一种基于荧光定量PCR检测美地绵粉蚧的引物、探针、试剂盒及方法与流程

一种基于荧光定量pcr检测美地绵粉蚧的引物、探针、试剂盒及方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于荧光定量pcr检测美地绵粉蚧的引物、探针、试剂盒及方法。


背景技术：

2.美地绵粉蚧(madeira mealybug)phenacoccus madeirensis green，属半翅目(hemiptera)蚧总科(coccoidea)粉蚧科(pseudococcidae)绵粉蚧亚科(phenacoccinae)绵粉蚧属（phenacoccus），是近年入侵我国大陆的一种重要粉蚧。该虫原产于南美洲中部，在亚洲，发现于小笠原群岛、九州、四国和琉球群岛，2009年4月在我国海南被发现，这是该种在我国大陆的首次发现。美地绵粉蚧寄主范围十分广泛，已有的研究表明，美地绵粉蚧的寄主植物有52科160余种，包括石蒜科、菊科、紫草科、十字花科、旋花科、茄科、芸香科、大戟科、豆科、锦葵科、蔷薇科、葡萄科等。据报道该虫在木薯上普遍发生，但危害相对较轻，在秘鲁主要危害马铃薯，在意大利则对观赏植物造成较重危害。该虫可以造成叶片畸形、生长受阻以及煤污病，带来严重经济损失。因此，尽快研发美地绵粉蚧快速检测技术，加强对美地绵粉蚧的监测检测，是保障我国木薯、蔬菜、观赏植物及水果产业等健康发展的必要前提，因而，提供一种用于特异性检测美地绵粉蚧的实时荧光定量pcr检测方法，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
3.目前，针对美地绵粉蚧的检验方案即使用特异性ss-coi引物对美地绵粉蚧进行普通pcr检测，公开号cn107653328a，该方法需做电泳检测，耗时较长，而实时荧光定量pcr技术不需电泳检测，省时省力，且特异性强、灵敏度高、重复性好，但目前尚无针对美地绵粉蚧的实时荧光定量pcr检测方法和试剂盒。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于荧光定量pcr检测美地绵粉蚧的引物。
5.本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量pcr检测美地绵粉蚧的探针。
6.本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量pcr检测美地绵粉蚧的试剂盒。
7.本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量pcr检测美地绵粉蚧的方法。
8.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案加以实现：一方面，本发明提供了一种基于荧光定量pcr检测美地绵粉蚧的引物和探针，包括上游引物md-f、下游引物md-r、特异性探针md-probe，其核苷酸序列分别如下所示：md-f:5
’‑
tcggtatatgatccggaata-3’；
md-r:5
’‑
ggcgtgaagagtaattattatatag-3’,所述md-f/md-r的扩增产物长度为179bp；md-probe：5
’‑
tctataagactaattattcgaattgaactt
ꢀ‑3’
， 5’端标记的荧光基团是fam，3’端标记的淬灭基团是bhq1。
9.另一方面，本发明还公开了一种基于荧光定量pcr检测美地绵粉蚧的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2中所述的检测引物和探针。
10.优选地，该基于荧光定量pcr检测美地绵粉蚧的试剂盒，还包括以下成分的部分或全部：(1)模板；(2)阳性对照和阴性对照；(3)pcr预混液。
11.优选地，所述阳性对照为重组质粒，阴性对照为ddh2o,所述pcr预混液为大连宝生物公司生产的takara premix ex tag。
12.再有，本发明还公开了一种基于荧光定量pcr检测美地绵粉蚧的方法，包括以下步骤：1）待检样品dna的提取；2）荧光定量pcr反应体系的配制：将步骤1）中提取的待检样品dna加入荧光定量pcr反应体系，所述荧光定量pcr反应体系中含有权利要求1或2中所述的引物和探针；3）标准质粒构建：利用引物对md-f/md-r对美地绵粉蚧dna进行常规pcr扩增；得到目的片段与puc57连接，再对连接产物进行转化，得到转化了质粒的菌落；挑取单克隆菌落接种于培养液中培养；利用质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，用于pcr鉴定并送杭州擎科生物有限公司进行测序验证；质粒鉴定正确后，用分光光度计测定质粒浓度，定量后作为本发明方法的基因标准品；4）荧光定量pcr扩增：设置阳性对照和阴性对照，将配好的荧光定量pcr反应体系于荧光定量pcr扩增仪上进行反应，反应程序如下：预变性95℃5min；然后变形95℃10sec，退火58℃30sec，循环40次，反应结束后，保存文件，打开分析软件；5）结果判断：通过观察荧光定量pcr的扩增情况判断检测结果。
13.优选地，荧光定量pcr反应体系为20μl反应体系，其含有10μm上下游引物各0.4μl，rox reference dye
ⅱꢀ
0.5μl，dna模板2μl，10μm taqman探针0.8μl，加ddh2o至20μl。
14.本发明可快速准确实现美地绵粉蚧与绵粉蚧属、灰粉蚧属昆虫的鉴定，避免形态鉴定可能产生的混淆；与常规pcr相比，实时荧光定量pcr耗时大大缩短，仅需1h就能得到检测结果，同时特异性更强，灵敏度更高，检测的最低dna浓度可达1fg/ul，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。本发明的美地绵粉蚧的实时荧光定量pcr检测的引物、探针及试剂盒，能快速、准确地对美地绵粉蚧进行检测。
附图说明
15.图1为本发明的引物md-f/nd-r和探针md-probe在美地绵粉蚧mtdna上的位置示意图；图2为基于taqman探针的实时荧光pcr检测的标准曲线；图3为荧光引物和探针的种特异性检验，图中，数字1：质粒dna；2：p.madeirensis；3-9：p.solani, phenacoccus sp.,p.manihoti,p. solenopsis, p.aceris, d.neobrevipes和阴性对照；
图4为美地绵粉蚧荧光定量检测体系所用荧光引物和探针的灵敏性检测，图中，a-h分别代表1.0ng/ul，100pg/ul，10pg/ul，1.0pg/ul、100fg/ul，10fg/ul，1fg/ul和0.1fg/ul。
具体实施方式
16.以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
17.依据目前研究成果，为保证所设计引物的特异性，我们选择了美地绵粉蚧（p.madeirensis）及近缘种石蒜绵粉蚧（p.solani）、枫香绵粉蚧（phenacoccus sp.）、扶桑绵粉蚧（p. solenopsis）、木薯绵粉蚧(p. manihoti)、槭绵粉蚧（p. aceris）和外缘种新菠萝灰粉蚧（dysmicoccus.neobrevipes），基于美地绵粉蚧线粒体基因组的coi基因序列使用软件primer5设计引物md-f/md-r后，再根据扩增出来的特异性片段使用软件primer exprss设计探针md-probe，可特异性扩增美地绵粉蚧，引物和探针均由杭州擎科生物公司合成。
18.实施例1：dna提取使用以上七种成虫进行dna提取，虫体放入1.5ml离心管，加液氮磨成粉末状，提取dna采用德国qiagen公司的dneasy
®
tissue kit提取试剂盒，具体步骤参考试剂盒说明书进行。
19.实施例2：目标序列选取对美地绵粉蚧的mtdna中coi基因序列进行分析，选择突变率较高的序列片段作为扩增的目的片段。设计了多组实时荧光定量pcr引物与探针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于检测美地绵粉蚧的荧光定量pcr引物和探针。
20.实施例3：特异性引物和探针设计如图1所示，针对所做类群，设计上游引物为md-f:5
’‑
tcggtatatgatccggaata-3’,下游引物为md-r:5
’‑
ggcgtgaagagtaattattatatag-3’，md-f/md-r的扩增产物长度为179bp；特异性探针为md-probe：5
’‑
tctataagactaattattcgaattgaactt
ꢀ‑3’
，探针的5’端以fam报告荧光基团标记，3’端以bhq1淬灭基团标记。
21.实施例4：标准质粒构建利用引物对md-f/md-r对美地绵粉蚧dna进行常规pcr扩增；得到目的片段与puc57连接，再对连接产物进行转化，得到转化了质粒的菌落；挑取单克隆菌落接种于培养液中培养；利用质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，用于pcr鉴定并送杭州擎科生物有限公司进行测序验证；质粒鉴定正确后，用分光光度计测定质粒浓度，定量后作为本发明方法的基因标准品。
22.实施例5：实时荧光pcr检测实时荧光定量pcr扩增体系为20μl：2
×
taqman probe real-time pcr master mixture 10μl (大连宝生物公司 takara premix ex tag)，上下游引物（10μm）分别0.4μl，rox reference dye
ⅱꢀ
0.5μl，dna模板2μl，taqman探针（10μm）0.8μl，加ddh2o至20μl。实时荧光pcr扩增在cfx opus 96 real-time pcr system定量pcr扩增仪上进行。打开“cfx opus 96 real-time pcr system software”,设置pcr反应条件,两步法扩增反应程序:预变性95℃5min；然后变形95℃10sec，退火58℃30sec，循环40次。点击运行,进行pcr反应，1h
左右反应结束，保存文件，打开分析软件。
23.实施例6：标准曲线建立以重组质粒为标准模板，以空质粒为阴性对照，将重组质粒进行10倍递减梯度稀释，每一浓度取2μl作为模板进行实时荧光定量pcr检测。分析结果显示，模板浓度越高，c
t
值越低，平行试验结果显示，dna浓度（x）与c
t
（y）具有相关性(x单位为ng/ul)，其关系式为y=-3.139x 12.266,如图2，相关系数较高，具体为r2=0.996(大于0.98)，满足实时荧光定量pcr检测的要求，可用于美地绵粉蚧的定量快速检测分析。
24.实施例7：荧光引物和探针的种特异性检验以7种粉蚧dna为模板，重组质粒为阳性对照、ddh2o为阴性对照，进行taqman qrt-pcr特异性检测。检测结果显示，仅美地绵粉蚧和重组质粒发出明显的荧光信号，有明显的扩增曲线生成，见图3，而其他6种粉蚧和阴性对照均无扩增，说明本专利设计的引物和探针具有较好的特异性。此检测体系可用于美地绵粉蚧的检测鉴定分析。
25.实施例8：荧光引物和探针的灵敏性检测对纯化各稀释度的重组质粒进行taqman qrt-pcr检测,结果显示dna浓度为1.0ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1.0pg/ul、100fg/ul、10fg/ul、1fg/ul时都能检测到明显的阳性扩增;而低于1fg/ul浓度的dna表现为阴性扩增,无荧光信号的增加。由此可见,所建立的taqman qrt-pcr最低可检测到1fg/ul，见图4所示。