一种等分流道的样品测试卡及加样方法及应用与流程

1.本发明属于微生物检测技术领域，特别是涉及一种等分流道的样品测试卡及加样方法及应用。


背景技术：

2.微生物样品测试卡已经针对性地涉及法国梅里埃公司的美国专利第5609828号描述的测试卡和法国梅里埃公司的中国专利cn21154744b《改进的样品测试卡》；以及中国专利cn110987814b《一种样品测试卡及其加样方法》，其中专利第5609828号描述的测试卡已经用于商业化自动化仪器中。
3.梅里埃公司的专利采用光学强度原理检测方法，我公司专利采用微观显微图像识别原理的新方法；另外，解决池间污染问题分别采用了不同的方式：专利第5609828号通过增加反应池与反应池之间的流道距离而减少池间污染的可能性；专利cn21154744b提出改进新方法，引入与流通网络相连的流动储器和溢流储器，溢流储器可吸去流道和流动储器中的液体样品，使流动储器和流道中被空气填充，由此产生空气屏障或气闸作用，防止池对池的污染。由于梅里埃的检测原理是光透射法测量浊度和颜色，反应池内应避免气泡的存在产生对检测的干扰，反应池必须填满样品。中国专利cn110987814b采用显微图像识别原理,反应池不充满液体样品，反应池和流道中的空气将每个反应池隔离，使每个反应池完全独立，彻底解决池间污染。
4.综合现状，现有产品和发明存在如下不足之处：由于梅里埃测试卡采用透射光强检测原理，专利要求加样时反应池必须填满，以防止气泡存在影响检测的稳定性。另外，为使反应池内微生物生长，透明密封膜必须具有透气性(注：专利没有涉及，属于保密工艺)，从而增加了实用产品的工艺难度；另外，反应池在充满的情况下，池内微生物生长产生的代谢气体引起池内压力的变化，池内的液体样品可能会压回到非常小的流动储器内，使池间液体重新连到一起，产生更快的池间污染，所以现有发明专利cn21154744b存在缺陷，至今没有在产品中采用。再者，为实现反应池充满，使得该方法不能适用于高海拔地区。中国专利cn110987814b采用微观显微图像识别原理的检测方法，观测腔不受池内气泡影响，反应池可以不充满液体样品，反应池中的空气将每个反应池隔离，使每个反应池完全独立，彻底解决池与池之间的污染，克服了梅里埃专利的不足。然而在使用过程中，通过控制加样过程中的负压实现定量加入样品量，然后机构完成空气的切换加入，操作过程较复杂，干扰因素多，可靠性差；另外，本公司专利测试卡在加样过程中，样品从吸入口进入，先到达最近距离的反应池中，距离较远处的反应池后进入样品，虽然通过延长加样时间，调整压力的变化，使每个池之间的加样量的差值控制在一定范围之内，但误差的存在是显而易见的；再者，当前所有专利从结构原理和实际效果都存在着难以控制的池间加样量的误差，其根本原因是每个反应池所连接的流道存在差异，反应池在整体布局中所处的状态存在差异，必然影响加样的精度，尤其在采用更微量的显微观测方法时影响更大；因此，为简化应用环节的操作过程，降低实现产品化的难度，提高产品的可靠性，从根本上解决加样的精确度问题，提出
新的设计思想。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种等分流道的样品测试卡及加样方法及应用，通过等效的样品反应池分布和流道网络布局，每个样品反应池连接等效流道网络的设计方法，使更多的样品反应池均匀布局在测试卡上，并且只需简单控制测试样品液总量即可实现样品反应池的等量精确加样。样品反应池内测试样品液和/或其他非水溶性液体和/或空气均占有相同的比例空间；样品反应池之间相互隔离，避免污染；并且能够为封闭状态下样品反应池内的生物样品的生长，提供所必须的空气量。
6.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
7.本发明为一种样品测试卡，所述样品测试卡为平板状结构，所述样品测试卡内部密封布局有多个样品反应池、一个流体引入口和流道网络，所述流道网络将流体引入口和样品反应池相连通；所述样品测试卡的样品反应池内部设置有透明凸柱；所述透明凸柱将样品反应池分为存储腔和观测腔。
8.样品测试卡，优选地采用装配的方式组成样品测试卡的整体，所述样品测试卡包括主体卡、上盖板和密封膜，所述主体卡上均匀阵列有柱形凹槽，所述柱形凹槽为样品反应池；所述上盖板下表面均匀阵列有透明凸柱，所述上盖板上表面开设有流道网络；所述密封膜粘贴覆盖在布有流道网络的上盖板上表面，形成封闭的流道网络；所述主体卡上的柱形凹槽与上盖板的透明凸柱相对应，所述主体卡和上盖板粘合在一起形成密封的样品反应池和密封的流道网络，生成完整的样品测试卡。样品测试卡可以包括64、128、192、256个或更多的反应池，接纳多种液体生物样品，用于显微观测或光强的自动化分析。
9.其中可以理解为，所述样品测试卡内部开设有等分设计的流道网络；流体引入口与每一个样品反应池之间的流道都经过相同层数的n层次等分，n为非零自然数；其中，相同的第n层次进行同样的一分m个，m为≥2的整数,每个层次的一分m个的节点处的各分支流道对应连接着相同数量的样品反应池，所有的层次等分中的每层节点的分支流道数量依次分别为：m1，m2，...，mn，样品反应池总数为：m1*m2*...*mn；每个样品反应池和流体引入口之间的流道均为相同的结构特征。
10.当进行m1＝2，m2＝2，m3＝2，m4＝2，m5＝2，m6＝4时，所述样品反应池的总数为m1*m2*...*m6＝128。
11.进一步地，所述流体流道网络主要布局在单独的一个层面，从流体引入口到达每一个样品反应池时，每个分支节点对应的各分支的样品反应池组成相同，每个样品反应池对应的流道结构等效，该结构确保精确等量地分配测试样品液，并且相同尺寸上可以布局更多样品反应池。
12.进一步地，所述样品测试卡和透明凸柱均为透明材料或者透明膜材料。
13.进一步地，所述样品反应池由存储腔和观测腔组成；所述观测腔为薄层结构,所述观测腔薄层垂直方向上透明，易于实现更清晰的显微观察。
14.本发明为一种样品测试卡的加样方法，采用熟知的真空负压加样，包括如下步骤：
15.ss01、提供测试样品液和样品测试卡，测试样品液/处于分层状态的测试样品液和比重小于水的非水溶性液体放在样品容器中；
16.ss02、在样品测试卡上的流体引入口内插入细吸管，细吸管的另一端连接到样品容器中的测试样品液底部；再将样品测试卡、样品容器，以及用于摆放的托架均密封在加样室内进行抽真空，使得样品测试卡中的各个样品反应池、流道网络和细吸管内的空气经过测试样品液排出，真空室达到一定的真空度，其中，该过程中真空室达到的真空度决定测试卡的回吸能力，即回吸总体积；
17.ss03、抽真空达到一定的真空度后，然后向真空室缓慢放入空气，使得试管中的测试样品液通过细吸管吸入流道网络，然后到达样品反应池内，对样品反应池等量填充测试样品液和/或非水溶性液体和/或空气；直至真空室内气压与大气压一致；
18.其中，处于分层状态的测试样品液和比重小于水的非水溶性液体即为测试样品液和比重小于水的非水溶性液体在静置后自然地分离为两层状态；
19.其中，加样方法过程中的ss02抽负压达到的真空度，决定测试卡的回吸能力即回吸总体积，由于客观因素决定不可能达到绝对真空，因此回吸总体积一定小于样品测试卡内的空间体积。通过控制测试样品液总量与回吸总体积之间的关系，或者测试样品液总量和比重小于水的非水溶性液体量之和与回吸总体积之间的关系，实现对每个样品反应池均匀等量加入测试样品液和/或等量加入非水溶性液体和/或空气，样品反应池达到如下几种不同效果：a)当测试样品液总量大于回吸总体积时，回吸的全是测试样品液，并且回吸的测试样品液总量等于回吸总体积，测试样品液被等分地填充到每个样品反应池，样品反应池不完全充满，样品反应池内的气体为抽真空后的残余气体，所述流道网络内全部是液体测试样品；b)当测试样品液总量小于回吸总体积时，测试样品液被等分地填充到每个样品反应池，样品反应池不完全充满，流道网络和/或样品反应池的上部内是气体，各个样品反应池均被空气隔离；c)当测试样品液总量小于回吸总体积，测试样品液总量和非水溶性液体的总量之和大于回吸体积时，测试样品液先被等分地填充到每个样品反应池，然后再填充非水溶性液体，流道网络内和样品反应池的上部是非水溶性液体，各个样品反应池被非水溶性液体隔离；d)当测试样品液和非水溶性液体的总量之和小于回吸总体积时，首先测试样品液被等分地填充到每个样品反应池，然后再等分地填充非水溶性液体，最后填充空气，样品反应池的上部和流道网络内是非水溶性液体和空气，各个样品反应池均被非水溶性液体和空气隔离。
20.本发明的样品测试卡通常水平放置进行使用。
21.本发明采用等效的样品反应池分布和流道网络布局，每个样品反应池连接等效流道的设计方法，结构特点从理论原理方面确保每个样品反应池的精确等量加样，可以很方便地实现样品反应池内和流道网络中的空气将每个样品反应池隔离，使每个样品反应池完全独立，彻底解决池与池之间的污染。仅需要控制样品液和/或其他非水溶性液体的总量，每个样品反应池就可以将它们均匀等分，每个样品反应池内的样品量和/或非水溶性液体量和/或空气量的比例相同，实现精准等量的均匀加样。合理的结构设计使操作简单易行，适应范围广，精度准确，效果明显；另外，样品反应池内存有的空气，提供微生物生长过程中需要的氧气，密封膜不需要具有透气特性；再者，测试样品液的加样不受环境大气压的限制，产品可适用于所有人居海拔高度的地区。本发明特别设有薄层显微观测腔用于显微成像，实现快速检测，为该领域引入新的检测方法。
22.本发明的样品测试卡可以应用于厌氧微生物测试。
23.本发明具有以下有益效果：
24.1、本发明通过等效的样品反应池分布和流道网络布局，每个样品反应池连接等效流道网络的设计方法，相同尺寸的卡上布局更多的样品反应池，并且只需简单控制测试样品液总量即可实现样品反应池的等量精确加样；同时，样品反应池内等量的空气或其他非水溶性液体，使样品反应池之间相互隔离，避免污染，并且能够为封闭状态下样品反应池内的生物样品的生长，提供所必须的空气量，使得密封膜可以不需要具有透气特性。
25.2、本发明相对现有技术具有操作简单，精度准确，效果显著，实用性强，集成度高，成本低等优点，尤其通过采用显微观测和图像处理技术，实现临床快速药物敏感性分析，是现有宏观浊度分析向微观形态分析的方法学变革。本发明在微生物加样和快速检测领域均具有新颖性。
26.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为本发明的一种等分流道的样品测试卡的结构俯视图；
29.图2为图1的结构侧视图；
30.图3为上盖板的结构俯视图；
31.图4为图3的结构侧视图；
32.图5为主体卡的结构俯视图；
33.图6为图5的内部结构侧视图；
34.图7为图5的结构侧视图；
35.图8为主体卡与上盖板的内部结构示意图；
36.图9为本发明的一种等分流道的样品测试卡的爆炸结构示意图；
37.图10为上盖板中的流道网络、分支流道、分支节点的结构示意图；
38.图11为实施例二中的上盖板中的流道网络的结构示意图；
39.附图中，各标号所代表的部件列表如下：
40.1-样品测试卡，21-流道网络，22-透明凸柱，100-主体卡，101-流体引入口，102-样品反应池，200-上盖板，201-主流道，202-第一分支流道、203-第二分支流道，204-第三分支流道、205-第四分支流道，206-第五分支流道，207-第六分支流道，300-密封膜，301-第一分支节点，302-第二分支节点，303-第三分支节点，304-第四分支节点，305-第五分支节点，306-第六分支节点，307-第七分支节点，308-第八分支节点,309-进样窗，401-第一节点，402-第二节点，403-第三节点。
具体实施方式
41.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
42.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“开孔”、“上”、“下”、“厚度”、“顶”、“中”、“长度”、“内”、“四周”等指示方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的组件或元件必须具有特定的方位，以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
43.实施例一
44.请参阅图1-图10所示，本发明为一种等分流道的样品测试卡，样品测试卡1为平板形状，其长约91mm、宽约57mm，厚度为4-5mm。样品测试卡1内部密封布局有一个流体引入口101、流道网络21和均匀阵列有样品反应池102，流道网络21的各分支流道末端开设有用于测试样品液流入的进样窗309；主体卡100上均匀阵列有与进样窗309相配合的样品反应池102；流道网络21将流体引入口101和样品反应池102相连通。
45.本实施例的样品测试卡1包括一百二十八个样品反应池102，每个样品反应池102可接纳测试样品液，以用于显微观测或其他光学自动化分析；样品反应池102排列成八行、十六列的布局。本发明的样品测试卡1通常放置在水平面上进行使用。
46.样品测试卡1的样品反应池102内部设置有透明凸柱22；透明凸柱22底面与样品反应池102的底部之间形成观测腔；观测腔为0.1-0.5mm的薄层，保证较好的显微成像效果；样品测试卡1中的上盖板200的透明凸柱22起到导光作用；采用显微观测时，观测层的垂直方向上的构成物应保证较好的透明度。
47.样品测试卡采用等分流道的网络和均匀分布的样品反应池布局。流道由上盖板200上表面上的凹槽条经过覆盖上密封膜后形成，流体引入口101与每一个样品反应池102之间的流道都经过六层次的等分；从吸样的引入口101开始，连接主流道201后延伸，首先从第一层次的第一分支节点301处一分二后，分向第一分支流道202、第二分支流道203两个分支流道，两分支流道再分别延伸到第二层次的第二分支节点302和第三分支节点303，第一层次第一分支节点301与第二层次第二分支节点302和第三分支节点303之间的两段第一分支流道202和第二分支流道203结构相同，即长度、截面和形状相同；第二层次的两个分支节点为第二分支节点302和第三分支节点303进行同样的一分二，各自的两个分支流道为第三分支流道204、第四分支流道205和第五分支流道206和第六分支流道207继续延伸向第三层次的共四个分支节点为第四分支节点304、第五分支节点305、第六分支节点306、第七分支节点307，两层次分支节点之间的四段分支流道为第三分支流道204、第四分支流道205和第五分支流道206和第六分支流道207结构相同；然后，在每个层次的每个节点处再分别经过数次相同的一分多的分支后，延伸向各自的下一个分支节点，保证相同两个层次节点之间的分支流道的结构相同；最后的分支节点是第六层次第八分支节点308，共有32个，然后每个第八分支节点308完成一分四的分支，各分支流道延伸，连接到通向反应池的进样窗309，到达每个样品反应池。六层次等分中的每层节点的分支流道数量分别为：2，2，2，2，2，4，样品反应池102总数为：2*2*2*2*2*4＝128；每个样品反应池102和流体引入口101之间的流道均为相同的结构特征。可以方便地实现每个样品反应池同时、等速、等量地精准加样。
48.样品测试卡1优选地采用装配的方式组成样品测试卡1的整体，样品测试卡1包括主体卡100、上盖板200和密封膜300，主体卡100上表面均匀阵列有柱形凹槽，柱形凹槽为样
品反应池102；上盖板200下表面均匀阵列有透明凸柱22，上盖板200上表面开设有流道网络21；密封膜300粘贴覆盖在布有流道网络21的上盖板200上表面，形成封闭的流道网络21；主体卡100上的柱形凹槽与上盖板200的透明凸柱22进行间隙配合，主体卡100和上盖板200按照对应位置关系粘合在一起，形成密封的样品反应池102和密封的流道网络21，生成完整的样品测试卡1。样品测试卡1包括一百二十八个样品反应池102，接纳多种液体生物样品，用于显微观测或光强的自动化分析。
49.本发明的一种等分流道的样品测试卡的加样方法，首先根据需要准备测试样品液、样品测试卡1和样品容器，在样品容器中加入测试样品液或处于分层状态的测试样品液和比重小于水的非水溶性液体，样品测试卡1的流体引入口101插入细吸管，细吸管的另一端放入到装有测试样品液的样品容器底部，并放置在真空腔中，封闭真空腔，抽真空到压力为0.7-6.0psia，真空腔以及样品测试卡1内部的样品反应池102和流道网络21等空腔处均为真空负压状态；然后向真空腔内放空气，此时测试样品液从细吸管的端口吸入，经样品测试卡1的流体引入口101、流道网络21，最后到达样品反应池102。随着不断缓慢地放气，继续填充样品反应池102，直到真空腔内的气压与大气压一致，整个加样方法的过程结束。
50.其中，真空腔抽真空后达到的真空负压状态决定样品测试卡1的回吸能力，真空度越高回吸能力越强，表现为样品测试卡1总回吸体积，由于不可能达到绝对真空，因此回吸总体积一定小于样品测试卡1内的空间总体积。总回吸体积对应等量的填充体积，测试样品液和/或非水溶性液体被同时、等量均匀地分配后，填充到每一个样品反应池102。通过控制测试样品液总量与回吸总体积之间的关系，或者测试样品液和非水溶性液体之和的量与回吸总体积之间的关系，加样后样品反应池102达到如下几种不同效果：a)、当样品容器内只装有测试样品液且测试样品液的量大于回吸总体积时，与回吸总体积等量的测试样品液被等分地填充到每个样品反应池102，流道网络21内是测试样品液，样品反应池102不完全充满，样品反应池102内的气体为抽真空后的残余气体；另外，通过控制抽真空时达到的真空度，可以调控样品反应池102内的空气量；b)、当样品容器内只装有测试样品液且测试样品液的量小于回吸总体积时，测试样品液等分地充到样品反应池102，待测试样品液被回吸完后，再吸入的就是空气，样品反应池102的上部和流道网络21内是空气，实现每个样品反应池102内填充等量的测试样品液和等量的空气，并且由空气把样品反应池102隔离；c、当样品容器内同时装有测试样品液和非水溶性液体，并且测试样品液小于回吸总体积，而测试样品液和非水溶性液体的总量大于回吸总体积时，首先测试样品液被等分地填充到样品反应池102内，然后填充等量的非水溶性液体，样品反应池102的上部和流道网络21内是非水溶性液体，样品反应池102内含有等量的测试样品液和等量的非水溶性液体，非水溶性液体把样品反应池102隔离；d、当样品容器内同时装有测试样品液和非水溶性液体，并且测试样品液和非水溶性液体的总量小于回吸总体积时，首先测试样品液被等分地填充到样品反应池102，然后非水溶性液体被等分地填充到样品反应池102，最后填充的是空气，样品反应池102内含有等量的测试样品液和等量的非水溶性液体，样品反应池102的上部是非水溶性液体和空气，流道网络21内是空气，空气把样品反应池102隔离；非水溶性液体在样品之后通过流道网络21流入样品反应池102，可以更干净地排掉流道网络21中的测试样品液，使加样和隔离更加完善。以上所有情况下测试样品液的总量均能够精确地等分到每一个样品反应池102中。其中，加样过程中后段填充的空气或非水溶性液体使整个流道网络21和样品反应
池102的上部均为空气和/或非水溶性液体，达到把每一个样品反应池102完全隔离的目的。方法简单，形式多样，效果显著。另外，连接样品反应池102的流道网络21中最后一次等分的流道还可以更短，样品反应池102布局可以更紧凑，相对于现有技术的相同尺寸的测试卡，本发明的样品测试卡1可以布局更多数量的样品反应池102，满足更高的期望需求。
51.其中，本发明样品测试卡1使用时，在测试样品液加样完成后，封闭样品测试卡1上的流体引入口101，防止测试样品液外流造成生物污染。
52.样品测试卡1优选地用于抗生素药物敏感性试验时，样品反应池102内附着有含有抗生素的粉剂，并且可控地处在样品反应池102的底部，提高了底部的亲水性，样品测试卡1加样时测试样品液首先可靠地到达并填充到样品反应池102的底部，确保观测腔处无气泡。
53.本发明样品测试卡1可以用于显微观测的快速药物敏感性试验中。
54.本发明样品测试卡1的生产工艺流程：本发明的样品测试卡1是用于完成生物样品检测的载体，样品反应池102内附着不同的干粉试剂，干粉试剂的附着过程是样品测试卡1的主要生产流程。样品测试卡1的生产流程是首先向单独的主体卡100的样品反应池102内加入所需要的液体试剂，然后对主体卡100内的液体试剂进行蒸发、冻干或其他手段的干燥，使所需的不同试剂附着在样品反应池102内。干燥好后的主体卡100与上盖板200粘合在一起，完成样品测试卡1的主要生产。样品测试卡1使用时，测试样品液将样品反应池102内的干粉试剂溶解。
55.实施例二
56.本发明的另一个实施例在图11中图示，相似于实施例一的方法，在实施例一中原有的布局128个样品反应池的基础上，用同样等分流道的方法再布局64个样品反应池，样品测试卡共均匀布局192个样品反应池。
57.本发明样品测试卡从流体引入口向样品反应池分布流道成为两个不同的等分流道区域，第一节点401处向第二节点402处布局一个流道区域，第一节点401处向第三节点403处布局另一个流道区域。一个流道区域从第二节点402开始，流道经过相同层数的六层次等分，所有的层次等分中的每层节点的分支流道数量分别为：2，2，2，2，2，4时，形成最终分支流道总数为：2*2*2*2*2*4＝128,连到128个样品反应池，第二节点402处到对应的各个样品反应池之间的流道均为相同的结构特征，各样品反应池可以实现后期完全等量加样。另一个流道区域从第三节点403开始，流道经过相同层数的五层次等分，所有的层次等分中的每层节点的分支流道数量分别为：2，2，2，2，4时，形成最终分支流道总数为：2*2*2*2*4＝64,连到64个样品反应池，第三节点403处到对应的各个样品反应池之间的流道均为相同的结构特征，各样品反应池可以实现后期完全等量加样。虽然两个区域各自从共同节点到样品反应池之间的流道结构相同，但两个区域间从共同的第一节点401到样品反应池之间的流道结构存在差异，从而造成两个区域样品反应池之间产生样品加样量的不同，误差是因为两个区域间流道结构有差异的部分段内的样品液的最尾段被等分方式不同，由于引起误差的流道的体积很小，样品反应池的体积相对足够大，所以误差可以忽略。本实施例是一种实现更多样品反应池均匀布局的更加全面合理的工程化解决方案。
58.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。
而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
59.以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。