制备方法如下：
9.将内生生防菌株hn075的种子液接种于发酵培养基中进行发酵得发酵液，将发酵液离心后过滤，即得所述生防菌剂；发酵条件为：接种量5％(v/v)，发酵培养基ph值7.0～7.2，培养温度37℃，摇床转速180r/min，培养时间48h。
10.优选的，所述发酵培养基为：每1000ml发酵培养基中含有10g胰蛋白胨、5g酵母粉、 5g氯化钠、15g琼脂粉和余量的蒸馏水。
11.优选的，所述生防菌剂的使用方法是：在荔枝枝条、叶片或果实上喷雾使用；连续使用 2～3次，每次间隔7～10天。
12.本发明还提供所述的内生生防菌株hn075在防治荔枝霜疫病方面的应用。
13.另一方面，本发明还发现优化后的发酵培养基具有防治荔枝霜疫病的效果，所述发酵培养基为：每1000ml发酵培养基中含有10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠、15g琼脂粉和余量的蒸馏水；发酵培养基ph值7.0～7.2。
14.本发明所取得的效果：
15.本发明生防菌分离自荔枝叶片，有利于充分发挥菌株的优势，在荔枝叶片及荔枝果实内定殖能力强，防治效果好且稳定。
16.本发明筛选出的生防菌株hn075抑菌作用强，能够明显抑制荔枝霜疫霉菌的生长。由于是从荔枝叶片分离的内生有益菌，没有化学农药的使用带来的一系列问题，对减少农业污染，且能有效防治荔枝霜疫病。
17.本发明生防菌培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
18.本发明发现优化后的发酵培养基对荔枝霜疫病具有防治效果。
附图说明
19.图1为生防菌直接抑制试验效果图。
具体实施方式
20.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
21.实施例1：内生生防菌株的分离
22.取荔枝叶片先用自来水冲洗干净，再用灭菌水清洗3～5次，将表面清洗干净，接着用75％酒精漂洗3min，进行表面消毒，无菌水清洗3次；升汞处理10～15分钟，无菌水清洗3次后晾干。在无菌研钵内加入10ml无菌水和少许灭菌后的石英砂，分别将表面处理后的叶片组织在超净工作台无菌环境中研磨成匀浆，加盖静置30min，将均浆稀释成10、100、1000倍液，分别用移液器吸取50μl至准备好的na平板上，用涂布棒均匀涂布在培养基上让其生长，48h后挑取单菌落，在平板上进行纯化保存，即获得内生菌菌株hn075。
23.实施例2：菌株hn075的鉴定
24.1、形态特征观察
25.将菌株hn075划线接种于lb培养基(5g酵母粉、l0 g胰蛋白胨、5g氯化钠和15g琼脂粉加蒸馏水定容至1000ml，溶解并调ph为7.0～7.5，高压灭菌备用)。37℃培养48h后进行菌落特征和形态特征观察。
26.菌落特征：该菌株菌落为圆形，乳白色，不透明，边缘整齐，中央凸起，表面湿润、略黏稠。
27.形态特征：菌株hn075菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，两端钝圆，内生芽孢，芽孢椭圆形，芽孢囊不膨大，中生到次端生。根据形态特征初步判断菌株hn075属于芽孢杆菌属 (bacillus sp)。
28.2、分子生物学鉴定
29.基因组提取试剂盒提取菌株hn075的基因组dna后，采用通用引物l1: 5-agtcgtaacaacgtagccgt-3’和l2:5-gtgccaaggcatccacc-3’，进行16s rdna 的pcr扩增。回收pcr扩增产物，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆测序，将所得序列提交到genbank数据库进行blast分析比对，发现其与枯草芽孢杆菌有99.8％以上的序列同源性。结合形态学特征和培养特征，将菌株hn075鉴定为芽孢杆菌(bacillus spp.)。
30.实施例3：菌株hn075对荔枝霜疫霉菌的抑制作用
31.生防菌直接抑制试验：活化荔枝霜疫霉菌后，在培养皿正中央接种荔枝霜疫霉菌菌块(5 mm)，蘸取菌株hn075的菌液，在距菌块中心2.5cm的两侧对称划线，重复3次实验，放于25℃恒温培养箱中暗培养5d后，观察抑菌带大小(图1)。
32.生防菌发酵液抑制试验：将菌株hn075接种于lb平板上活化20h，用接种环挑取单菌落于lb液体培养基中(200/500ml三角瓶)，置于37℃、180r/min恒温震荡摇床上培养 48h，得到发酵液备用。取菌株hn075的无菌体发酵液20ml分别加入到融化的200ml冷却至45℃左右的pda培养基中混合倒平板，制成不同浓度无菌体发酵液的抑菌平板，在平板中央接种直径大小为5mm菌丝块，用无菌水替代发酵液作为对照。每个处理重复3次，置于37℃培养箱中培养，5～7d后以十字交叉法测量的菌丝生长直径。
33.实施例4：菌株hn075发酵工艺的优化
34.将菌株hn075接种于lb液体培养基中37℃，180r/min，培养24h，制成种子液，取10 ml种子液接种于发酵培养基中培养。经优化后得到的发酵培养基配方为：发酵培养基配方为： 10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠和15g琼脂粉加蒸馏水定容至1000ml，溶解并调ph 为7.0～7.2。通过对培养条件的摸索，得到最佳发酵条件为：接种量5％(v/v)、装瓶量100ml /250ml，发酵培养基ph值7.0～7.2，37℃，180r/min，培养48h，制成浓度约为108cfu/ml 的菌株hn075发酵液。将发酵液经4℃，8000r/min离心20min后，用0.22μm细菌过滤器过滤，得无菌体发酵液(即为hn075生防菌剂)。
35.实施例5：菌株hn075发酵液田间防效应用
36.荔枝品种为妃子笑，实验地为常年荔枝霜疫病常年发生地。试验地土壤为壤质土，有机物含量一般，正常肥水管理。种植密度：株距4m，行距6m，树龄12年，生育期为开花至结果期。试验共设5个处理，每处理小区2棵树，共20个小区，4次重复。定果穗，标记后全面喷药处理，每株标记10枝果穗，应用摇摆式的高压喷雾器进行全株均匀喷施，喷药量以叶面滴水为止。在荔枝二次开花期、荔枝生理落果初期、果径0.5厘米左右各喷药1次，共用药3次。在病情基本稳定时进行调查。
37.对标记果穗进行调查，分别调查每穗总果数、发病果数、果发病级别。果的发病级别是根据病斑面积占整个果表面积的比例进行划分。
38.病情分级标准如下：0级：果上无病斑；1级：果上有1～2个褐色小病斑；3级：果上有 3～4个褐色小病斑；5级：果上病斑达果表面积1/4；7级：果上病斑达果表面积1/3，部分已连片；9级：果上病斑达果表面积1/2，并出现腐烂。按照公式(1)和(2)计算防效效果：
39.病情指数＝∑(各级病果数
×
相对病级数值)
÷
(调查总果粒数
×
9)
×
100％
40.防治效果(％)＝[(ck病情指数—处理病情指数)
÷
ck病情指数]
×
100％
[0041]
实验结果表明(表1)，hn075生防菌剂(参见实施例4)能够显著降低荔枝霜疫病的病情指数，防治效果高达72.20％，仅略低于化学农药50％甲霜灵可湿性粉剂600倍液的防治效果82.79％。另外从表中还可以看出，发酵培养基(参见实施例4)处理的病情指数略低于清水对照处理的病情指数，发酵培养基也起到防治作用。实验结果说明，菌株hn075能够有效防治荔枝霜疫病，展现出良好的应用潜力。
[0042]
表1.菌株hn075发酵液对荔枝霜疫病的防治效果
[0043][0044]
注：同列不同小写字母表示数值间差异显著(p《0.05)
[0045]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。