用于治疗再灌注损伤的BNIP3肽的制作方法

用于治疗再灌注损伤的bnip3肽
发明领域
1.本发明涉及再灌注损伤的治疗。特别地，本发明提供了bnip3衍生的肽，其通过降低线粒体处bnip3和bax的活性来防止细胞损伤和细胞死亡。
2.发明背景
3.血管的阻塞导致部分组织的血液停止流动，这尤其会导致氧气供应不足、营养物质的可得性降低以及代谢废物的清除不足，从而对细胞造成严重破坏，随后导致细胞死亡。然而急性闭塞是不可预测或避免的，但血管通畅的恢复对患者的预后是可行和必要的1。及时的再灌注方案是推荐的治疗方法，但血液，特别o2供应的快速恢复会对组织造成损伤，目前没有可用的治疗方法。再灌注早期的特征在于高水平的氧导致高氧状态，活性氧爆发以及钙水平升高而无酸中毒。再灌注损伤的病理已在心脏、大脑、肝脏和肾脏中得到认识，并与严重的临床表现相关，所述严重的临床表现包括心肌冬眠、急性心力衰竭、脑功能障碍、胃肠功能障碍、肾功能障碍、全身性炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征。因此，再灌注损伤是提出了重要的治疗挑战的严重的医学状况。心肌梗塞(mi)是突然的、时间上不可预测的事件，其中再灌注对于存活至关重要，但决定了高达50％的最终梗塞面积2。这种命运也适用于移植的器官。mi是心力衰竭病例的最常见原因，因此减少再灌注损伤的治疗干预提供了挽救有活力的心肌、限制mi大小、保护心脏功能和影响心力衰竭发生率的机会3。在再灌注诱发的梗塞进展中，两种形式的细胞死亡，即坏死和凋亡，起着至关重要的作用。在最初的梗塞区域可以观察到坏死心肌细胞死亡占优势。坏死诱导下游组织反应，诸如炎症、基质重塑和后来的纤维化4。凋亡发生在梗塞和梗塞周围区域，是梗塞后早期重塑的主要组成部分5。
4.心脏损伤也是癌症患者的关键问题。由于筛查和治疗策略的进步，癌症幸存者的人数在过去三十年中稳步增长。十年随访的5年生存率提高到50-70％。因此，癌症治疗的副作用，特别是心血管毒性越来越普遍。常规化学疗法(例如蒽环类药物)是许多癌症的常用疗法，其被广泛认为是导致左心室射血分数(lvef)无症状和有症状下降、心肌病和心力衰竭(hf)的促成因素。癌症介导的心肌病的特征在于活性氧(ros)介导的lv收缩功能的剂量依赖性降低，这种降低通常是不可逆的。目前，在接受蒽环类化疗或其他癌症疗法的患者中，既没有预防的方法，也没有有效减小心脏毒性副作用(例如，心脏功能下降、心肌病等)的疗法。几项研究旨在解决这一医疗需求，但仅揭示了部分结果/益处。ceccy试验未能显示卡维地洛对乳腺癌患者的益处，然而显示了通过降低肌钙蛋白的保护作用6。prada试验评估了坎地沙坦和美托洛尔，并揭示了坎地沙坦在预防心肌病方面的显著益处，尽管根据目前的心脏毒性定义，该研究动力不足7。manticore试验的主要结果是左心室直径的变化。无论是β阻滞剂还是ace抑制剂对这一结果指标都没有显著影响，但显著预防了作为继发性结果的心力衰竭8。综上所述，虽然现有文献指出心力衰竭疗法的潜在益处，但目前没有研究深入评估现有指南定义的现有技术水平的心力衰竭疗法在预防癌症患者心脏毒性中的价值。
5.线粒体是坏死和凋亡信号传导的中心9。这些包括电子传输的破坏、氧化磷酸化和
atp合成、dna片段化、蛋白质和脂质损伤以及ros的过度产生。
6.线粒体处坏死的决定性事件是线粒体内膜(mim)中孔，即所谓的线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mptp)的开放。这造成了能量崩溃和溶质的快速交换，其中渗透物质涌入线粒体。随后基质的膨胀导致线粒体外膜破裂、细胞肿胀和细胞破裂
10
。坏死刺激物，诸如ca
2
，被认为触发mptp的开放，并可由ros增强
10
。尽管进行了广泛的研究，但mptp的组分仍然未知，转基因动物研究排除了几个推定的组分，包括腺嘌呤核苷酸转位酶
11
、电压依赖性阴离子通道
12
、线粒体磷酸载体
13
(slc25a3)和亲环蛋白d
14
。最近，atp合酶的c亚基被认为在内膜中形成孔隙
15,16
。据报道，在i/r损伤的临床前模型中，使用药物抑制剂(诸如环孢菌素a)防止mptp开放可减少梗塞面积
17,18
。在更大的临床试验中，其效果是中性的
19
。线粒体靶向肽elamipretide(以前称为bendavia或mtp-131)以及线粒体靶向药物tro40303，在动物研究中已经证明，当在再灌注开始时施用时，通过减少线粒体来源的ros的产生来减少梗塞面积
20-22
。然而，在stemi患者研究中，静脉内elamipretide
20
和tro40303(均在ppci之前施用)未能减小梗塞面积
23
。值得注意的是，当与安慰剂组相比时，接受tro40303的患者报告了更多的不良事件，因而限制了这种治疗方法的临床应用。同样无效的还有na

/h

交换抑制剂
24
、抗氧化剂诸如超氧化物歧化酶
25
和各种抗嗜中性粒细胞抗体
26,27
。
7.发生在梗塞和梗塞周围区域的凋亡细胞死亡是由线粒体外膜(mom)透化引发的，该透化使得能够释放促凋亡蛋白，诸如细胞色素c、凋亡诱导因子smac/diablo(第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活因子/具有低pi的直接iap结合蛋白)，以及从膜间隙进入胞质的内切核酸酶g，从而导致通过半胱天冬酶和dna片段化引发细胞死亡级联反应
28-30
。
8.促死亡bcl-2蛋白bnip3(bcl-2腺病毒e1b 19kda相互作用蛋白-3)和bax(bcl-2相关x蛋白)诱导mom透化，并通过易位到mom中并形成异二聚体代表线粒体凋亡的介体和下游效应子
31-35
。另外，bnip3和bax调节mim的扰动，从而起到坏死的关键激活子的作用
5,36
。
9.本发明通过提供bnip3和bax相互作用活性的抑制剂来解决对中心梗塞区的急性损伤和紧接周围区域的随后细胞死亡的最佳改善的需求，所述抑制剂中断bnip3、bax和线粒体作为个体或三角之间的途径内和途径间通信，以治疗心脏、大脑、肝脏和肾脏的再灌注损伤和其中线粒体的扰动导致细胞损伤和细胞死亡的其他适应症，例如心力衰竭、器官移植、心脏骤停或由于手术和药物干预以及中风、癌症和癌症疗法引起的心脏损伤。
10.发明概述
11.本发明提供了与作为单体的bnip3和bax结合以及与它们的同-和异-寡聚体结合的肽，其通过规避单个的活性和寡聚体的活性代表了广谱活性。该功效不限于一个器官或一个物种，如通过保护心脏和脑组织以及来源于人诱导的多能干细胞的人心室心肌细胞免受再灌注损伤所证明的。猪中的心肌梗塞面积也显著减少。
12.这些肽来源于bnip3的n末端部分和由经证明最有活性的bnip3的氨基酸13-20组成的8个氨基酸区段。非常令人惊讶的是，这种短肽能够抑制bnip3和bax活性，阻断这些蛋白质的同寡聚化和异寡聚化的形成，并诱导细胞内这些同寡聚体和异寡聚体的构象变化。肽序列中的某些突变甚至增强了其功效。
13.鉴于这些结果，本发明在第一方面提供了肽，所述肽包含
14.(i)细胞摄取信号；和
15.(ii)包含bnip3的位置13至20的bnip3片段或由其衍生的氨基酸序列。
16.该肽的长度尤其地为50个、特别是40个或更少的氨基酸。
17.在第二方面，本发明提供了包含根据第一方面的肽的药物组合物及其在治疗再灌注相关和/或线粒体相关病症以及癌症疗法诱发的心脏毒性和预防此类疾病中的用途。
18.在第三方面，本发明提供了用于防止细胞损伤或细胞死亡的方法，其包括使细胞与根据第一方面的肽接触。
19.本发明在第四方面还涉及筛选适于预防再灌注损伤和/或线粒体相关病症和/或癌症疗法诱发的心脏毒性的化合物的方法，其包括
20.(i)提供一种或多种候选化合物；
21.(ii)确定候选化合物干扰bnip3与bax结合的能力；
22.(iii)选择那些干扰bnip3与bax的结合的候选化合物。
23.根据以下描述和所附权利要求，本发明的其他目的、特征、优点和方面对于本领域技术人员来说将变得显而易见。然而，应该理解的是，以下描述、所附权利要求和具体实例仅作为说明给出，所述描述、所附权利要求和具体实例指示了本技术的优选实施方案。通过阅读以下内容，本领域技术人员将容易明白在所公开的发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
24.图1.小鼠中bnip3缺失减小体内心肌梗塞面积。a体内缺血/再灌注模型的示意图。b非缺血区(远端)、缺血区(风险区，aar)、梗塞区(白色，嵌入aar)的心脏切片示意图。c用指定的tat-bnip3剂量治疗的野生型、bnip3缺陷型(bnip3-/-)和bnip3-/-小鼠的再灌注24小时后的梗塞面积(n＝3-7只小鼠)。aar
–
风险区；inf
–
梗塞。数据是平均值
±
s.e.m。统计分析是利用bonferroni校正的双因素方差分析(anova)。
25.图2.bnip3是心肌再灌注损伤中bax活性的调节子(mediator)。在血管闭塞后，小鼠在体内暴露于指定的再灌注持续时间。观察到基线时和再灌注10分钟后风险区中增加的线粒体bnip3水平(a)和线粒体bax浓度(b)(n＝5-7只小鼠)。c蛋白质印迹监测显示bnip3在基线时以及再灌注10和30分钟后与bax免疫共沉淀。d基线时和再灌注10分钟后未用bnip3处理和用bnip3处理的bnip3缺陷型(bnip3-/-)小鼠风险区的线粒体bax水平的定量(n＝3只小鼠)。bax的易位依赖于bnip3的存在。数据是平均值
±
s.e.m。统计分析是利用bonferroni校正的双因素方差分析(anova)。
26.图3.相互作用位点、二级结构和计算机对接(in silico docking.)。a实验设置的示意图(jpt,berlin,germany,berlin)。b与bax肽文库一起孵育的bnip3的热图描绘，其展示了作为相互作用位点的螺旋α5、α6和α7 α8。颜色编码范围从白色(0或低强度)到浅灰色(中等强度)到深灰色(高强度)。c利用modeller 9.15进行同源性建模获得的bnip3的三维结构模型。d bnip3的圆二色性(cd)光谱分析。e、f使用haddock由计算机对接实验产生的bax/bnip3与指定的结合位点相互作用的卡通表示。g tat序列的结构。h bnip3-20a结构的结构。i bnip3-20c结构的结构。j体内再灌注10分钟后tat-bnip3-20a(绿色)的透壁分布的代表性图像。比例尺，1mm。k体内血管闭塞后再灌注5分钟后，tat-bnip3-20a与bnip3免疫共沉淀的蛋白质印迹监测。
27.图4.tat-bnip3-20a减轻体内心肌再灌注损伤。a体内心肌梗塞模型的示意图。小鼠在体内血管闭塞后暴露于指定的再灌注持续时间。在再灌注前5分钟将肽注入左心室。b在用媒介物、对照肽tat-bnip3-20c和tat-bnip3-20a处理的野生型小鼠中，再灌注24小时后的梗塞面积(n＝7-10只小鼠)。tat-bnip3-20a显著减小梗塞面积。bnip3-20c和媒介物对减轻梗塞无效。tat-bnip3-20a在再灌注10分钟后抑制bnip3与线粒体的相互作用(c)以及在再灌注4小时后抑制半胱天冬酶-3的活性(d)，而对照肽tat-bnip3-20c并不(n＝6只小鼠)。数据是平均值
±
s.e.m。统计分析是利用bonferroni校正的双因素方差分析(anova)。
28.图5.a体外复氧(in vitro reoxygenation)(源自人诱导的多能干细胞(人cm)的人心室心肌细胞中的研究设计)的示意图。人cm在缺氧后暴露于常氧和2小时的复氧，并用tat-bnip3-20a和对照肽bnip3-20c处理。b tat-bnip3-20a显著抑制bnip3与线粒体的相互作用。c凋亡、坏死和健康人cm的代表性图像。比例尺，1mm(左)，200μm(右)。tat-bnip3-20a在复氧中强效地防止人cm死亡。d去极化的线粒体、健康线粒体、细胞核的代表性图像。tat-bnip3-20a减少了复氧诱导的线粒体内膜电位的降低。比例尺，400μm(左),100μm(右)。对照肽tat-bnip3-20c不能有效抑制bnip3与线粒体的相互作用、线粒体内膜电位的降低和细胞死亡。数据是平均值
±
s.e.m。统计分析是利用bonferroni校正的双因素方差分析(anova)。
29.图6.a bnip3-8b序列的结构。b bnip3-8c序列的结构。c bnip3-8b的圆二色(cd)光谱分析。
30.图7.a血管闭塞后再灌注5分钟后不同器官中对荧光标记的tat-bnip3-8b的摄取。开始再灌注前5分钟给予tat-bnip3-8b。b 24h后用tat-bnip3-8b和tat-bnip3-8c对照肽处理的分离的成体心肌细胞的存活。
31.图8.tat-bnip3-8b药代动力学。将荧光标记的bnip3-8b在人血清(a)、血浆(b)和全血(c)中于37℃孵育指定的持续时间，并通过蛋白质印迹监测。蛋白酶k处理作为对照。
32.图9.tat-bnip3-20a减小体内心肌梗塞面积。a体内心肌梗塞模型的示意图。小鼠在血管闭塞后分别暴露于再灌注5分钟和24小时。在开始再灌注前5分钟，将肽注入左心室。b再灌注5分钟后，与bnip3和bax免疫共沉淀的tat-bnip3-8b的蛋白质印迹监测。c基线时和再灌注10分钟，在蓝色天然page后，风险区中进行的胞质bnip3和bax的免疫印迹。用媒介物(nacl)和tat-bnip3-8b处理小鼠。经历假手术的小鼠作为对照。d、e用媒介物、tat-β-gal、对照肽tat-bnip3-8c和指定剂量的tat-bnip3-8b处理的野生型小鼠中再灌注24小时后梗塞面积(n＝7-10只小鼠)。tat-bnip3-8b以剂量依赖的方式显著减小梗塞面积。媒介物、tat-β-gal和tat-bnip3-8c对减轻梗塞无效。
33.图10.bnip3-8b减轻体内心肌再灌注损伤。小鼠在体内血管闭塞后暴露于指定的再灌注持续时间。在开始再灌注前5分钟，将肽注入左心室。tat-bnip3-8b抑制再灌注10min后bnip3(a)和bax(b)与线粒体的相互作用，再灌注10min后线粒体肿胀(c)，再灌注30min后bax激活(d)，再灌注30min后细胞色素c释放(e)，以及再灌注4h后半胱天冬酶-3的活性(f)，而对照肽tat-bnip3-8c并不(n＝5至12只小鼠)。经历假手术的小鼠作为对照(n＝5-8只小鼠)。数据是平均值
±
s.e.m。统计分析是利用bonferroni校正的双因素方差分析(anova)。
34.图11.a源于人诱导的多能干细胞(人cm)的人心室心肌细胞中体外复氧研究设计的示意图。人cm在缺氧后暴露于常氧和2小时的复氧，并用tat-bnip3-8b和对照肽tat-bnip3-8c处理。btat-bnip3-8b在复氧中强效地抑制人cm死亡。凋亡、坏死和健康人cm的代
表性图像。c tat-bnip3-8b减轻复氧诱导的线粒体内膜电位的降低。去极化的线粒体、健康线粒体、细胞核的代表性图像。比例尺，200μm。对照肽bnip3-8c不能有效抑制细胞死亡和线粒体内膜电位的降低。数据是平均值
±
s.e.m。统计分析是利用bonferron的校正的双因素方差分析(anova)。
35.图12.与媒介物处理相比，tat-bnip3-8b在短暂性大脑中动脉闭塞后再灌注24小时后减小了脑梗塞面积。再灌注前立即给予tat-bnip3-8b和媒介物。数据是平均值
±
s.e.m。采用非配对学生t检验，统计学显著性设定在p《0.05的水平。
36.图13.在猪中，tat-bnip3-8b在左冠状动脉闭塞后再灌注4小时后，与媒介物处理相比，减小了心肌梗塞面积。再灌注前5分钟给予tat-bnip3-8b和媒介物。数据是平均值
±
s.e.m。采用非配对学生t检验，统计学显著性设定在p《0.05的水平。
37.图14.tat-bnip3-8b通过防止线粒体肿胀来防止多柔比星诱导的线粒体损伤。hl-1细胞用不与或与tat-bnip3-8b一起的5μm多柔比星处理，通过光密度测定线粒体的肿胀，其中肿胀的线粒体具有较低的od
540
。未处理的细胞用作对照。
38.发明详述
39.本发明提供了治疗受试者的疾病或疾患的方法、化合物和组合物，其中期望抑制bcl-2腺病毒e1b 19kda相互作用蛋白-3(bnip3)、bcl-2相关x蛋白(bax)和线粒体的单独的活性和途径间通信，以防止细胞损伤和细胞死亡。
40.本发明一方面是抑制bnip3、bax和线粒体三角的肽，其激活细胞损伤和细胞死亡级联。根据本发明的肽包含细胞摄取信号；和包含bnip3的位置13-20bnip3片段或由其衍生的氨基酸序列，并且尤其地长度为50，特别是40个氨基酸或更少。
41.bnip3片段
42.根据本发明的肽中的bnip3片段尤其能够与bax和/或bnip3结合。特别地，bnip3片段能够与bax的bnip3结合区域，诸如bax的氨基酸108至164的区域结合。bnip3片段特别地能够干扰或抑制bnip3与bax的相互作用。
43.在某些实施方案中，bnip3片段的长度为20个氨基酸或更少。特别地，其长度为15个氨基酸或更少或甚至10个氨基酸或更少。在特定实施方案中，bnip3片段的长度为8个氨基酸。
44.在具体实施方案中，bnip3片段具有bnip3蛋白的氨基酸序列。如本文所用的术语“bnip3”特别是指小鼠bcl-2腺病毒e1b 19kda相互作用蛋白-3，其具有氨基酸序列seq id no:1。因此，bnip3片段可具有与包含氨基酸位置13至20的序列的seq id no:1的氨基酸序列的连续部分具有同一性的氨基酸序列。例如，bnip3片段可具有seq id no:1的位置1至20的氨基酸序列。在某些实施方案中，bnip3片段具有选自seq id no:1的位置4至20、seq id no:1的位置11至20、seq id no:1的位置12至20以及seq id no:1的位置13至20的氨基酸序列。在具体实施方案中，bnip3片段由seq id no:1的位置13至20的氨基酸序列组成。在这些实施方案中，bnip3片段特别地不包含任何其他氨基酸残基。小鼠bnip3的位置13-20的氨基酸序列与人bnip3(seq id no:2)的位置73-80的氨基酸序列具有同一性。作为本文提及的小鼠bnip3的氨基酸序列的替代，也可以使用人bnip3的相应氨基酸序列。
45.在另外的实施方案中，bnip3片段具有源自bnip3的氨基酸序列。如果靶氨基酸序列在其整个长度上与参考氨基酸序列的相应部分共享至少60％、更优选至少70％、至少
80％、至少90％或至少95％的同源性或同一性，则该靶氨基酸序列“源自”于或“对应于”参考氨基酸序列。在特定实施方案中，“源自”或“对应于”参考氨基酸序列的靶氨基酸序列在其整个长度上与参考氨基酸序列的对应部分具有100％同源性，或特别地具有100％同一性。氨基酸序列或核苷酸序列的“同源性”或“同一性”优选根据本发明在参考序列的整个长度上或在参考序列的对应部分的整个长度上确定，其对应于定义了同源性或同一性的序列。bnip3片段特别地可源自上述bnip3片段之一。例如，bnip3片段可具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自seq id no:1的位置1至20、seq id no:1的位置4至20、seq id no:1的位置11至20、seq id no:1的位置12至20以及seq id no:1的位置13至20的氨基酸序列具有至少60％同一性，特别是至少70％同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，bnip3片段包含与seq id no:1的位置13至20具有至少60％同一性的氨基酸序列。
46.在某些实施方案中，bnip3片段包含bnip3的位置13至20，任选包含1、2或3个氨基酸取代(与bnip3的位置13至20相比)。bnip3尤其地具有seq di no:1的氨基酸序列。在这些实施方案中，1、2或3个氨基酸取代优选存在于对应于bnip3的位置13、15、17、18、19和20的一个或多个位置，特别是bnip3的位置15、17和19处。特别地，氨基酸取代选自
47.(i)苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸或苏氨酸对bnip3位置15处的谷氨酸的取代，
48.(ii)缬氨酸对bnip3的位置17处的组氨酸的取代，和
49.(iii)酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸或组氨酸对bnip3位置19处的丝氨酸的取代。
50.在特定实施方案中，bnip3片段包含含有1或2个氨基酸取代(与bnip3的位置13至20相比)的bnip3的位置13至20，其中所述氨基酸取代选自
51.(i)组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或酪氨酸对bnip3的位置15处的谷氨酸的取代，和
52.(ii)酪氨酸、半胱氨酸或苯丙氨酸对bnip3的位置19处的丝氨酸的取代。
53.在某些实施方案中，bnip3的位置19处的丝氨酸被酪氨酸、半胱氨酸或苯丙氨酸取代，特别是被苯丙氨酸取代。
54.在具体实施方案中，bnip3片段包含选自seq id no:3至17的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。在具体实施方案中，bnip3片段由seq id no:7或8，尤其是8的氨基酸序列组成。
55.bnip3片段可以任选地还包含源自bnip3的氨基酸残基。尤其是，整个bnip3片段源自bnip3的连续氨基酸序列。特别地，整个bnip3片段源自bnip3的1-20位氨基酸或其包含至少bnip3的位置13-20的部分。bnip3片段可具有与bnip3相应部分相同的氨基酸序列，或者可具有1至8个氨基酸取代，尤其是1至6个氨基酸取代。bnip3片段可以例如包含bnip3的位置12至20，任选包含1、2、3或4个氨基酸取代(与bnip3的位置12至20相比)，或者其可以包含bnip3的位置4至20，任选包含1、2、3、4、5或6个氨基酸取代(与bnip3的位置4至20相比)，或者其可以包含bnip3的位置1至20，任选包含1、2、3、4、5或6个氨基酸取代(与bnip3的位置1至20相比)。特别地，这些氨基酸取代中的1、2或3个在位置13至20，其余的氨基酸取代在位置1至12中。在这些实施方案中，氨基酸取代优选存在于对应于bnip3的位置4、11、12、13、15、17、18、19和20的一个或多个位置，特别是bnip3的位置4、11、12、15、17和19处。
56.在具体实施方案中，bnip3片段包含选自seq id no:18至30和70至75的氨基酸序
列。
57.取代的氨基酸残基特别地是取代另一种天然存在的氨基酸残基。如本文中所用，短语“取代”也包括使用化学衍生的残基代替非衍生的残基，条件是此类多肽发挥必要的活性。如本文中所用，术语“衍生物”是指具有一个或多个通过官能侧基反应而化学衍生的残基的肽。此类衍生的分子包括，例如，其中游离氨基已经衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可被衍生形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可被衍生形成o-酰基或o-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可被衍生形成n-im-苄基组氨酸。还包括作为衍生物的是含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如：4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；同丝氨酸可以取代丝氨酸；并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。
58.在一些实施方案中，术语“取代”包括两个或更多个取代的氨基酸残基的键联。特别地，两个或更多个氨基酸残基可被可交联部分取代和/或连接，并且每个任选地包含选自取代的、任选杂的低级烷基，特别是任选取代的、任选杂的甲基、乙基、丙基和丁基的附加α-碳取代。此外，两个取代的氨基酸残基可被通过二硫键连接的同半胱氨酸取代，以产生环和尾环肽。或者，两个或更多个取代的氨基酸残基可被接头替代。在这方面合适的接头包括，例如-(ch2)nonhco
x
(ch2)
m-，其中x是ch2、nh或o，m和n是整数1-4，形成内酰胺肽；-ch2och2chchch2och
2-，形成乙醚肽；或者-(ch2)nchch(ch2)m-，形成铆合肽。
59.在某些实施方案中，bnip3片段包含相对于bnip3的序列的取代e15y、s19f和s19y中的至少一个。
60.细胞摄取信号
61.根据本发明的肽中的细胞摄取信号尤其能够介导肽至靶细胞中的摄取。尤其是，细胞摄取信号能够介导至哺乳动物细胞，特别是人细胞中的摄取。
62.在某些实施方案中，细胞摄取信号是肽。特别地，细胞摄取信号是细胞穿透肽或蛋白质转导结构域。其长度可为5至30个氨基酸，特别是8至20个氨基酸或10至16个氨基酸。
63.细胞摄取信号可以例如是亲水肽或两亲肽。细胞摄取信号的实例包括hiv的tat蛋白的蛋白转导结构域(特别是氨基酸残基48-59)、穿膜肽(penetratin)、触角足(antennapedia)ptd、synb1、synb3、ptd-4、ptd-5、fhv coat-(35-49)、bmv gag-(7-25)、htlv-ii rex-(4-16)、d-tat、r9-tat、转运肽(transportan)、map、sbp、fbp、mpg、mpg
(δnls)
、pep-1、pep-2、多聚精氨酸和多聚赖氨酸。在某些实施方案中，细胞摄取信号是具有选自seq id no:31至50的氨基酸序列的肽。
64.细胞摄取信号可由天然存在的氨基酸残基组成，并且可以任选地是包含本文所述的化学衍生氨基酸残基的肽衍生物。此外，其可以是肽模拟物或包含d-反向-翻转(retro-inverso)序列。在某些实施方案中，细胞摄取信号包含本文公开的细胞穿透肽的d-反向-翻转序列。
65.肽
66.根据本发明的肽包含细胞摄取信号和bnip3片段。如本文中所用，表述“包含”除了其字面意思之外，还包括并具体指表述“基本上由......组成”和“由......组成”。因此，表述“包含”指的是其中“包含”具体列出的元素的主题不包含其他元素的实施方案，以及其中“包含”具体列出的元素的主题可以包含和/或确实包括其他元素的实施方案。同样，表述“具有”应理解为表述“包含”，还包括并具体指表述“基本上由......组成”和“由......组成”。在可能的情况下，术语“基本上由......组成”特别地指这样的实施方案，其中除了具体列出的基本上由其组成主题的元素之外，主题还包含20％或更少，特别是15％或更少，10％或更少或尤其是5％或更少的其他元素。
67.在某些实施方案中，根据本发明的肽由细胞摄取信号和bnip3片段组成。
68.在另外的实施方案中，根据本发明的肽包含细胞摄取信号、bnip3片段和细胞摄取信号与bnip3片段之间的接头。尤其地，根据本发明的肽由细胞摄取信号、bnip3片段和细胞摄取信号与bnip3片段之间的接头组成。接头可以是由氨基酸组成的肽接头，或化学接头。所述接头特别地具有小的尺寸。例如，其为具有10个或更少氨基酸，诸如8个或更少、6个或更少或5个或更少的氨基酸的肽接头。化学接头的分子量为例如1500da或更小，诸如1000da或更小、750da或更小或500da或更小。在其中细胞摄取信号是肽部分的实施方案中，接头优选是肽接头。
69.在某些实施方案中，根据本发明的肽的长度为40个氨基酸或更少。在具体实施方案中，根据本发明的肽的长度为35个氨基酸或更少，尤其是30个氨基酸或更少。根据本发明的肽的长度可以为例如25个氨基酸或更少，诸如约20个氨基酸。较短的肽是尤其期望的，因为它们可被更容易地生产、配制和处理。因此，根据本发明的肽的长度优选为35个氨基酸或更少，尤其是25个氨基酸或更少。这特别是指其中细胞摄取信号是肽部分的实施方案。在具体实施方案中，根据本发明的肽的分子量为10000da或更小，尤其是5000da或更小，4000da或更小或3,000da或更小。
70.在某些实施方案中，根据本发明的肽具有选自seq id no:51至67的氨基酸序列。
71.通常，根据本发明的肽由天然存在的l-氨基酸组成。在某些实施方案中，肽还可包括人工氨基酸。例如，肽可包含一个或多个d-氨基酸、e-β-同氨基酸和/或n-甲基化氨基酸；或者其可由它们组成。在某些实施方案中，细胞摄取信号和/或bnip3片段是d-反向-翻转序列，尤其是本文所述氨基酸序列的d-反向-翻转序列。例如，该肽具有qprrrqrrkkrg-nsfhlevwsgqlneegsqsm(seq id no:68)或qprrrqrrkkrg-nsfhlevw(seq id no:69)的d-反向-翻转序列。
72.在某些实施方案中，肽被乙酰化、酰化、甲酰化、酰胺化、磷酸化、硫酸化、亚硝基化、糖基化、sumo化(suomylated)、羟基化、烷基化和/或异构化。例如，肽可包含n-末端乙酰基、甲酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、羧基或2-岩藻糖基(2-furosyl group)和/或c-末端羟基、酰胺基、酯基或硫代酯基。此外，肽可被环化。
73.在具体实施方案中，根据本发明的肽是本文所述任何肽的肽模拟物。如本文中所用，术语“肽模拟物”是指在分子间相互作用中作为肽替代物的结构。肽模拟物包括可以含有或可以不含有氨基酸和/或肽键但保留bnip3肽的结构和功能特征的合成结构。肽模拟物还包括将肽掺入具有其他功能元件、类肽(peptoid)、寡类肽(oligopeptoid)的更大分子中的分子，和包含具有设计长度的肽的肽文库，所述肽文库代表了对应于本发明的肽的所有可能的氨基酸序列。所有这些肽以及与这些肽基本同源、互补或另外地在功能或结构上等同的分子都可用于本发明的目的。
74.在某些实施方案中，根据本发明的肽存在于进一步包含纳米颗粒的组合物中。尤
其地，肽存在于纳米颗粒中。纳米颗粒可以是任何适于封装肽的纳米颗粒。示例性纳米颗粒包括脂质体、纳米乳液、固液纳米颗粒、纳米结构化的脂质载体、聚合纳米颗粒和树枝状聚合物(dendrimer)。在某些实施方案中，纳米颗粒在其外表面包含靶向分子，诸如肽、配体或抗体，其使得能够将本发明的肽靶向到所需的细胞或组织。
75.在具体的实施方案中，纳米颗粒使得能够将根据本发明的肽摄取到靶细胞中。在这些实施方案中，纳米颗粒可以执行细胞摄取信号的任务，并且特别地是细胞摄取信号或替代细胞摄取信号。因此，本发明还提供了包含本文定义的bnip3片段的纳米颗粒。
76.肽的治疗用途
77.本发明提供了治疗其中期望抑制bnip3、bax和线粒体的单独的活性和途径间通信的受试者的疾病或疾患的方法、化合物和组合物，包括以有效治疗受试者的疾病或疾患的量向受试者施用所述化合物。
78.本发明还提供了包含根据本发明的肽的药物组合物。具体而言，药物组合物以单位剂量的可施用的形式包含根据本发明的肽。本发明还提供了抑制细胞损伤和细胞死亡的方法，包括向有需要的人施用有效量的根据本发明的肽。本发明还提供了根据本发明的肽或包含该肽的药物组合物在医学中的用途，尤其是分别在治疗再灌注相关和/或线粒体相关的病症以及癌症疗法诱发的心脏毒性和预防此类疾病中的用途。
79.本发明包括所列举的特定实施方案的所有组合，就好像每个组合已被费力地分别列举一样。
80.本发明还提供了抑制受试者中bnip3的方法，所述方法包括使bnip3与一种或多种本文公开的任何肽或药物组合物(以有效抑制bnip3的量)接触。优选地，bnip3在受试者中，并且向受试者施用一种或多种肽或组合物。
81.本发明还提供了抑制受试者中的bax的方法，其包括使bax与一种或多种本文公开的任何肽或药物组合物(以有效抑制bax的量)接触。优选地，bax在受试者中，并且向受试者施用一种或多种肽或组合物。
82.本发明还提供了抑制受试者中的bnip3/bax二聚体和/或寡聚体活性的方法，包括使bnip3/bax二聚体和/或寡聚体与一种或多种本文公开的任何肽或药物组合物(以有效抑制bnip3/bax二聚体/寡聚体活性的量)接触。优选地，bnip3和bax在受试者中，并且向受试者施用一种或多种肽或组合物。
83.本发明还提供了治疗受试者中再灌注相关和/或线粒体相关的病症的方法，包括以治疗有效量向受试者施用根据本发明的肽或药物组合物。
84.本发明还提供了治疗或预防受试者中由于线粒体诱导的凋亡或坏死引起的组织损伤的方法，包括以治疗有效量向受试者施用根据本发明的肽或药物组合物。所述肽可在细胞死亡或损伤发生之前、期间和/或之后向受试者施用。
85.被施用肽或药物组合物并接受治疗的受试者可患有例如选自由以下组成的组的疾病或疾患：缺氧和/或缺血细胞；心脏、脑、肝脏、肾脏、肠、肢体缺血、肢体血管闭塞；心脏、脑、肝和肾、肠、肢体再灌注损伤；心肌梗塞和再灌注损伤；化学疗法、放射疗法、靶向疗法和免疫疗法引发的心脏毒性；动脉粥样硬化；心力衰竭；心脏、肝脏、肾脏移植；动脉瘤；慢性肺病；缺血性心脏病；高血压；肺动脉高压；栓塞；血栓形成；心肌病；中风；神经退行性疾病或病症；免疫紊乱；肾脏缺氧；肝炎；肝病；肾病；小脑变性；器官移植排斥，以及涉及细胞死亡
和/或组织损伤的疾病或病症。在某些实施方案中，受试者患有，尤其是在血管闭塞后患有缺血相关病症、再灌注相关病症和/或线粒体相关病症，尤其是心肌梗塞、缺血性中风、急性肾损伤、创伤、循环停止和器官移植期间的缺血。在另外的实施方案中，受试者患有癌症疗法诱发的心脏毒性，例如由化学疗法、放射疗法、免疫疗法和/或靶向疗法诱发的心脏毒性。或者受试者可接受任何种类的癌症疗法，并且该疗法可用于预防心脏毒性。化学疗法尤其是指基于蒽环类药物的化学疗法，诸如利用多柔比星的疗法。在具体的实施方案中，受试者患有由基于蒽环类药物的疗法(诸如利用多柔比星的化学疗法)诱发的心脏毒性。
86.再灌注相关病症通常可指涉及再灌注损伤的病症。再灌注损伤是当例如血液供应在缺血一段时间后回复到组织时引起的组织损伤，其中循环的恢复通过诱导氧化应激而不是恢复正常功能而导致炎症和氧化损伤。因此，本发明提供了治疗受试者中再灌注损伤的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的肽或药物组合物。
87.本发明还提供了治疗受试者中急性心肌梗塞、心肌再灌注损伤或心力衰竭的方法，其包括以有效治疗有需要的受试者中急性心肌梗塞、心肌再灌注损伤或心力衰竭的量向受试者施用一种或多种本文公开的肽或药物组合物。优选地，以分别有效抑制受试者中的bnip3、bax或bnip3/bax二聚体/寡聚物活性的量施用所述一种或多种肽或药物组合物。
88.在某些实施方案中，治疗包括减轻和/或预防再灌注和线粒体相关损伤。在另外的实施方案中，治疗包括减轻和/或预防癌症疗法诱发的心脏毒性。
89.受试者可以是例如哺乳动物，并优选为人。
90.如本文中所用，“治疗(treating)”或“治疗(treat)”疾病或病症意指减轻或改善或消除正在治疗的疾病或病症的体征或症状。当在疾病或病症发作之前或之时向受试者施用所述肽或组合物时，所述肽或组合物可以预防或降低疾病或病症的严重性。例如，向受试者施用所述肽或组合物可以预防或降低癌症疗法诸如化学疗法、放射疗法、靶向疗法或免疫治疗诱发的心脏毒性的严重性。在这些实施方案中，根据本发明的肽可以在癌症疗法之前、期间和/或之后施用。肽的施用可包括预防性和/或治疗性施用。
91.可使用本领域已知的施用途径向受试者施用本发明的肽和组合物。施用可以全身性的或局限于特定的部位。施用途径包括但不限于静脉内、肌内、心内、鞘内或皮下注射、口服或直肠施用以及注射到特定部位。
92.在具体的实施方案中，在出现血液供应受损、局部缺血或血管闭塞期间或之后，特别是在受血管闭塞影响的组织再灌注之前，向受试者施用根据本发明的肽或药物组合物。在某些实施方案中，在再灌注前6小时内，特别是在再灌注前4小时内、2小时内或1小时内施用所述肽或药物组合物。在具体实施方案中，在再灌注前45分钟内，尤其是30分钟内施用所述肽或药物组合物。
93.除非本文另有指示或者另外地上下文明显矛盾，否则本文所述的各种元素的所有组合都在本发明的范围内。
94.所述方法可包括在细胞中表达有效量的根据本发明的肽，其中与对照细胞相比，细胞中的凋亡、坏死或其组合被改变。表达可以包括，例如，将编码肽的多核苷酸引入细胞。细胞可以是离体的或体内的，并且可以是心肌细胞。细胞中的凋亡、坏死或其组合可减少。
95.本发明提供了方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含编码根据本发明的肽的多核苷酸，其中受试者中的凋亡、坏死或其组合增加。施
用可包括将多核苷酸递送至心脏组织、脑组织、肝组织和肾脏组织。受试者可具有选自于急性梗塞、缺氧、局部缺血、中风或血管疾病的疾病的症状或可具有患所述疾病的风险。所述方法可以减少疾病的体征。
96.如本文中所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸(无论是核糖核苷酸还是脱氧核苷酸)的聚合形式，并且包括双链和单链rna和dna。多核苷酸可以直接从天然来源获得，或者可以借助重组、酶促或化学技术制备。多核苷酸在拓扑学上可以是线性的或环状的。多核苷酸可以是例如载体诸如表达或克隆性载体的一部分，或片段。多核苷酸可包括具有不同功能的核苷酸序列，包括例如编码区和非编码区诸如调控区。
97.如本文中所用，“基因”是指编码mrna的核苷酸序列。基因在其5’末端具有转录起始位点，在其3’末端具有转录终止子。如本文中所用，“靶基因”是指其表达被本文所述的多核苷酸抑制的特定基因。如本文中所用，“靶mrna”是由靶基因编码的mrna。除非另有说明，否则靶基因可通过使用不同的外显子组合产生多种可区分的mrna。此类相关的mrna被称为基因的剪接变体或转录变体。
98.如本文中所用，术语“编码区”和“编码序列”可互换使用，是指编码多肽的核苷酸序列，并且当被置于适当的调控序列控制下时，表达编码的多肽。编码区的边界通常由其5’末端的翻译起始密码子和其3’末端的翻译终止密码子决定。“调控序列”是调控与其可操作连接的编码序列表达的核苷酸序列。调控序列的非限制性实例包括启动子、增强子、转录起始位点、翻译起始位点、翻译终止位点和转录终止子。术语“可操作地连接的”指的是部件的并置，使得它们处于允许它们以其预期方式起作用的关系。当调控序列以在与调节序列相容的条件下实现编码区表达的方式连接时，调节序列与编码区“可操作地连接”。
99.包含编码区的多核苷酸可以包含侧翼于编码区一侧或两侧的异源核苷酸。如本文中所用，“异源核苷酸”是指通常不侧翼于野生型细胞中存在的编码区的核苷酸。例如，在野生型微生物中存在并编码多肽的编码区的侧翼是同源序列，编码区侧翼的任何其他核苷酸序列被认为是异源的。异源核苷酸的例子包括但不限于调控序列。通常，通过使用本领域技术人员熟知的标准遗传和/或重组方法，异源核苷酸存在于本发明的多核苷酸中。本发明的多核苷酸可以包含在合适的载体中。侧翼于本文所述的多核苷酸一侧或两侧的异源核苷酸的存在源于人操作。
100.如本文中所用，术语“互补”和“互补的”是指两个单链多核苷酸相互碱基配对的能力，其中多核苷酸的一条链上的腺嘌呤将与第二多核苷酸的一条链上的胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基配对，并且多核苷酸的一条链上的胞嘧啶将与第二多核苷酸的一条链上的鸟嘌呤碱基配对。当一个多核苷酸中的核苷酸序列可以与第二多核苷酸中的核苷酸序列碱基配对时，两个多核苷酸相互互补。例如，5
’‑
atgc与5
’‑
gcat是互补的。如本文中所用，术语“大体上互补”及其同源词是指能够在严格杂交条件下与指定的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸。严格杂交可以在许多ph、盐和温度条件下进行。ph值可从6变化至9，优选从6.8变化至8.5。盐浓度可从0.15m的钠变化至0.9m的钠，并且可以使用其他阳离子，只要所述离子强度等于钠的指定离子强度。杂交反应的温度可从30℃变化至80℃，优选从45℃变化至70℃。另外，可以向杂交反应中加入其他化合物，以促进在较低温度下(诸如在室温或接近室温的温度下)的特异性杂交。甲酰胺是预期用于降低温度要求的化合物之一。因此，如果多核苷酸与第二多核苷酸之间发生杂交，则多核苷酸通常与第二多核苷酸大体上互补。如本文中所用，“特
异性杂交”是指两种多核苷酸之间在严格杂交条件下的杂交。
101.包含编码区的多核苷酸可以包含侧翼于编码区一侧或两侧的异源核苷酸。如本文中所用，“异源核苷酸”是指通常不侧翼于野生型细胞中存在的编码区的核苷酸。例如，在野生型微生物中存在并编码多肽的编码区的侧翼是同源序列，编码区侧翼的任何其他核苷酸序列被认为是异源的。异源核苷酸的例子包括但不限于调控序列。通常，通过使用本领域技术人员熟知的标准遗传和/或重组方法，异源核苷酸存在于本发明的多核苷酸中。本发明的多核苷酸可以包含在合适的载体中。侧翼于本文所述的多核苷酸一侧或两侧的异源核苷酸的存在源于人操作。
102.本发明还提供了用于预防细胞损伤或细胞死亡的方法，其包括将细胞与根据本发明的肽接触。该方法可以在体外或体内进行，特别是离体地进行。
103.本发明还提供了筛选适于预防再灌注损伤和/或线粒体相关病症和/或癌症疗法诱发的心脏毒性的化合物的方法，其包括
104.(i)提供一种或多种候选化合物；
105.(ii)确定候选化合物干扰bnip3与bax结合的能力；
106.(iii)选择那些干扰bnip3与bax的结合的候选化合物。
107.候选化合物可以是任何合适的化合物，尤其包括肽和小分子化合物。
实施例
108.实施例1:bnip3代表i/r损伤的治疗靶点
109.坏死和凋亡心肌细胞死亡的结合是再灌注损伤早期的标志。线粒体在这两个过程中起主要作用。仅含bh的bcl2家族成员bnip3是细胞培养物和分离的大鼠心脏中线粒体驱动的坏死和凋亡细胞死亡级联的潜在激活剂
31,32,36-38
。bnip3以前曾被认为与急性心肌梗塞后左心室重构和射血分数保持不变的心力衰竭相关
33,39,40
。为了研究bnip3在i/r损伤中的参与以及bnip3是否为治疗性干预提供了有吸引力的靶标，在临床相关体内模型
41-44
中，野生型和bnip3缺陷型小鼠在左前降支冠状动脉(left anterior descending coronary artery)闭塞后接受24小时的再灌注(图1a)。为了将受影响区域与非受影响的区域区分开来，将evans蓝染料注射到主动脉和冠状动脉中。为了划分无活性心肌、风险区内的梗塞区域，将心脏切片用氯化三苯基四唑染色(图1b)。与之前在分离的大鼠心脏中使用公认的bnip3的主要负抑制剂的研究一致
31
，与野生型小鼠相比，bnip3的遗传切除产生了显著减少46％的梗塞面积(图1c)。相应地，将bnip3恢复到bnip3缺陷型小鼠以剂量依赖的方式导致了与野生型小鼠相当的梗塞面积，并且排除了bnip3基因缺失的可能副作用(图1c)。这些结果表明bnip3在体内梗塞的演变中起着重要作用。
110.实施例2:bnip3是i/r损伤中bax诱导的细胞死亡的调节子
111.促死亡bcl-2家族成员bax似乎作为效应蛋白位于线粒体依赖性坏死和凋亡的交叉点5。为此，bax从胞质向线粒体的易位是关键步骤
37,45,46
。我们最近证明了bax与bnip3的基础相互作用在体内发生在心肌细胞中的mom中
35
。为了确定作为细胞死亡中最相关步骤的bax向线粒体的易位是否发生在i/r中并依赖于bnip3，首先研究了线粒体bax和bnip3浓度的变化。在血管闭塞后再灌注10分钟后，mom中的bax水平显著增加，同时bnip3的线粒体浓度增加(图2a和图2b)。免疫共沉淀显示bnip3和bax在mom中形成异二聚体(图2c)。通过利用
bnip3缺陷型小鼠，接下来我们检测了bnip3是否是再灌注损伤期间这种易位的bax上游调节子。在bnip3的遗传切除下，在再灌注的早期阶段没有观察到线粒体bax的增加，证明了bnip3的直接影响(图2d)。为了验证bnip3真的能实现这种效果，我们在开始心肌梗塞程序前5分钟向bnip3缺陷型小鼠心脏施用bnip3。bnip3的加入恢复了再灌注的早期阶段中bnip3缺陷型小鼠心脏中的bax易位，并排除了bnip3的基因缺失的可能副作用(图2d)。
112.实施例3:i/r损伤中bnip3抑制所需的关键bnip3序列的鉴定
113.由于bnip3与bax的相互作用被认为是免疫共沉淀体内再灌注损伤中的实质性活性(通过免疫共沉淀评估)，我们通过评估肽微阵列确定bax中的螺旋α5、α6、α7和α8为潜在结合位点，该肽微阵列具有13个合成的bax肽的文库(图3a和图3b)。对于这项研究，我们使用modeller 9.15
47
通过同源性建模在计算机上预测了bnip3的3d结构(图3c)。使用namd2.9和charmm36力场对创建的模型进行能量最小化。bnip3模型描绘了9个可变长度的α-螺旋，其代表64％，随后是19％的随机卷曲和17％的未识别的结构，这通过圆二色光谱得到了证实(图3d)。计算对接模拟表明bax螺旋α5、α6、α7和α8以及bnip3序列msqsgeenlqgswvelhfsn(氨基酸1-20；seq id no:20)作为相互作用位点(图3e)，而单独的前10个氨基酸未能与bax结合(图3f)。我们假设bnip3的氨基酸1-20可足以拮抗bnip3的活性，因此我们设计了一种细胞可渗透肽(tat-bnip3-20a肽)，其由通过共价键附接至源自bnip3的氨基酸1-20的20个氨基酸的hiv-1tat蛋白转导结构域(ptd,grkkrrqrrrpq(seq id no:31)，图3g)
48,49
组成(图3h)。bnip3的氨基酸42-61用于产生对照肽tat-bnip3-20c(图3i)。肽片段在n末端用乙酰基封端，并在c末端用酰胺基封端。用tat-bnip3-20a处理野生型小鼠证明该肽被心肌吸收(图3j)，并在那里与内源性bnip3相互作用。
114.为了检查在再灌注前5分钟(与临床实践相关的时间点)给予的tat-bnip3-20a是否具有拮抗bnip3活性和减少体内再灌注损伤的能力，我们在小鼠中使用了给定的心肌梗塞模型(图4a)。利用tat-bnip3-20a的处理，导致梗塞面积减少37％，但利用媒介物的处理和利用tat-bnip3-20c的处理均不能导致梗塞面积减少37％(图4b)。这是由于tat-bnip3-20a肽片段防止bnip3向线粒体易位(图4c)，导致半胱天冬酶-3活性被显著抑制，这是线粒体膜扰动后i/r的关键事件(图4d)。
115.实施例4:tat-bnip3-20a肽片段抑制凋亡和坏死的人心肌细胞死亡
116.为了满足转化需要，在源自人诱导的多能干细胞(人cm)的人心室心肌细胞中进行了复氧实验(图5a)。将人cm在缺氧后暴露于2h的复氧。值得注意的是，即使在人cm中，tat-bnip3-20a也显示出其保护特性。bnip3-20a能够防止人bnip3向线粒体的易位(图5b)，导致通过低的线粒体内膜去极化(图5c)和更少的凋亡和坏死细胞(图5d)所证明的对线粒体的相当大的保护。
117.实施例5:bnip3/bax活性的肽片段抑制剂的鉴定与设计
118.将bnip3-20a肽序列的n-末端截短，随后交换单个残基，揭示了在肽微阵列中，含有氨基酸13-20并联合了在位置19处的ser至phe取代的肽显示出显著更高的bnip3结合(见表1)。
119.表1:显示对bnip3的最高结合能力的截短的bnip3-20a片段
[0120][0121]
基于这些结果，我们设计了bnip3-8b肽，其由通过共价键附接至8个氨基酸的ptd组成，所述8个氨基酸源自具有ser-19至phe-19的取代的bnip3的氨基酸13-20(wvelhffn(seq id no:8)；图6a)。为了证明肽序列中需要苯丙氨酸残基，我们将phe-18替换为ala-18，另外将his-17替换为ala-17，生成了bnip3-8c肽(图6b)。bnip3-8b的圆二色性光谱显示该肽呈现随机卷曲构象(图6c)。
[0122]
此外，用bnip3-20a肽进行bnip3/bnip3相互作用研究，其中bnip3 1-20的野生型序列的单个残基被交换为18个中性氨基酸。具有特定氨基酸取代的bnip3肽显示出对bnip3的结合能力增加(示例性数据示于表2中)。
[0123]
表2:取代的bnip3-20a肽显示出对bnip3的最高结合能力
[0124][0125]
实施例6:tat-bnip3-8b肽片段摄取、毒性和稳定性的体内和体外效应
[0126]
首先，我们评估了在体内达到所需效果时，bnip3-8b在心内注射的分布和存在。接下来，我们评估了tat-bnip3-8b在人血清、血浆和全血中的药代动力学谱，并评估了在分离的成年心肌细胞中的毒性。tat-bnip3-8b被心脏、脾脏和肝脏吸收，并存在于血浆中(图7a)。因此，再灌注后10分钟，即当bnip3-bax-线粒体三角细胞死亡级联发生的时间点，心脏内存在tat-bnip3-8b；心肌细胞没有显示出明显毒性的体征(图7b)，tat-bnip3-8b在人血清、血浆和全血中的半衰期使其具有体内抑制能力(图8a-c)。以tat-bnip3-8b与蛋白酶k一起的孵育作为对照。
[0127]
实施例7:tat-bnip3-8b肽的作用机制
[0128]
假设tat-bnip3-8b与bnip3和bax单体和同二聚体结合，并与bnip3/bax异二聚体
和异寡聚物结合，以打断它们的活性。为了评估tat-bnip3-8b、bnip3/tat-bnip3-8b以及bax/tat-bnip3-8b的相互作用行为，进行了覆层测定(overlay assay)和对接模拟。这两个结果都表明tat-bnip3-8b与bnip3和bax结合(数据未显示)。
[0129]
值得注意的是，在心肌梗塞模型(图9a)中，再灌注后5分钟内源性bnip3和bax单体、同和异二聚体与荧光标记的tat-bnip3-8b免疫共沉淀(图9b)。此外，再灌注驱动bnip3和bax寡聚化，由bnip3和3bax组成的寡聚体的大规模形成证明了这一点(图9c)。sds-page和免疫共沉淀实验揭示了高级寡聚复合物中bnip3/bax的异相互作用(hetero-interaction)，这种寡聚化被tat-bnip3-8b处理强烈抑制(图9c)。
[0130]
实施例8:tat-bnip3-8b减小心肌梗塞面积
[0131]
然后我们研究了在适当的心肌梗塞模型中开始再灌注前5分钟给予的tat-bnip3-8b处理的功效和效果(图9a)。值得注意的是，与媒介物和tat-β-gal处理相比，tat-bnip3-8b以剂量依赖的方式将梗塞面积减小了高达40％(图9d和e)。相对于tat-bnip-8b，tat-bnip3-8c处理不会明显影响梗塞面积，这指出了苯丙氨酸残基的重要性(图9d)。
[0132]
实施例9:tat-bnip3-8b减少线粒体扰动和细胞死亡级联
[0133]
线粒体损伤可通过线粒体内膜(mim)和mom的扰动发生。坏死中的关键线粒体事件是mim中线粒体通透性转换孔(mptp)的早期开放
50
，这导致跨mim的电势差的时间依赖性消散，随后线粒体肿胀并且细胞破裂。凋亡中的关键线粒体事件是bax激活诱导其跨膜区暴露和mom通透化，从而允许凋亡因子例如细胞色素c释放，和随后的半胱天冬酶激活
51
。在给定的体内i/r模型中，在再灌注前5分钟注射入左心室的tat-bnip3-8b防止bnip3和bax向线粒体易位，这导致抑制下游细胞死亡机制，包括线粒体肿胀、bax激活、细胞色素c释放和半胱天冬酶-3活性。
[0134]
实施例10:tat-bnip3-8b抑制凋亡和坏死心肌细胞死亡
[0135]
测试了tat-bnip3-8b是否能抑制人cm中的细胞死亡。将人cm在缺氧后暴露于2h的复氧(图11a)。bnip3-8b显著抑制坏死和凋亡细胞死亡(图11b)以及线粒体内膜电位的丧失(图11c)。
[0136]
实施例11:tat-bnip3-8b减少脑梗塞面积
[0137]
由于bnip3被认为在脑缺血中起关键作用
38
，我们还在小鼠局灶性脑再灌注模型中评估了bnip3-8b肽对临床结果的影响。我们让小鼠在短暂性大脑中动脉闭塞(tmcao)30分钟后再灌注24h。tmcao后立即进行bnip3-8b处理使梗塞面积显著减少52％(图12)。
[0138]
实施例12:tat-bnip3-8b减少猪中心肌梗塞面积
[0139]
然后我们在猪心肌梗塞模型中研究开始再灌注前5分钟给予的tat-bnip3-8b处理的功效和效果。对猪进行60分钟的左前降支冠状动脉闭塞，然后再灌注4h。值得注意的是，与媒介物相比，tat-bnip3-8b使梗塞面积显著减少了56％(图13)。
[0140]
实施例13:tat-bnip3-8b对多柔比星诱导的线粒体损伤有保护作用。
[0141]
我们在hl-1细胞中评估了bnip3-8b肽对多柔比星诱导的线粒体损伤的影响。为了监测线粒体肿胀，用5μm多柔比星处理hl-1细胞，在患者中再现通过标准输注达到的血浆峰值浓度。通过在540nm处的光密度测量线粒体的肿胀，其中由于肿胀导致的线粒体体积增加导致光密度降低。与多柔比星同时给予的tat-bnip3-8b防止线粒体肿胀，如通过od
540
增加所指示的(图14)。这些数据表明tat-bnip3-8b可以保护线粒体免受诸如蒽环类药物的化学
疗法介导的损伤。
[0142]
实施例14:方法
[0143]
化学品获自sigma aldrich。抗bnip3、微管蛋白、细胞色素c和bax的抗体获自abcam，激活的bax获自enzo。
[0144]
动物。使用年龄相似(12
±
3周)且平均体重为30g的雄性小鼠。c57bl/6野生型小鼠获自从jackson实验室(bar harbor,me,usa)，并在当地动物房中保持一周以适应新环境。
[0145]
c57bl/6j-tgh(bnip3-/-)小鼠获自center for molecular cardiovascular research and department of pediatrics,university of cincinnati,cincinnati,ohio,usa的gerald w.dorn教授。通过用新霉素抗性盒替换外显子2和3来产生小鼠
33
。所述小鼠被饲养和保持在university hospital essen的当地动物房里。所有实验均由当地伦理委员会根据european convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes(第2010/63/eu号指令)批准。
[0146]
小鼠体内心肌梗塞模型。通过i.p.注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)麻醉野生型和bnip3缺陷型(bnip3-/-)小鼠，并进行插管。使用小鼠微型呼吸机，将机械通气参数设置为2.1至2.5ml的潮气量和每分钟140次呼吸的呼吸速率。通过向通气气体中加入2vol％的异氟烷来维持深度麻醉。通过侧剖胸廓切开术(第3与第4肋骨之间1cm的左侧切口)打开胸部。在左冠状动脉(lca)周围放置6-0prolene缝线，在动脉上放置一块软硅管。通过收紧缝线并将其打结来实现冠状动脉闭塞。闭塞30分钟后，取出硅管，将缝线留在原位。对于较长的再灌注时间，使用4-0prolene封闭胸腔。在血管闭塞前5min，向左心室腔内注射2、6和9nmol(在50μl 0.9％的氯化钠中)bnip3。在再灌注前5分钟，注射在nacl中的具有20个氨基酸的肽(2nmol/50μl)和具有8个氨基酸的肽(8nmol/50μl)。氯化钠注射(50μl)作为对照处理。
[0147]
猪体内心肌梗塞模型。麻醉诱导后，在股动脉和股静脉上做一个小切口；分离出血管。在动脉上开了个小孔，并引入了鞘。另外，在股静脉或其他合适的静脉中放置鞘，以便在必要时进行紧急给药。在施用肝素之前采集血样，并用于建立基线活化凝血时间(act)，记录该时间。随后，在外科医生的指导下，根据需要施用肝素(250至350iu/kg)，以实现并维持两倍于基线act水平的act。初次注射肝素后，再次记录act，此后至少每60分钟监测一次，直到手术完成。
[0148]
使用由荧光镜检查提供的视觉引导，将合适的引导导管推进到左前降支动脉(lad)的开口中。非离子造影剂用于所有手术。通过引导导管将球囊导管推进到冠状动脉左前降支(lad)来引入球囊导管。通过引导导管将球囊推进到冠状动脉中，到达lad的第一对角支上方的合适位置。然后将气囊充气至足以确保动脉完全闭塞的压力。使用荧光镜检查证实动脉闭塞。在证实闭塞后，让气囊在动脉中膨胀60分钟。研究记录中记录了发病支持药物(incidence supportive drug)和心脏除颤。在再灌注前5分钟通过静脉注射分别施用肽和媒介物。在血管闭塞期结束时，将球囊放气，并允许缺血区域再灌注。利用荧光镜检查证实完全气囊放气。手术结束时，移除所有导管，对动脉和静脉进行结扎，并以标准方式闭合切口。再灌注4小时后，对动物实施无痛致死。
[0149]
梗塞面积测量。为了分析梗塞面积，在再灌注24小时后对小鼠实施无痛致死；切下心脏并用pbs灌注5分钟以上。灌注后，如前所述，在相同的位置重新结扎lca。将evans蓝染
料(1ml的1％溶液)注射到主动脉和冠状动脉中，用于划分缺血性aar与非缺血性区域。将组织包裹在透明的食品包装中，并在-20℃的冰箱中储存一个小时。然后将心脏垂直于长轴连续切成1mm的切片，并对每片切片进行称重。将切片在1％ttc中于37℃下孵育5分钟，以区分风险区内的存活心肌与非存活心肌。由不知道样品身份的观察者用计算机辅助测面法评估梗塞、aar和非缺血性左心室。心肌梗塞的面积表示为aar的百分比。
[0150]
免疫印迹。在rips缓冲液(50mm tris-hcl,150mm nacl,0.5mm edta,1％np-40和蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，ph 7.4)中裂解组织和人cm细胞。在mito-裂解缓冲液(200mm蔗糖，10mm hepes,1mm egta,1％triton-x100和蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，ph 7.4)中裂解分离的线粒体。通过离心(20.000xg,15min,4℃)清除裂解物。使用dc蛋白质测定法(bio-rad)测量上清液中的蛋白质浓度。将样品稀释到4x lds样品缓冲液和10x还原剂(invitrogen)中，并通过加热至95℃进行5分钟来制备用于sds-page。使用4-12％的bis-tris凝胶(invitrogen)分离等量的蛋白质，将所述蛋白质转移到硝酸纤维素上并用一抗进行免疫印迹。使用的二抗是缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠或抗兔igg(invitrogen)。免疫印迹通过ecl(thermo scientific)检测，并在成像仪600(amersham)上进行成像。
[0151]
相互作用研究。对于蛋白质-肽相互作用的研究，合成肽库，并将其固定在微阵列载玻片上。重组bnip3以1μg/ml的浓度使用。合成肽并将其固定用于：(i)bnip3/bax相互作用研究；(ii)bnip3/bnip3相互作用研究，其中对bnip3 1-20的野生型序列进行了c末端、n末端或c/n末端截短；和(iii)bnip3/bnip3相互作用研究，其中将bnip3 1-20的野生型序列的单个残基交换为18个中性氨基酸。
[0152]
微阵列。对于蛋白质-肽结合研究，分别以10μg/ml和1μm/ml的浓度使用重组bnip3(cusabio)和bax(mybiosource)。作为标记试剂盒，使用了带有标记dylight 650的dylight microscale antibody labeling试剂盒(thermo)。使用自动tecan hs4800微阵列处理站进行测定。将微阵列与客户提供的样品(稀释在封装缓冲液中)于30℃下孵育2h。在每个步骤之前，微阵列用洗涤缓冲液洗涤。使用高分辨率荧光扫描仪扫描微阵列。激光设置和应用的分辨率对于所有进行的测量都是相同的。使用斑点识别软件genepix(molecular devices)对所得的图像进行分析和定量。对于每个点，提取平均信号强度(在0与65535个任意单位之间)。为了进一步的数据评估，确定了所谓的mmc2值。mmc2等于微阵列上所有三个实例的平均值，除非变异系数(cv)-标准偏差除以平均值-大于0.5。在这种情况下，将两个最接近的值(mc2)的平均值赋予mmc2。所有步骤均由jpt peptide technologies(berlin,germany)执行。
[0153]
bnip3的计算机三维(3d)结构建模。通过使用modeller9.15的同源性建模获得了bnip3的预测的计算机3d结构，并且使用namd2.9和charmm36力场使所创建的模型能量最小化。
[0154]
圆二色(cd)光谱。在37℃，ph＝7.4，1x pbs下bnip3蛋白和bnip3-8b肽的cd光谱记录在jasco j-715分光偏振计上。
[0155]
对接模拟。使用autodock vina
52
和haddock
53
进行实验。bax的结构(pdb-id:4s0o)取自蛋白质数据库(protein data bank)，而bnip3和肽bnip3-8b的结构是使用modeller9.15
47
建模的。模板结构对应于pdb码2k7w和2ka1。创建的模型使用namd2.9
54
和charmm36力场来进行能量最小化。
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