靶向刺突蛋白HR1的订书肽、制备方法及抗冠状病毒应用与流程

靶向刺突蛋白hr1的订书肽、制备方法及抗冠状病毒应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种多肽药物，具体涉及一种靶向刺突蛋白hr1的订书肽、制备方法及应用。


背景技术：

2.sars-cov-2导致的肺炎疾病疫情对我国国计民生产生了不可估量的损失。作为2003年sars病毒的姐妹病毒，sars-cov-2引发的肺炎疫情范围更广、危害更大。人感染了sars-cov-2后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。sars-cov-2的最可怕之处在于较强的传染性以及较长的潜伏期，由此引发的无症状传染者使得疫情防控工作难度加大。在这场疫情防控攻坚战中，寻找抑制sars-cov-2的手段是一个极大的挑战。虽然目前预防或治疗sars-cov-2的特效药物还没有。但是像瑞德西韦和一些糖皮质激素，如地塞米松，已经产生了一些好的效果，但药物副作用明显。
3.多肽分子以其亲和力高、选择性好、毒性低等优点，在药物开发中占据着重要的地位。但多肽的成药性问题一直饱受争议，主要原因在于：1)物理环境下多肽稳定性差，易被酶降解；2)多肽透膜能力较差，无法直接进入细胞发挥作用。为此，多个课题组开发了订书肽(stapledpeptides)策略来提高多肽的成药性。订书肽是近年来获得广泛关注的一类稳定性强、透膜性好的多肽模拟物，在很多胞内ppis的调控方面都展示了很好的潜力。
4.目前已经在结构研究中，ek1肽与hr1结构域作为螺旋构象结合，其特征是高度保守的亲水相互作用。然而，ek1作为一种直链肽，具有蛋白水解稳定性和灵活的构象，在一定程度上限制了对膜融合和感染的有效抑制。近年来，订书肽技术利用钌催化烯烃复分解交联肽侧链中的两个非自然氨基酸，可以通过预先形成的稳定螺旋构象，有效提高肽的药理性能。值得注意的是，引入的碳氢主链有时可以增强肽与目标蛋白之间的亲水相互作用。因此，设计合成一系列的订书肽，提高肽的稳定性，螺旋度和抗病毒活性，可能是未来抗病毒药物开发优良的先导化合物。


技术实现要素：

5.本发明依托上述研究进行，针对目前新型冠状病毒、mers病毒等药物治疗缺乏的现状，提供一种具有订书肽及其制备方法和应用。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
6.本发明机理如下：ek1肽与hr1结构域作为螺旋构象结合，其特征是高度保守的亲水相互作用；多肽融合抑制剂可有效与s2亚基中的hr1区域结合，从而阻止hr1区域蛋白与hr2形成6-hb，最终阻断冠状病毒中s蛋白介导的融合机制，抑制病毒的入侵。
7.但ek1作为一种直链肽，具有蛋白水解稳定性和灵活的构象，在一定程度上限制了对膜融合和感染的有效抑制的缺陷进行。本发明以ek1为母肽，设计并合成了一系列基于ek1肽的n，n 4和i，i 7订书肽。
8.本发明的第一方面，提供了靶向刺突蛋白hr1的订书肽，提供了一种靶向刺突蛋白hr1的订书肽，以seq id no.1所示的直链肽sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，将第i位以及第i 7位氨基酸分别被r8(2-氨基-2-甲基-9-葵烯酸)以及s5(2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸)替换并环合得到，或者将第n位以及第n 4位氨基酸同时被s5替换并环合得到。其中，i为12、13或15～23中的任意整数，n为12～29中的任意整数，共29条订书肽。具体如下：
9.1)sek1-2-1：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中12
l
被r8和19
l
被s5替换并环合；
10.2)sek1-2-2：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中13e被r8和20e被s5替换并环合；
11.3)sek1-2-3：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中15e被r8和22a被s5替换并环合；
12.4)sek1-2-4：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中16m被r8和23i被s5替换并环合；
13.5)sek1-2-5：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中17k被r8和24k被s5替换并环合；
14.6)sek1-2-6：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中18k被r8和25k被s5替换并环合；
15.7)sek1-2-7：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中19
l
被r8和26
l
被s5替换并环合；
16.8)sek1-2-8：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中20e被r8和27e被s5替换并环合；
17.9)sek1-2-9：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中21e被r8和28e被s5替换并环合；
18.10)sek1-2-10：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中22a被r8和29s被s5替换并环合；
19.11)sek1-2-11：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中23i被r8和30y被s5替换并环合；
20.12)sek1-1-8：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中13e被s5和17k被s5替换并环合；
21.13)sek1-1-9：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中14y被s5和18k被s5替换并环合；
22.14)sek1-1-10：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中17k被s5和21e被s5替换并环合；
23.15)sek1-1-11：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中20e被s5和24k被s5替换并环合；
24.16)sek1-1-12：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中21e被s5和25k被s5替换并环合；
25.17)sek1-1-13：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其
中24k被s5和28e被s5替换并环合；
26.18)sek1-1-14：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中28e被s5和32d被s5替换并环合；
27.19)sek1-1-15：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中12
l
被s5和16m被s5替换并环合；
28.20)sek1-1-16：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中15e被s5和19
l
被s5替换并环合；
29.21)sek1-1-17：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中16m被s5和20e被s5替换并环合；
30.22)sek1-1-18：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中18k被s5和22a被s5替换并环合；
31.23)sek1-1-19：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中19
l
被s5和23i被s5替换并环合；
32.24)sek1-1-20：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中22a被s5和26
l
被s5替换并环合；
33.25)sek1-1-21：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中23i被s5和27e被s5替换并环合；
34.26)sek1-1-22：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中25k被s5和29s被s5替换并环合；
35.27)sek1-1-23：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中26
l
被s5和30y被s5替换并环合；
36.28)sek1-1-24：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中27e被s5和31i被s5替换并环合；
37.29)sek1-1-25：以sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2为肽链模板，其中29s被s5和33
l
被s5替换并环合。
38.上述29条订书肽的结构示意图如图1所示。
39.本发明的第二方面，提供靶向刺突蛋白hr1的订书肽的制备方法，包括如下步骤：
40.a、溶胀氨基树脂后，并多次洗涤树脂；
41.b、使用脱保护试剂脱去氨基酸上的fmoc保护基；
42.c、使用天然氨基酸缩合的反应液fmoc-aa-oh、肟基氰乙酸乙酯以及dic进行缩合反应，使首个氨基酸的c端与氨基树脂偶联；
43.d、重复进行脱保护-耦合操作，依照氨基酸序列合成肽链；其中，部分环合位点分别以r8和s5替代第i和i 7位氨基酸，或者以s5同时替换第n和n 4位氨基酸；
44.e、使用吡啶和醋酸酐混合溶液对n端脱完保护的氨基酸进行乙酰化；
45.f、在环合剂作用下使环合位点反应，环合肽链；
46.g、使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得相应订书肽。
47.优选，步骤a中，氨基树脂在dcm溶液中溶胀20min；溶胀后依次使用dmf、dcm、dmf分别洗涤树脂5次；
48.步骤b中，脱保护试剂为肟基氰乙酸乙酯、哌啶及dmf的混合溶液，肟基氰乙酸乙酯
的质量百分比为20％，肟基氰乙酸乙酯的浓度为0.1mol/l；脱fmoc保护基的操作条件如下：采用脱保护试剂连续两次作用5min，反应温度为20～30℃。
49.步骤c中，进行缩合反应时，以fmoc-aa-oh为4倍当量，肟基氰乙酸乙酯为4倍当量，dic 4倍当量进行缩合反应，反应温度为50～60℃，偶联反应时间为20-30min；
50.步骤d中，连接环化剂时，以fmoc-s5/r
8-oh 2倍当量，肟基氰乙酸乙酯2倍当量，dic 2倍当量进行缩合反应，反应温度为50～60℃，反应时间2h。
51.步骤e中，吡啶和醋酸酐混合溶液中，吡啶和醋酸酐的体积比为1:1；
52.步骤f中，环合剂为grubbsⅰ试剂的二氯乙烷的溶液，固相载体量:grubbsⅰ试剂:二氯乙烷＝0.3mmol:58mg:6ml；环合时，将氨基酸在环合试剂中震荡两次，每次2h，反应温度为20～30℃。
53.步骤g中，切割试剂为tfa、tips、h2o的混合溶液，体积比为95:2.5:2:5，切割试剂与直链肽的体积质量比为1:10ml/mg，切割的温度为20～30℃，切割的时间为4h；
54.纯化时，先在粗品肽中加入冰乙醚，在3500r/min下离心3min，重复操作5次；再使用反向高效液相色谱对离心后自然挥干的粗品肽进行纯化，条件如下：色谱柱：ymc-pack ods-aq柱；流动相：流动相a为0.1％tfa/水，流动相b为0.1％tfa/乙腈；梯度洗脱程序：35％b洗脱0～5min，35％～65％b洗脱5～60min；流速为20ml/min，进样量为1ml，检测波长214nm和254nm。
55.本发明的第三方面，提供了上述靶向刺突蛋白hr1的订书肽的用途，具体为在制备抗病毒药物中的用途。该抗病毒药物为抗冠状病毒的药物，优选为抗能够与ace2蛋白结合的病毒或抗中东呼吸综合征冠状病毒(mers病毒)的药物，通过阻断病毒与细胞ace2蛋白或cd26蛋白结合，实现抗病毒。能够与ace2蛋白结合的病毒为sars-cov-2病毒或sars冠状病毒。
56.本发明的第四方面，提供了一种抗病毒药物组合物，包括活性组分以及药学上可接受的辅料。活性组分以上述靶向刺突蛋白hr1的订书肽为唯一活性组分，或者包含上述靶向刺突蛋白hr1的订书肽。
57.本发明的药物或药物组合物可以和药学上常用的辅料制成多种剂型，例如其可以是为汤剂、散剂、丸剂、静脉乳剂、脂质体制剂、气雾剂、前体药制剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂等。给药方式不限于口服、注射等。
58.通过实验验证，18k被r8和25k被s5替换并环合的sek1-2-6和21e和24k被s5替换并环合的sek1-1-12具备同时抗hncov、sars-cov-2、mers病毒效果，有潜力作为新一代广谱抗冠状病毒药物进行临床研究，对当前疫情防控及今后潜在的病毒预防具有重要意义。
59.本发明有益效果说明如下：
60.制备方面，本发明以氨基树脂为载体，按照模板肽sldqinvtfldleyemkkle eaikkleesyidlkel-nh2氨基酸序列在dic-oxime缩合体系中，通过fmoc固相合成法，合成得到肽链，其间在保留关键氨基酸残基的基础上，于特定位置以r8或s5代替原有氨基酸，连接在树脂上直链肽在grubbsⅰ试剂的二氯乙烷溶液中进行烯烃复分解反应环合后从树脂切下得到目标订书肽，所得化合物经纯化后，采用hplc及ms等光谱进行表征分析。该方法简便易行，hplc图可见所得订书肽纯度大于95％。
61.效果方面，通过真假病毒实验，本发明的订书肽能够有效抑制新型冠状病毒的生
长和繁殖，并且部分订书肽较直链肽kei蛋白相比活性高，且呈剂量依赖的方式有效抑制新型冠状病毒的感染和复制。
62.本技术发明人基于丰富的研究经验，认识到对kei蛋白进行修饰，合成一系列订书肽，增强其螺旋度和稳定性，从而表现出对新冠病毒更有效的融合抑制活性，实验结果证实了其可显著抑制新型冠状病毒、hncov以及mers病毒的生长和繁殖，在预防和治疗新型冠状病毒方面具有潜在的应用价值。
附图说明
63.图1为本发明中订书肽sek1-2-1～sek1-2-11以及sek1-1-8～sek1-1-25的结构示意图；
64.图2为订书肽的合成路线图；
65.图3为纯化后ek1的高效液相色谱以及质谱图；
66.图4～图21为纯化后sek1-1-8～sek1-1-25的高效液相色谱以及质谱图；
67.图22～图32为纯化后sek1-2-1～sek1-2-11的高效液相色谱以及质谱图；
68.图33为订书肽抗假病毒实验结果；
69.图34为订书肽预防真病毒实验结果；
70.图35为订书肽治疗真病毒实验结果；
71.图36为sek1-1-12的安全性评价结果：(a)对小鼠体重影响；(b)给药前后小鼠体内血清肌酐的浓度变化对比；(c)给药前后血清alt浓度变化对比；(d)对小鼠体内抗体影响；(e)对小鼠体内器官影响；
72.图37为sek1-1-12的有效性评价结果：(a)感染新型冠状病毒仓鼠给药后体重变化；(b)感染新型冠状病毒仓鼠给药后器官组织变化；(c)感染新型冠状病毒仓鼠给药后细胞因子水平变化。
具体实施方式
73.下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
74.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
75.以下实施例，涉及的缩略词解释如下：
76.fmoc：芴甲氧羰基
77.dcm：二氯甲烷
78.dce：二氯乙烷
79.dmf：n,n-二甲基甲酰胺
80.oxyme：ethyl cyanoglyoxylate-2-oxime肟基氰乙酸乙酯
81.dic：n,n-二异丙基碳二亚胺
82.nmp：n-甲基吡咯烷酮
83.s5：2-amino-2-methylhept-6-enoic acid，2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸
84.r8：2-氨基-2-甲基-9-葵烯酸
85.tfa：三氟乙酸
86.tips：三异丙基硅烷
87.grubbsⅰ：苯基亚甲基双(三环已基磷)二氯化钌
88.涉及的实验材料来源如下：
89.氨基酸、氨基树脂购自上海吉尔生化有限公司；n-甲基吡咯烷酮(nmp)、n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)、ethyl cyanoglyoxylate-2-oxime、三氟乙酸(tfa)、乙腈(色谱纯)购自北京百灵威科技有限公司；n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、无水乙醚、二氯甲烷(dcm)、二氯乙烷(dce)、哌啶、苯酚均为分析纯，购自国药集团化学试剂北京有限公司。
90.实施例1本发明抗新冠病毒订书肽的制备
91.1、订书肽结构
92.按照如seq id no.1所示模板直连肽ek1：sldqinvtfldleyemkkleeaikkleesyidlkel-nh2，氨基酸序列设计并合成29条订书肽，具体结构如图1所示。
93.2、订书肽的合成
94.订书肽的合成路线如图2所示，具体步骤如下：
95.1)称量一定量的氨基树脂，使用4ml的dcm溶液中溶胀20min；
96.2)使用20％哌啶/dmf溶液/0.1mol/l oxyma脱去fmoc保护基5min，重复两次；
97.3)使用5mldmf洗涤树脂5次，再使用5mldcm洗涤树脂5次，最后再使用5mldmf洗涤树脂5次。
98.4)使用天然氨基酸缩合的反应液组成fmoc-aa-oh 4倍当量，oxyma 4倍当量，dic4倍当量进行缩合反应，60℃，20min。对于fmoc-s5/r8-oh 2倍当量，oxyma 2倍当量，dic 2倍当量，60℃，2h；
99.5)重复(2)-(4)的操作，依照氨基酸序列依次耦合；其中，部分环合位点分别以r8和s5分别替代i和i 7位氨基酸；
100.6)使用吡啶：醋酸酐＝1:1的溶液对多肽序列n端脱完保护基团的氨基酸进行乙酰化；
101.7)使用grubbs第一代催化剂的二氯乙烷溶液处理树脂，进行环合反应；
102.8)使用切割试剂(tfa/tips/h2o＝95/2.5/2.5,v/v/v)将肽链从树脂上切下。
103.9)在粗品多肽中加入冰乙醚(40ml)，在3500r/min下离心3min，重复操作5次。
104.10)使用rp-hplc对离心后并且通过自然挥干的粗品肽进行纯化。
105.11)采用的纯化方法为反向高效液相色谱法，条件如下：色谱柱：ymc-pack ods-aq柱；流动相：流动相a为0.1％tfa/水，流动相b为0.1％tfa/乙腈；梯度洗脱程序：35％b洗脱0～5min，35％b～65％b、5～60min；流速为20ml/min，进样量为1ml，检测波长214nm和254nm。
106.实施例2产物的鉴别与结构分析
107.将实施例1的产物通过hplc进行鉴别以及hr-q-tof-ms进行结构分析，色谱流动相为乙腈和水。流动相a为体积分数为0.1％tfa的水溶液，流动相b为体积分数为0.1％tfa的乙腈溶液，梯度洗脱：0～5min，流动相b：5％；5-30min，流动相b：5％～80％；流速1ml
·
min-1
；检测波长214nm和254nm，进样量20μl。
108.经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备订书肽纯度大于95％，通过hr-q-tof-ms质谱仪分析结果如图4～图32右图所示。
109.实施例3利用假病毒转染检测订书肽在体外的抗病毒作用
110.假病毒检测是模拟病毒进入靶细胞过程的一个很好的模型，在以往的研究中已被广泛应用于评价抗病毒药物对相关冠状病毒感染的抑制活性。用于测试药效的假病毒按照4ml的假病毒加入4ml的dmem培养基以及2ml的含有10％fbs以及双抗的培养基混合，然后按实验要求分装到1.5ml的ep管中。将准备好的转染了ace2的huh7细胞的96孔板中的培养基吸出，加入200μl浓度为5μm或10μm的多肽ek1以及上述订书肽，培养48小时后，使用bright-glo
tm
luciferaseassay测试读值。
111.初筛假病毒活性由表1所示。sek1-1-8、sek1-1-9、sek1-1-12、sek1-2-6对hncov、sars-cov-2、mers的抑制作用均优于直链ek1蛋白。
112.在sars-cov-2假病毒感染的实验中，将准备好的转染了ace2的huh7细胞的96孔板中的培养基吸出，加入200μl浓度浓度梯度(0.097，0.39，1.56，6.25，25，100μm)的多肽ek1、sek1-1-12、sek1-2-6含有短肽药物的假病毒，培养48小时后，使用bright-glo
tm
luciferaseassay测试读值。
113.结果如图33显示，ek1肽作用48h后，感染病毒后的huh7细胞抑制并不明显；sek1-1-12和sek1-2-6系列肽作用后，huh7细胞的活力随着多肽浓度的增加而明显受抑制，其中sek1-1-12和sek1-2-6作用huh7细胞后，它们的ic50分别为6.31um和3.09um。这一结果说明，sek1-1-12和sek1-2-6多肽具有明显抗病毒作用，抑制作用显著。
114.表1初筛假病毒活性结果汇总
115.[0116][0117]
实施例4利用真病毒感染检测订书肽在体外的抗病毒作用
[0118]
将vero e6细胞按密度为5
×
104细胞铺在48孔细胞培养皿中培养过夜，用(1.25，2.5，5，10，20，40，80μm)的多肽ek1、sek1-1-12、sek1-2-6预孵育处理细胞1h，然后加入sars-cov-2病毒感染1h，取出混合物，用新含待测化合物的新鲜培养基进一步培养细胞，在感染24h后，收集细胞上清液，用裂解液裂解，提取rna，然后通过pcr对细胞上清液中的病毒拷贝数进行定量评估。
[0119]
在抗sars-cov-2病毒感染活性的实验中，我们将实验组分为治疗组和预防组。结果如图34所示，在预防组中，ek1对sars-cov-2感染具有抑制活性，ic50为3.9um。然而，sek1-1-12对感染病毒的vero e6细胞抑制作用更为明显，ic50为0.91um。在治疗组中，如图35所示，我们发现sek1-1-12和sek1-2-6对sars-cov-2感染的抑制活性较为明显，ic50分别为8.18um和8.91um。ek1对sars-cov-2感染具有抑制活性，其ic50为30.3um。这一结果说明，sek1-1-12和sek1-2-6多肽具有明显抗病毒作用，抑制作用显著。
[0120]
实施例5成药性研究
[0121]
在上述研究的基础上，本发明拟设计与开发直接喷鼻使用的广谱抗冠状病毒药物及相应剂型。首先需要构建医用级原料供应商平台以及完善多肽特殊修饰技术研发平台；
其次优化合成工艺路线，实现中试放大生产，形成生产工艺控制文件；然后开展产品的安全性和有效性评价；最后开展产品的剂型开发，以满足临床使用便捷性、安全性、有效性的需求，并进行注册相关文件准备。
[0122]
以效果最佳的订书肽sek1-1-12为研究对象，按照前述合成路线合成后，将订书肽药物与辅料羧甲基纤维素钠，甘油，水混合后形成混悬液，装载于定量鼻用喷瓶，制得相应抛射剂，对其产品安全性和有效性进行评价，为中试放大工艺研究提供参考。
[0123]
1)安全性评价
[0124]
选取正常小鼠随机分成三组：对照组(pbs)、10mg/kg给药组、50mg/kg给药组。通过经鼻给药途径，给药组分别使用高剂量的10mg/kg和50mg/kg订书肽sek1-1-12，三组均隔天给药，14天后观察小鼠存活情况及体重变化，分别于给药前及给药后测量小鼠血清激素水平，给药结束后取小鼠组织，观察各器官病理变化。
[0125]
14天给药周期内，两给药组小鼠体重变化幅度不大，与对照组小鼠体重几乎无差别(图36a)；血清因子方面，对照组及两给药组间差异较小，给药前后血清肌酐及alt变化差异也不明显(图36b及c)；对照组及两给药组间对小鼠体内抗体浓度影响也不存在明显差异(图36d)；肺、肝、肾及脾细胞形态也未发生变化(图36e)。订书肽sek1-1-12不会对小鼠体重及内在器官和血清因子水平造成影响，安全性较高。
[0126]
2)有效性评价
[0127]
利用仓鼠模型，将其分为阴性对照组、模型组、两直链肽对照组(ek110mg/kg、ek12mg/kg)以及给药组(sek1-1-122mg/kg)。在第一次经鼻给药后，对仓鼠进行新型冠状病毒感染，后持续给药5天，观察仓鼠存活情况及体重变化。给药结束后，取血测量细胞因子水平，并处死仓鼠，观察组织变化情况。
[0128]
给药五天后，阴性对照组小鼠体重增长10g，给药组小鼠体重下降5g，两直链肽对照组小鼠体重均下降10g，与模型组小鼠体重下降幅度相当(图37a)；与直链肽及感染组相比，给药组能很好缓解组织炎症情况(图37b)；与模型组对比，两种浓度的直链ek1以及订书肽sek1-1-12均能够有效抑制ncov病毒，促进ccl10以及ccl4趋化因子产生，促进nrp蛋白产生，并降低炎性因子il6的释放，但订书肽sek1-1-12的效果最佳(图37c)。
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以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。