发酵法制备大肠的细胞提取物的制作方法

1.本发明涉及细胞提取物技术领域，具体为发酵法制备大肠的细胞提取物。


背景技术：

2.无细胞(cell
‑
free，cf)蛋白表达系统已经成为生产高水平蛋白质的重要工具。除了适用于蛋白质的生产和修饰外，这些技术也特别适用于难表达的蛋白，如整合膜蛋白(mps)或有毒蛋白质方面。在传统的细胞表达系统中，膜蛋白表达失败通常是由细胞运输和转染机制的超负荷以及合成蛋白的毒性造成的。无细胞的表达可以消除了这些细胞本身存在所带来的问题。利用无细胞体系进行蛋白的规模化生产需要的条件：有效的可重复的大量细胞裂解液的制备，就是说制备大量的细胞提取物以及不同批次之间它的质量要能保持稳定；稳定地低成本的能量生成系统；以及底物的供应，如氨基酸前体分子的再利用以延长底物的供应时间等等。在这些表达条件中，使用量最大的就是细胞提取物，因此它的制备是无细胞表达成功的关键因素。同时无细胞表达系统应用最多的是大肠表达系统，我们以大肠的细胞提取物来说明本方案的实施方法。
3.目前小批量制备出的细胞提取物使用时间短，多次制备又容易出现批间差异，因此，根据申请人的发明，发明了发酵法制备大肠的细胞提取物，解决了多次制备又容易出现批间差异的问题。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了发酵法制备大肠的细胞提取物，解决了多次制备又容易出现批间差异的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：发酵法制备大肠的细胞提取物，包括细胞发酵和细胞提取，所述细胞发酵包括以下步骤：
8.s1.1、将10升灭菌的ytpg培养基与100毫升新鲜的大肠杆菌过夜培养物，接种到发酵罐中；
9.s1.2、在37℃下培养细胞，加强通气和搅拌；
10.s1.3、通过连续测量od600(od600指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值)来监测细胞生长；
11.s1.4、在细胞生长达到中期，即od600约3
‑
5的时候开始冷却细胞培养液；
12.s1.5、迅速将发酵罐中的培养液冷却到14
‑
10℃；
13.s1.6、在4℃下，以7,000
×
g(
×
g是离心力)离心15分钟，收获细胞；
14.s1.7、将细胞沉淀保持在4℃环境下，或者将细胞沉淀冷冻成薄层，并在室温下用铝箔纸包裹放在－80℃，用于后续处理；
15.所述细胞提取包括以下步骤：
16.s2.1、轻轻地将收集的细胞颗粒重新悬浮在大约300ml预冷的s30
‑
a缓冲液中，在4℃下以7000
×
g离心10分钟，丢弃上清液，重复此洗涤步骤两次，延长最后的离心步骤至30分钟；
17.s2.2、丢弃上清液，将细胞颗粒重悬于110％v/w(质量浓度)预冷的s30
‑
b 缓冲液中；
18.s2.3、用高压细胞破坏器破坏细胞；
19.s2.4、在4℃下以30000
×
g离心裂解液30分钟，并将上清液转移到一个新的试管中，重复离心步骤；
20.s2.5、收获上清液并逐步调整到400mm nacl的最终浓度，轻轻混合，在 42℃的水浴中培养45分钟；
21.s2.6、使用截留分子量为12
‑
14kda的透析膜，用100倍的预冷s30
‑
c缓冲透析浑浊的提取物(过夜)，并更换两次透析缓冲液；
22.s2.7、在4℃下以30000
×
g离心提取液30分钟，收获上清液，并将其分成等量的小份，装到塑料管中；
23.s2.8、在液氮中震荡冷冻这些小份的上清，之后储存在－80℃，不反复冻融的情况下，在－80℃可以保存1年；
24.s2.9、提取物的最终总蛋白浓度在20
‑
40mg/ml之间，每批新的提取物调整到mg2 (12
‑
25mm)和k (250
‑
350mm)离子的最佳浓度。
25.优选的，所述ytpg培养基由以下重量比组成：2
‑
4g磷酸二氢钾、5
‑
7g磷酸氢二钾、19
‑
20克葡萄糖、15
‑
17克胰蛋白酶、9
‑
12克酵母提取物、4
‑
6克氯化钠。
26.优选的，所述s30
‑
a缓冲液由以下重量比组成：9
‑
13mm乙酸三钠、ph＝8.2、 13
‑
14mm四水乙酸镁、0.5
‑
0.7mm氯化钾、5
‑
7mm巯基乙醇。
27.优选的，所述s30
‑
b缓冲液由以下重量比组成：9
‑
11mm三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、ph＝8.2、13
‑
15mm四水乙酸镁、0.4
‑
0.7氯化钾、1
‑
3mm二硫苏糖醇和0.1
‑
0.3mm苯甲基磺酰氟。
28.优选的，所述透析缓冲液由以下重量比组成：8
‑
10mm磷酸氢二钾/磷酸二氢钾、ph＝8.0、9
‑
11mm氯化钠、0.1
‑
0.6mm乙二胺四乙酸、5％甘油和1
‑
2mm 二硫苏糖醇。
29.优选的，所述s30
‑
c缓冲液由以下重量比组成：9
‑
11mm三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、ph＝8.2、10
‑
15mm四水乙酸镁、0.3
‑
0.6mm乙酸钾、0.4
‑
0.7mm 二硫苏糖醇。
30.(三)有益效果
31.本发明提供了发酵法制备大肠的细胞提取物。具备以下有益效果：
32.通过采用扩大制备规模来减少这种差异性的因素对无细胞表达的影响，同时也提高实验的可重复性和其他优化条件的可对照性。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例：
35.本发明实施例提供发酵法制备大肠的细胞提取物，包括细胞发酵和细胞提取，细胞发酵包括以下步骤：
36.s1.1、将10升灭菌的ytpg培养基与100毫升新鲜的大肠杆菌过夜培养物，接种到发酵罐中，发酵罐的容量为10升，ytpg培养基由2.99g磷酸二氢钾、6.97g磷酸氢二钾、19.82克葡萄糖、16克胰蛋白酶、10克酵母提取物、5克氯化钠混合而成；
37.s1.2、在37℃下培养细胞，加强通气和搅拌；
38.s1.3、通过连续测量od600(od600指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值)来监测细胞生长；
39.s1.4、在细胞生长达到中期，即od600约3
‑
5的时候开始冷却细胞培养液；
40.s1.5、迅速将发酵罐中的培养液冷却到14
‑
10℃；
41.s1.6、在4℃下，以7,000
×
g(
×
g是离心力)离心15分钟，收获细胞；
42.s1.7、将细胞沉淀保持在4℃环境下，或者将细胞沉淀冷冻成薄层，并在室温下用铝箔纸包裹放在－80℃，用于后续处理；
43.细胞提取包括以下步骤：
44.s2.1、轻轻地将收集的细胞颗粒重新悬浮在大约300ml预冷的s30
‑
a缓冲液中，在4℃下以7000
×
g离心10分钟，丢弃上清液，重复此洗涤步骤两次，延长最后的离心步骤至30分钟，s30
‑
a缓冲液由10mm乙酸三钠、ph＝8.2、 14mm四水乙酸镁、0.6mm氯化钾、6mm巯基乙醇混合而成；
45.s2.2、丢弃上清液，将细胞颗粒重悬于110％v/w(质量浓度)预冷的s30
‑
b 缓冲液中，s30
‑
b缓冲液由10mm三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、ph＝8.2、 14mm四水乙酸镁、0.6mm氯化钾、1mm二硫苏糖醇和0.1mm苯甲基磺酰氟混合而成；
46.s2.3、用高压细胞破坏器破坏细胞，通过采用法国压榨机在1000psi的压力下进行破坏；
47.s2.4、在4℃下以30000
×
g离心裂解液30分钟，并将上清液转移到一个新的试管中，重复离心步骤；
48.s2.5、收获上清液并逐步调整到400mm nacl的最终浓度，轻轻混合，在 42℃的水浴中培养45分钟；
49.s2.6、使用截留分子量为12
‑
14kda的透析膜，用100倍的预冷s30
‑
c缓冲透析浑浊的提取物(过夜)，并更换两次透析缓冲液，透析缓冲液由10mm磷酸氢二钾/磷酸二氢钾、ph＝8.0、10mm氯化钠、0.5mm乙二胺四乙酸、5％甘油和1mm二硫苏糖醇混合而成，s30
‑
c缓冲液由10mm三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、ph＝8.2、14mm四水乙酸镁、0.6mm乙酸钾、0.5mm二硫苏糖醇混合而成；
50.s2.7、在4℃下以30000
×
g离心提取液30分钟，收获上清液，并将其分成等量的小份，装到塑料管中；
51.s2.8、在液氮中震荡冷冻这些小份的上清，之后储存在－80℃，不反复冻融的情况下，在－80℃可以保存1年；
52.s2.9、提取物的最终总蛋白浓度在20
‑
40mg/ml之间，每批新的提取物调整到mg2 (12
‑
25mm)和k (250
‑
350mm)离子的最佳浓度。
53.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。