提高重组人源胶原蛋白稳定性的冻干保护剂的制作方法

1.本发明属于生物制品的保存技术领域，涉及一种提高重组人源胶原蛋白稳定性的冻干保护剂。


背景技术：

2.重组人源胶原蛋白是基于人体皮肤胶原蛋白的原始基因序列，优化选择其中水溶性强、生物活性高的部分进行密码子优化和拼接重组，得到的全新的重组人源胶原蛋白序列。此类胶原蛋白的水溶性好，生物活性高，其性能优于动物源胶原蛋白，在生物医用材料领域有着广泛的应用前景。
3.由于重组人源胶原蛋白水溶液稳定性较差，且对热敏感，所以一般采用冷冻干燥的方法制作成冻干粉，方便保存和使用。但是，冻干过程会引起重组蛋白天然结构的变性，这是因为重组胶原蛋白在水溶液中表面会形成一层水化层，干燥过程去除这一部分水化层的水会破坏蛋白表面的氢键结构。此外，冻干后的重组人源胶原蛋白需要冷冻或者冷藏保存，常温(25℃)条件下保存容易发生降解，纯度下降，这在一定程度上制约了重组人源胶原蛋白的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种提高重组人源胶原蛋白稳定性的冻干保护剂。该保护冻干剂能够提高重组人源胶原蛋冻干粉在常温下的稳定性，防止其纯度和活性下降。
5.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
6.提高重组人源胶原蛋白稳定性的冻干保护剂，按重量份数计，以重组人源胶原蛋白为100份，由以下组分组成：海藻糖500
‑
2000份，聚乙烯吡咯烷酮(pvp
‑
k30)100
‑
500份，甘露醇100
‑
200份。
7.本发明所述的重组人源胶原蛋白由保藏编号为cgmcc no.5021的巴斯德毕赤酵母发酵产生，已在中国专利zl 201110327865.5中充分公开。
8.优选地，所述的冻干保护剂，由以下组分组成：海藻糖1000份，聚乙烯吡咯烷酮(pvp
‑
k30)200份，甘露醇200份。
9.进一步地，上述的冻干保护剂的使用方法为：按比例称取重组人源胶原蛋白、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(pvp
‑
k30)和甘露醇，加入注射水至完全溶解，采用0.22μm的滤膜除菌过滤，分装于西林瓶中，然后放入冻干机进行冷冻干燥，得到重组人源胶原蛋白冻干粉。
10.与现有技术相比，本发明的显著效果如下：
11.本发明通过对冻干保护剂配方合理搭配，添加保护剂海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮和赋形剂甘露醇。海藻糖可以提高玻璃态转化温度，它既能在冷冻过程中充当低温保护剂，又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用，保护蛋白表面的氢键结构。聚乙烯吡咯烷酮可形成耐热性构架，减少热辐射对重组人源胶原蛋白的影响，减缓蛋白在常温下的降解。两种保护剂对冷冻干燥的不同阶段保护蛋白质的保护机制不同，联合使用时对重组人源胶原
蛋白具有协同保护作用。本发明的冻干保护剂可有效增强重组人源胶原蛋白对干燥和常温不良环境的抵抗能力，降低了产品纯度降解幅度，在常温(25℃)下冻干粉的保质期可达一年，提高了产品的稳定性，解决了冻干粉必须低温储藏和运输的难题，有利于该产品的推广和应用。
具体实施方式
12.下面结合具体实施例对本发明作进一步详述。
13.下述实施例中，采用的重组人源胶原蛋白溶液的浓度为1wt.％，纯度为100％。
14.实施例1
15.重组人源胶原蛋白冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
16.1、准确称取海藻糖为50g，聚乙烯吡咯烷酮(pvp
‑
k30)10g，甘露醇10g，加入300g注射用水溶解。
17.2、准确称取重组人源胶原蛋白溶液500g，含有重组人源胶原蛋白5g，与步骤1的溶液混合均匀，然后加入注射用水，总重量为1000g。
18.3、用0.22μm的滤膜对步骤2的溶液进行无菌过滤，得到滤液。
19.4、将步骤3得到的滤液分装在管制瓶中，半加塞，放入冷冻干燥机中冻干。
20.5、冻干结束后，真空压塞，轧盖，贴标，得到重组人源胶原蛋白冻干粉，放置25℃，60％湿度的稳定性培养箱中，进行长期稳定性实验。
21.6、每3个月检测纯度，观察变化情况。
22.实施例2～实施例5
23.各实施例与实施例1基本相同，不同之处在于采用的冻干保护剂中各组分的含量不同，详见表1。
24.表1各实施例中各原料的添加量
[0025][0026][0027]
对比例1
[0028]
本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于不添加冻干保护剂。
[0029]
重组人源胶原蛋白冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
[0030]
1、准确称取重组人源胶原蛋白溶液500g，含有重组人源胶原蛋白5g，然后加入注射用水500g，总重量为1000g。
[0031]
2、用0.22μm的滤膜对步骤1的溶液进行无菌过滤，得到滤液。
[0032]
3、将步骤2得到的滤液分装在管制瓶中，半加塞，放进冷冻干燥机中冻干。
[0033]
4、冻干结束后，真空压塞，轧盖，贴标，得到重组人源胶原蛋白冻干粉，放置25℃，60％湿度的稳定性培养箱中，进行长期稳定性实验。
[0034]
5、每3个月检测纯度，观察变化情况。
[0035]
对比例2
[0036]
本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于冻干保护剂中各组分的含量。
[0037]
重组人源胶原蛋白冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
[0038]
1、准确称取海藻糖为125g，聚乙烯吡咯烷酮(pvp
‑
k30)30g，甘露醇10g，加入300g注射用水溶解。
[0039]
2、准确称取重组人源胶原蛋白溶液500g，含有重组人源胶原蛋白5g，与步骤1的溶液混合均匀，然后加入注射用水，总重量为1000g。
[0040]
3、用0.22μm的滤膜对步骤2的溶液进行无菌过滤，得到滤液。
[0041]
4、将步骤3得到的滤液分装在管制瓶中，半加塞，放进冷冻干燥机中冻干。
[0042]
5、冻干结束后，真空压塞，轧盖，贴标，得到重组人源胶原蛋白冻干粉，放置25℃，60％湿度的稳定性培养箱中，进行长期稳定性实验。
[0043]
6、每3个月检测纯度，观察变化情况。
[0044]
对比例3
[0045]
本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于冻干保护剂中各组分的种类和含量。
[0046]
重组人源胶原蛋白冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
[0047]
1、准确称取海藻糖为50g，甘露醇10g，加入300g注射用水溶解。
[0048]
2、准确称取重组人源胶原蛋白溶液500g，含有重组人源胶原蛋白5g，与步骤1的溶液混合均匀，然后加入注射用水，总重量为1000g。
[0049]
3、用0.22μm的滤膜对步骤2的溶液进行无菌过滤，得到滤液。
[0050]
4、将步骤3得到的滤液分装在管制瓶中，半加塞，放进冷冻干燥机中冻干。
[0051]
5、冻干结束后，真空压塞，轧盖，贴标，得到重组人源胶原蛋白冻干粉，放置25℃，60％湿度的稳定性培养箱中，进行长期稳定性实验。
[0052]
6、每3个月检测纯度，观察变化情况。
[0053]
对比例4
[0054]
本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于冻干保护剂中各组分的种类和含量。
[0055]
重组人源胶原蛋白冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
[0056]
1、准确称取聚乙烯吡咯烷酮(pvp
‑
k30)10g，甘露醇10g，加入300g注射用水溶解。
[0057]
2、准确称取重组人源胶原蛋白溶液500g，含有重组人源胶原蛋白5g，与步骤1的溶液混合均匀，然后加入注射用水，总重量为1000g。
[0058]
3、用0.22μm的滤膜对步骤2的溶液进行无菌过滤，得到滤液。
[0059]
4、将步骤3得到的滤液分装在管制瓶中，半加塞，放进冷冻干燥机中冻干。
[0060]
5、冻干结束后，真空压塞，轧盖，贴标，得到重组人源胶原蛋白冻干粉，放置25℃，60％湿度的稳定性培养箱中，进行长期稳定性实验。
[0061]
6、每3个月检测纯度，观察变化情况。
[0062]
各对比例和实施例制得的重组人源胶原蛋白冻干粉，长期稳定性实验纯度(％)检测结果见表2，检测方法参见中国专利申请cn109481335a。
[0063]
表2长期稳定性实验纯度检测结果
[0064]
放置时间对比例1对比例2对比例3对比例4实施例1实施例2实施例3实施例4实施例50月99.3％100％100％99.6％100％100％100％100％100％3月97.1％99.2％99.1％99.3％100％99.8％99.6％100％100％6月95.8％98.3％98.0％98.4％99.4％99.3％99.8％99.6％99.5％9月93.9％97.5％97.2％97.8％99.6％99.4％99.4％99.6％99.2％12月92.8％96.8％96.2％96.5％99.6％98.3％99％99.2％98.7％
[0065]
从表2可知，经过长期稳定性观察，5个实施例制得的重组人源胶原蛋白冻干粉在室温下保存12个月后的纯度明显高于对比例1
‑
4的纯度，表明采用本发明冻干保护剂保护的重组人源胶原蛋白冻干粉，在常温(25℃)条件下，12个月内纯度不会明显下降，质量稳定。