用于抑制乙型肝炎病毒增殖的组合物和方法与流程

no.76、seq id no.80、seq id no.85、seq id no.87和seq id no.89。特别是，所述方法可提供为，其中，由此在乙型肝炎感染基因的核酸序列中诱导插入缺失(indel)。
20.为解决上述问题，本技术可提供用于使乙型肝炎病毒(hbv)基因中的保守序列失活的方法。此处，乙型肝炎病毒基因为选自于由hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f和hbv基因型g所组成的hbv基因型中的一种或多种，并且所述保守序列为在hbv基因型序列中保守的序列。此处，所述保守序列为选自于seq id no.1至seq id no.45中的一种或多种，并且所述失活为剪切所述保守序列。
21.所述方法可提供为包括：
22.将组合物引入受试者，所述组合物包含：
23.a)引导核酸或编码所述引导核酸的核酸序列；以及
24.b)cas蛋白或编码所述cas蛋白的核酸序列；
25.所述引导核酸为与保守序列具有部分或完全的互补性或同源性的序列，
26.其中，所述引导核酸选自于seq id no.51、seq id no.52、seq id no.56、seq id no.57、seq id no.69、seq id no.70、seq id no.73、seq id no.74、seq id no.75、seq id no.76、seq id no.80、seq id no.85、seq id no.87和seq id no.89。
27.有益效果
28.根据本技术，显示出以下效果。
29.第一，根据本技术，通过靶向多种乙型肝炎病毒基因型的保守区域，可以提供不受基因型显著限制的抑制乙型肝炎病毒增殖的方法。
30.第二，根据本技术，可以提供用于靶向多种乙型肝炎病毒基因型的保守区域的组合物。此处，可以使用相同的组合物获得对多种乙型肝炎病毒基因型的治疗效果。
31.第三，根据本技术，可以提供多种乙型肝炎病毒基因型的保守区域。
附图说明
32.图1为能够靶向hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d的crispr grna的设计示意图。
33.图2示出了基于开放数据库制造的hbv基因型b的模拟通用hbv基因组。
34.图3示出了基于开放数据库制造的hbv基因型c的模拟通用hbv基因组。
35.图4示出了基于开放数据库制造的hbv基因型d的模拟通用hbv基因组。
36.图5示出了靶向模拟通用hbv基因型b、基因型c或基因型d的spcas9(酿脓链球菌cas9)的grna分布。
37.图6示出了靶向模拟通用hbv基因型b、基因型c或基因型d的cjcas9(空肠弯曲杆菌cas9)的分布。
38.图7示出了靶向共同保守区域的spcas9的grna分布，所述共同保守区域为如下中的共同保守区域：靶向基于开放数据库获得的的保守区域的序列、来源于韩国患者的hbv基因型c的序列、和可得的hbv细胞模型中。
39.图8示出了靶向共同保守区域的cjcas9的grna分布，所述共同保守区域为如下中的共同保守区域：靶向基于开放数据库获得的保守区域的序列、来源于韩国患者的hbv基因型c的序列和可得的hbv细胞模型中。
40.图9示出了本技术的hbv grna的靶标区域。
41.图10至图13以及图18示出了测量用于cjcas9的grna候选物(cj#06、cj#45、cj#47、cj#57)中hbv d基因型的hbeag和hbsag的结果。
42.图14至图17以及图19示出了测量用于spcas9的grna候选物(sp#17、sp#20、sp#89、sp#90、sp#154、sp#159、sp#193、sp#194、sp#196、sp#197)中hbv d基因型的hbeag和hbsag的结果。
43.图20和图21示出了测量用于spcas9的grna候选物(sp#17、sp#90、sp#193、sp#197、sp#17 90 193、sp#17 90 197、sp#17 193 197、sp#90 193 197)中huh7(hbv d基因型)和hepg2(hbv d基因型)细胞系的hbeag和hbsag的结果。
44.图22是总结图20和图21的结果的表格。
45.图23至图26示出了测量用于spcas9的grna候选物(sp#193、sp#197、sp#17 90 197、sp#17 193 197)中hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d各自的hbeag和hbsag的结果。
46.图27是设计用于在一个质粒中表达cas9、荧光蛋白和一种spgrna的载体图谱。
47.图28是设计用于在一个质粒中表达cas9、荧光蛋白和一种cjgrna的载体图谱。
48.图29是设计用于在一种质粒中表达cas9、荧光蛋白和三种spgrna的载体图谱。
具体实施方式
49.除非另有定义，本技术文件所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本技术文件所述的方法和材料相似或相同的方法和材料可以用于本发明的实践或实验中，合适的方法和材料在下文中描述。以引用的方式将本技术文件提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其整体并入。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的，而并不旨在进行限制。
50.乙型肝炎不仅是世界范围内最普遍的感染性疾病之一，而且是极有可能发展为慢性肝病(例如肝硬化和肝癌等)的疾病。
51.引起乙型肝炎的病毒hbv(乙型肝炎病毒)是dna病毒，属于嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae family)，并且是由约3,200个碱基对(3.2kb)组成的不完整双链病毒。
52.hbv的正链(plus-strand)dna具有不完整的互补结构，所述互补结构定位于具有完整环状结构的负链(minus-strand)dna内。
53.在hbv基因组中，有四个重叠的开放阅读框(orf)，并且所述框具有分别标明为pre-s/s、c、p和x的基因。hbv基因组的orf有超过50％的重叠部分。特别是，hbv聚合酶与整个pre-s/s重叠，并与其它orf重叠。因此，hbv复制中发生的突变可能会影响一个或多个orf，使得突变在hbv复制期间特别容易发生。
54.迄今为止，已知存在共7种类型的不同hbv基因型a至g。在hbv的整个碱基序列中每种亚型具有8％以上的差异。
55.hbv基因型在不同区域具有不同的分布模式。基因型a和基因型d是西欧和北美的主要类型，而基因型b和基因型c被认为是亚洲的主要类型。基因型e仅限于非洲，而f型常见于中美洲。特别是，据报道hbv基因型b和基因型c的病毒增殖比其它hbv基因型的病毒增殖维持得更长(j infect dis 1997；176:851-858)。
56.由于存在多种乙型肝炎病毒基因型，因此需要不受限于这些基因型的抑制乙型肝炎病毒增殖的有效方法。
57.·
抑制多种乙型肝炎病毒(hbv)基因型增殖的难点
58.如上所述，乙型肝炎病毒不仅是疾病(例如肝炎和肝癌)的病因，而且已知hbv共有7种基因型。
59.当hbv进入血液时，它一般位于肝细胞中，引起我们体内的免疫应答以消除hbv。因此，开发出了干扰素α(开发出的首个乙型肝炎治疗剂)以促进主要组织相容性复合体i(mhc i)抗原在hbv感染的肝细胞中的表达，并促进hbv感染的肝细胞的破坏。
60.然而，干扰素α仅对某些基因型有效，而不是对各种hbv基因型的所有都有效，并且不使通过整合进肝细胞而活化的hbv dna失活。因此，存在复发的可能。
61.最近，正在进行通过使用crispr/cas系统将整合的hbv dna失活来抑制hbv增殖的研究(ep2014830911,world j gastroenterol 2015august 28；21(32):9554-9565)。
62.具体而言，在ep2014830911中，公开了数百种靶向乙型肝炎病毒保守区域的引导核酸候选物。其中，公开了约24种选择用于筛选以确认乙型肝炎病毒增殖是否受到抑制的引导核酸候选物。此外，筛选的结果是，在约24种引导核酸候选物中，据报道只有约3种引导核酸显著抑制乙型肝炎病毒的增殖。
63.在world j gastroenterol 2015august 28；21(32):9554-9565中，还公开了约15种靶向乙型肝炎病毒保守区域的引导核酸候选物。在该文献中，约15种引导核酸也单独或组合用于筛选以确认乙型肝炎病毒抑制，并且如ep2014830911中所述，报道了引导核酸候选物具有不同的效果。此外，在特定引导核酸的组合中，据报道只有其中一些具有多种乙型肝炎病毒基因型的抑制作用。
64.因此，根据多篇文献，即使是靶向乙型肝炎病毒保守区域的组合物，也只有一些表现出乙型肝炎病毒增殖抑制作用，并且仅有少数引导核酸可应用于多种乙型肝炎病毒基因型。
65.换句话说，即使在靶向乙型肝炎病毒保守区域的情况下，乙型肝炎病毒增殖抑制作用也仅出现在特定序列中。因此，根据这些已知事实，可以看出仅通过抑制多种乙型肝炎病毒基因型中的一些的增殖的效果，无法容易地预期抑制其它乙型肝炎病毒基因型增殖的作用。
66.因此，在本领域通过使hbv dna失活来抑制乙型肝炎病毒增殖的研究中，需要找到对多种乙型肝炎病毒基因型具有显著增殖抑制作用的特定靶标序列。
67.为响应这种需要，本技术提供了用于抑制多种乙型肝炎病毒基因型增殖的方法和组合物。特别是，本技术通过从比之前更多的各种受试者中提取乙型肝炎病毒的保守区域并对所述保守区域进行设计以靶向这些受试者，使用对多种乙型肝炎病毒基因型具有显著增殖抑制作用的另一特定靶标序列。
68.·
本技术的技术特征
69.本技术涉及靶向乙型肝炎病毒的特定保守区域的组合物以及使用所述组合物的方法，并且特别涉及同时抑制多种乙型肝炎病毒基因型的组合物和方法。
70.在本技术中，通过不同于相关技术的方法获得靶向的hbv基因组上的特定区域，并且本技术中确定的这类特定区域与相关技术中公开的区域明显不同。
71.具体而言，通过将传统数据库的信息、来源于感染乙型肝炎病毒的患者的信息和来源于注射乙型肝炎病毒的细胞系的信息相结合，获得用于提取乙型肝炎病毒特定保守区域的对象。
72.通过靶向由上述方法确定的hbv基因组上的特定区域，可对多种乙型肝炎病毒基因型中的全部表现出增殖抑制作用。
73.因此，在本技术中，可应用使用相同序列(区域)的对所有基因型有效的治疗方法，而不是考虑多种hbv基因型(例如hbv a型、hbv b型、hbv c型、hbv d型、hbv e型、hbv f型和hbv g型)中各自的序列的治疗方法。即，用一种类型的组合物可抑制乙型肝炎病毒增殖，对各种hbv基因型没有具体限制。
74.因此，本技术具有以下技术特征。
75.首先，本技术用于抑制乙型肝炎病毒增殖的方法使在乙型肝炎病毒基因中保守的特定序列失活。此处，特定保守序列是指在多种hbv基因型的序列之间不易发生突变的区域中保守的序列。因此，本技术的方法可以适用于多种hbv基因型而不受限制。在本技术中，可以同时抑制选自于hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f和hbv基因型g中的至少两种hbv基因型。
76.其次，根据本技术的靶向特定区域来抑制乙型肝炎病毒增殖的组合物和方法，使用多种hbv基因型的特定区域中的一种类型可以表现出治疗效果。即，使用相同的组合物和方法，可以治疗由hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f或hbv基因型g引起的乙型肝炎。
77.下面，对具有本技术的技术特征的用于抑制多种乙型肝炎病毒基因型增殖的方法进行更详细地描述。
78.使用共同靶标进行的用于由多种乙型肝炎病毒基因型引起的乙型肝炎的增殖抑制方法
79.本技术的一个方面涉及使用共同靶标区域来抑制多种乙型肝炎病毒基因型增殖的方法。
80.具体而言，本技术的用于抑制乙型肝炎病毒增殖的方法是利用靶向在多种乙型肝炎病毒基因型中普遍保守的特定区域的技术来抑制乙型肝炎病毒增殖。
81.乙型肝炎病毒基因型可以选自hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f和hbv基因型g，但本发明不限于此。
82.本技术的用于抑制乙型肝炎病毒增殖的方法可以同时抑制选自于hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f和hbv基因型g中的一种或多种hbv基因型的增殖。
83.本文使用的术语“保守区域”应解释如下。保守区域是指选自于乙型肝炎病毒基因型(例如hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f和hbv基因型g)的至少两种基因型的序列之间不易发生突变的部分。特别是，所述保守区域是指乙型肝炎病毒基因型碱基序列之间的保守区域，所述乙型肝炎病毒基因型碱基序列选自于通过考虑来源于感染hbv的患者细胞和注射hbv的细胞模型以用于获得hbv基因型的碱基序列的目标以及数据库。在本技术文件中，保守区域中的核酸序列被称为“保守序列”。
84.本技术的保守序列可以使用以下方法获得。
85.根据一个实施方式，用于寻找多种hbv基因型的保守序列的方法可包括：
86.比对从数据库中获得的hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d的碱基序列；以及
87.通过比较经比对的hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d序列，来发现保守序列。
88.通过上述方法获得的保守序列可为选自下表1中的seq id no.1至seq id no.45中的一种或多种。
89.[表1]
[0090]
[0091]
[0092][0093]
作为另一实例，用于寻找多种乙型肝炎病毒基因型的保守序列的方法可包括：
[0094]
从以下碱基序列中获得所述多种乙型肝炎病毒基因型的碱基序列，例如
[0095]
i)分别来源于hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d的数据库的碱基序列，
[0096]
ii)hbv基因型d细胞模型的碱基序列，和
[0097]
iii)来源于感染hbv c型的患者的碱基序列；
[0098]
对i)、ii)、iii)的碱基序列进行比对；以及
[0099]
在经比对的序列中寻找保守序列。
[0100]
通过上述方法获得的本技术的保守序列可为选自表1中的以下序列中的任意一种或多种：seq id no.6、seq id no.7、seq id no.11、seq id no.12、seq id no.24、seq id no.25、seq id no.28、seq id no.29、seq id no.30、seq id no.31、seq id no.35、seq id no.40、seq id no.42和seq id no.44。
[0101]
根据本技术的用于寻找多种乙型肝炎病毒基因型的保守序列的最优选方法是，如上所述，通过扩大获取多种乙型肝炎病毒基因型的碱基序列的对象来获得保守序列。
[0102]
根据该方法，可以确定本技术的共同保守区域，所述保守区域可同时对多种乙型
id no.1至seq id no.45，更优选seq id no.6、seq id no.7、seq id no.11、seq id no.12、seq id no.24、seq id no.25、seq id no.28、seq id no.29、seq id no.30、seq id no.31、seq id no.35、seq id no.40、seq id no.42和seq id no.44。虽然引导区域在与靶标序列结合时包含0到5个错配，但如果复合物的功能不受影响，这不是大问题。
[0118]
靶向乙型肝炎病毒保守序列的序列可为选自于表2中的seq id no.46至seq id no.90中的任意一种。
[0119]
在一个实例中，所述引导核酸可为与spcas9蛋白相互作用并选自于seq id no.46至seq id no.79中的任意一种。
[0120]
在另一实例中，所述引导核酸可包括与cjcas9蛋白相互作用并选自于seq id no.80至seq id no.90中的任意一种。
[0121]
此处，所述复合物形成区域可以由cas9蛋白从中衍生而来的微生物的类型决定。例如，在引导核酸与spcas9蛋白相互作用的情况下，所述复合物形成区域可包含：
[0122]5′‑
guuuuagucccugaaaagggacuaaaauaaagaguuugcgggacucugcgggguuacaauccccuaaaaccgcuuuu-3
′
；并且在引导核酸与cjcas9蛋白相互作用的情况下，包含：
[0123]5′‑
guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc-3
′
。
[0124]
[表2]
[0125]
[0126][0127]
本技术的引导核酸的引导区域序列(seq id no.46至seq id no.90)为上表1中所列的保守序列中的任意一种，并通过考虑位于保守序列邻近位置的pam(前间区序列邻近基序)序列进行设计。
[0128]
作为pam(前间区序列邻近基序)序列，当使用spcas9蛋白时，考虑ngg(n为a、t、c或g)；当使用cjcas9蛋白时，考虑nnnnryac(n各自独立地为a、t、c或g，r为a或g，且y为c或t)。
[0129]
所述组合物可包含一种或多种引导核酸。
[0130]
在一个实例中，本技术的引导核酸可通过选择表2的seq id no.46至seq id no.90中的一种或多种来使用。优选地，本技术的引导核酸通过选择上述序列中的两种以上的组合来使用。
[0131]
在一个实施方式中，本技术的引导核酸可通过选择以下序列中的一种或者两种以上的组合来使用：seq id no.51、seq id no.52、seq id no.56、seq id no.57、seq id no.69、seq id no.70、seq id no.73、seq id no.74、seq id no.75、seq id no.76、seq id no.80、seq id no.85、seq id no.87和seq id no.89。在一个实施方式中，本技术的引导核酸可使用seq id no.51、seq id no.57和seq id no.73的组合或seq id no.51、seq id no.73和seq id no.76的组合。
[0132]
本技术的组合物可包含，例如，
[0133]
引导核酸或编码所述引导核酸的核酸序列，所述引导核酸包含选自seq id no.51、seq id no.52、seq id no.56、seq id no.57、seq id no.69、seq id no.70、seq id no.73、seq id no.74、seq id no.75和seq id no.76中的一种或多种；以及spcas蛋白或编码所述spcas蛋白的核酸序列。
[0134]
或者，本技术的组合物可包含：引导核酸或编码所述引导核酸的核酸序列，所述引导核酸包含选自seq id no.80、seq id no.85、seq id no.87和seq id no.89中的一种或多种；以及cjcas蛋白或编码所述cjcas的核酸序列。
[0135]
本技术的组合物可靶向
[0136]
以下的全部：选自hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f和hbv基因型g的乙型肝炎病毒基因型的两种以上保守区域。
[0137]
在一个实例中，
[0138]
可以靶向hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d中的所有保守区域。
[0139]
本技术的组合物的形式可为载体或核糖核蛋白rnp(ribonucleoprotein)形式。因此，所述组合物包含
[0140]
a)引导核酸或编码所述引导核酸的核酸序列；以及
[0141]
b)cas蛋白或编码所述cas蛋白的核酸序列。
[0142]
此处，处于载体形式的组合物可为同时或分别包含引导核酸和/或编码cas蛋白的核酸序列的载体。
[0143]
例如，所述载体可包含引导核酸和编码cas蛋白的核酸序列两者，作为另一实例，所述载体可单独地包含引导核酸和编码cas蛋白的核酸序列。
[0144]
此处，可以使用一种或多种引导核酸和/或cas蛋白。在一个实施方式中，可以组合两种或三种引导核酸。
[0145]
所述载体可为病毒载体或质粒。
[0146]
病毒载体可为选自于由逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、痘苗病毒、痘病毒和单纯疱疹病毒所组成的组中的一种或多种。
[0147]
在一个实施方式中，在所述组合物中，
[0148]
a)中的引导核酸可为选自于以下序列中的任意一种：seq id no.51、seq id no.52、seq id no.56、seq id no.57、seq id no.69、seq id no.70、seq id no.73、seq id no.74、seq id no.75和seq id no.76，以及
[0149]
b)中的cas蛋白可以包括酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)衍生而来的cas9蛋白。其中，在一个实施方式中，所述引导核酸可以使用seq id no.51、seq id no.57和seq id no.73的组合或seq id no.51、seq id no.73和seq id no.76的组合。
[0150]
在另一实施方式中，所述组合物可包含
[0151]
a)中的引导核酸，所述引导核酸可为选自于以下序列中的任意一种：seq id no.80、seq id no.85、seq id no.87和seq id no.89，以及
[0152]
b)中的cas蛋白，所述cas蛋白可包括空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)衍生而来的cas9蛋白。
[0153]
同时，所述组合物可以以rnp(核糖核蛋白)的形式制备。
[0154]
这意味着其中本技术的引导核酸rna序列与cas蛋白结合(或相互作用)的复合物形式。
[0155]
本技术的组合物可通过靶向多种乙型肝炎病毒基因型的特定保守区域来抑制病毒的增殖，而不管病毒的基因型如何。
[0156]
所述组合物的引导核酸和cas蛋白的复合物靶向乙型肝炎病毒基因组dna中的保守区域以剪切所述保守区域中的双链。结果，由于保守区域中的插入缺失(即人工突变)，使病毒失活，从而抑制乙型肝炎病毒的增殖。
[0157]
作为失活的结果，包括敲低(knock down)和敲除(knock out)两者。
[0158]“失活”是指阻止细胞中靶标基因或编码所述靶标基因的核酸的正常表达，或使其功能丧失或抑制其功能。可通过诱导其中靶标基因或核酸不被转录和/或翻译的状况来进行所述失活。
[0159]“敲除(knockout)”特别包括用于删除遗传信息的方法，例如剪切遗传dna的片段。通过敲除，可能抑制致病基因或功能异常基因的转录和/或翻译。
[0160]“敲低(knockdown)”特别指阻断基因翻译成蛋白质，并且可包括使用特异性材料(例如irna或mirna)阻断从mrna生成蛋白质。
[0161]
特别是，本技术的组合物可通过在靶标序列中引入dna剪切经由在hbv基因组上nhej产生插入缺失。因此，可表现出抑制hbv增殖或功能的效果。
[0162]
在本技术中，当靶向乙型肝炎病毒的保守区域时，可抑制乙型肝炎病毒增殖，并且可抑制乙型肝炎病毒抗原的产生或表达。
[0163]
本技术的组合物可抑制选自以下hbv基因型中的两种以上hbv基因型的同时增殖：hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f和hbv基因型g。另外，可抑制选自于hbsag、hbeag和hbcag中的一种或多种乙型肝炎病毒抗原的产生或表达。
[0164]
本技术的另一方面涉及使用所述组合物来抑制乙型肝炎病毒增殖的方法。
[0165]
本发明的用于抑制乙型肝炎病毒增殖的方法可通过将本技术的组合物引入或给予受试者来进行，并且此处，所述组合物可包含：
[0166]
a)引导核酸或编码所述引导核酸的核酸序列；以及
[0167]
b)cas蛋白或编码所述cas蛋白的核酸序列。
[0168]
此处，所述引导核酸可包含选自于以下序列中的一种或多种：seq id no.51、seq id no.52、seq id no.56、seq id no.57、seq id no.69、seq id no.70、seq id no.73、seq id no.74、seq id no.75、seq id no.76、seq id no.80、seq id no.85、seq id no.87和seq id no.89。此处，通过所述组合物在hbv基因的核酸序列中形成插入缺失。根据所述方法，可同时抑制选自于以下hbv基因型中的两种以上hbv基因型的增殖：hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f和hbv基因型g。
[0169]
本技术的方法可用本技术的相同组合物来抑制多种hbv基因型中的数种hbv类型的增殖。
[0170]
同时，本技术涉及用于使乙型肝炎病毒基因(hbv)中的保守序列失活的方法。
[0171]
所述方法的特点在于靶向特定保守序列，而不管hbv基因型如何。所述保守序列是hbv基因型的序列之间保守以使其失活的序列，例如，选自于seq id no.1至seq id no.45，
优选为seq id no.6、seq id no.7、seq id no.11、seq id no.12、seq id no.24、seq id no.25、seq id no.28、seq id no.29、seq id no.30、seq id no.31、seq id no.35、seq id no.40、seq id no.42和seq id no.44的保守序列中的一种或多种。此处，所述失活包括保守序列的剪切。
[0172]
无关于基因型，该方法可使选自于hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f和hbv基因型g的病毒中的一种或多种类型失活。
[0173]
在本技术的一个实施方式中，为了进行所述方法，可向受试者引入或给予
[0174]
a)引导核酸或编码所述引导核酸的核酸序列；以及
[0175]
b)cas蛋白或编码所述cas蛋白的核酸序列。在一个实施方式中，所述引导核酸可包含选自于以下序列中的一种或多种：seq id no.51、seq id no.52、seq id no.56、seq id no.57、seq id no.69、seq id no.70、seq id no.73、seq id no.74、seq id no.75、seq id no.76、seq id no.80、seq id no.85、seq id no.87和seq id no.89。在一个实施方式中，所述引导核酸可使用seq id no.51、seq id no.57和seq id no.73的组合或seq id no.51、seq id no.73和seq id no.76的组合。
[0176]
本技术的方法使乙型肝炎病毒(hbv)基因中的保守序列失活。此处，由于所述方法使用在多种hbv基因型的序列之间不易发生突变的保守序列，通过使用本技术的方法可在不限于多种hbv基因型的情况下抑制乙型肝炎病毒增殖。
[0177]
本发明的方法具有治疗乙型肝炎的作用。
[0178]
本发明的方法可通过将本技术的组合物引入或给予需要给予所述组合物的受试者来进行。
[0179]
所述受试者可为感染乙型肝炎病毒的哺乳动物(例如人、猴、小鼠或大鼠)，但本发明不限于此。
[0180]
此处，在受试者被hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d、hbv基因型e、hbv基因型f和hbv基因型g中的任意一种感染时，可进行本技术的方法。受试者可能被其中的两种或更多种共同感染，尽管不常见。
[0181]
即，由于本技术具有同时抑制多种乙型肝炎病毒基因型的作用，当使用本技术的组合物和方法时，可有效地抑制乙型肝炎病毒增殖并且可治疗乙型肝炎，而不管感染的乙型肝炎病毒的具体类型。
[0182]
所述给予可通过任何方便的方法进行，例如注射(injection)、转染(transfection)、植入(implantation)或移植(transplantation)。给予途径可选自视网膜下(subretinal)、皮下(subcutaneously)、皮内(intradermaliy)、眼内(intraocularly)、玻璃体内(intravitreally)、瘤内(intratumorally)、结内(intranodally)、髓内(intramedullary)、肌内(intramuscularly)、静脉内(intravenous)、淋巴管内(intralymphatic)和腹膜内(intraperitoneally)给予。
[0183]
在给予期间，所述组合物的剂量(获得所需效果的药学有效量)可选自于包括约104至109个细胞，例如105至106个细胞/kg(受试者的体重)的数值范围内的所有整数，但本发明不限于此。本技术的剂量可以通过考虑受试者的年龄、健康和体重，以及同步治疗的类型(如果有的话)、治疗频率或期望效果的特征来适当地规定。
[0184]
实施例
[0185]
下面，将参考实施例对本发明进行进一步详细描述。
[0186]
实施例仅提供用于更具体地解释本发明，并且对于本领域普通技术人员来说本发明的范围不限于根据本发明要旨的实施例将是显而易见的。
[0187]
根据本技术设计用于靶向多种hbv基因型的组合物的图表在图1中示出。图1是设计能够靶向hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d的crispr grna的示意图。
[0188]
如图1所示，能够多重靶向来源于韩国患者的hbv基因型c，来源于开放数据库的hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d以及hbv细胞模型的所有的基因剪刀。
[0189]
以下将详细描述图1的示意图。
[0190]
实施例1.hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d的基因组查询和比对
[0191]
对于hbv b型、c型和d型的基因组查询，分别从hbv基因组数据库(hbvdb,https://hbvdb.lyon.inserm.fr/hbvdb/hbvdbindex)收集1638、2136和923全序列的hbv b型、c型和d型。通过对收集的序列进行序列比对，制造模拟hbv基因组(下文称vhbv)序列。
[0192]
模拟hbv基因组序列b型、c型或d型是基于在hbv b型、c型或d型的每个全序列的比对序列中具有80％序列同源性的区域来制造的(图2至图4)。
[0193]
seq id no.91对应于图2的序列，seq id no.92对应于图3的序列，以及seq id no.93对应于图4的序列。在seq id no.91至seq id no.93的序列中，大写字母表示的区域与本技术分析的序列具有80％以上的同源性，小写字母表示的区域具有80％以下的同源性。
[0194]
[表3]
[0195][0196]
实施例2.引导rna(grna)的设计
[0197]
crispr靶标grna分别基于在实施例1中获得的模拟通用hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d而设计。
[0198]
用于spcas9(来自酿脓链球菌(5'-ngg-3'用于靶标，5'-nrg-3'用于脱靶))和cjcas9(来自空肠弯曲杆菌：5'-nnnnryac-3')的grna用cas-designer(http://www.rgenome.net/cas-designer/)进行设计，并且具有1和2错配以及具有脱靶序列的grna被排除在外。获得了如图5和图6所示的在vhbv基因型b、vhbv基因型c和vhbv基因型d中保守
的grna。
[0199]
作为设计的结果，获得了用于模拟通用hbv基因型b的靶标(用于spcas9的150个grna和用于cjcas9的80个grna)，用于hbv基因型c的靶标(用于spcas9的168个grna和用于cjcas9的66个grna)以及用于hbv基因型d的靶标(用于spcas9的158个grna，用于cjcas9的71个grna)。此外，获得了用于spcas9的34个grna(能够靶向所有模拟通用hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d)，并获得了用于cjcas9的11个grna(能够靶向所有模拟通用hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d)(图5和图6)。
[0200]
表2中seq id no.46至seq id no.90的grna是能够靶向hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d中至少一种的grna，并且其中，seq id no.46至seq id no.79是用于spcas9的grna以及seq id no.80至seq id no.90是用于cjcas9的grna。
[0201]
实施例3.靶向所有hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d的grna的选择
[0202]
作为靶向基于开放数据库的保守序列、来源于韩国患者的hbv基因型c和可用的hbv细胞模型序列中的共同保守区域的grna，设计了用于spcas9的10个grna和用于cjcas9的4个grna(图7和图8)。
[0203]
能够靶向来源于患者hbv c型的所有四种病毒以及hbv实验中通常使用的两种细胞系(d型)的spcas9的grna是表2中的seq id no.51、seq id no.52、seq id no.56、seq id no.57、seq id no.69、seq id no.70、seq id no.73、seq id no.74、seq id no.75和seq id no.76，并且能够靶向来源于患者hbv c型的所有四种病毒以及hbv实验中通常使用的两种细胞系(d型)的cjcas9的grna是表2中的seq id no.80、seq id no.85、seq id no.87和seq id no.89。
[0204]
实施例4.hbv靶标区域的筛选
[0205]
作为筛选靶向基于开放数据库的保守序列、来源于韩国患者的hbv基因型c和hbv细胞模型(实施例3中获得的)中的共同保守区域的grna所靶向的hbv靶标区域的结果，证明了靶向图9的hbv p、x、pres1、pres2、c、s和prec中的一种或多种。
[0206]
上述每种grna靶向的hbv靶标区域示于表4中。
[0207]
[表4]
[0208][0209]
实施例5.细胞培养和转染
[0210]
i)载体
[0211]
制备用于将实施例3中获得的grna引入细胞的载体构建体(图27至图29)。
[0212]
将grna的正义和反义寡核苷酸各200pmol与t4连接酶缓冲液混合，并在95℃加热2分钟，以-2℃/s从95℃至85℃5个冷却循环以及以-1℃/s从85℃至25℃60个冷却循环的条件下进行寡核苷酸退火，然后使用限制性酶插入到质粒的u6启动子后面。
[0213]
在图27中，cas9、荧光蛋白和一种spgrna被设计为在一个质粒中表达。
[0214]
在图28中，cas9、荧光蛋白和一种cjgrna被设计为在一个质粒中表达。
[0215]
在图29中，cas9、荧光蛋白和三种spgrna被设计为在一个质粒中表达。
90-197)、sp#17 sp#193 sp#197组合(命名为n#17-193-197)(图20至图22)。
[0230]
在所有huh7和hepg2细胞系中，当使用sp#17 sp#90 sp#197组合或sp#17 sp#193 sp#197组合的引导核酸而不是单独的sp#17、sp#90、sp#193和sp#197引导核酸时，可以看出hbeag和hbsag的抑制能力优异。
[0231]
结果3)spcas9 grna候选物的hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c和hbv基因型d的hbeag和hbsag抑制能力的证实
[0232]
在通过将paav hbv基因型a、paav hbv基因型b、paav hbv基因型c和paav hbv基因型d分别引入人肝癌细胞系huh7制备的hbv基因型a细胞系、hbv基因型b细胞系、hbv基因型c细胞系和hbv基因型d细胞系(分别称为基因型a、基因型b、基因型c和基因型d)中，测量了spcas9grna候选物sp#193(命名为n#193)、sp#197(命名为n#197)、sp#17 90 197(命名为n#17 90 197)和sp#17 193 197(命名为n#17 193 197)的hbeag和hbsag水平。
[0233]
可以看出，每个spcas9grna候选物在hbv基因型a细胞系、hbv基因型b细胞系、hbv基因型c细胞系和hbv基因型d细胞系的每一个中具有不同的hbeag和hbsag水平。
[0234]
比较基因型a、基因型b、基因型c和基因型d的所有结果，证实n#193和n#197(单一grna)倾向于降低hbeag，但不降低hbsag，而n#17-90-193和n#17-193-197有效地降低了hbeag和hbsag。
[0235]
即，可以看出，n#17-90-193和n#17-193-197均可有效抑制hbv基因型a、hbv基因型b、hbv基因型c、hbv基因型d。
[0236]
工业实用性
[0237]
本技术涉及用于抑制多种乙型肝炎病毒基因型增殖的方法。