一株链霉菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株链霉菌及其应用。


背景技术：

2.植物由于受到病原生物或不良环境条件的持续干扰，其干扰强度超过了植物能够忍耐的程度，使植物正常的生理功能受到严重影响，在生理上和外观上表现出异常，植物这种偏离了正常状态的现象称为植物病害。按照病原生物类型，植物病害分为真菌病害、细菌病害、病毒病害等。植物病害的发生是植物和病原物相互作用的结果，农作物和临武病害的大发生，常使国家经济和人民生活遭受严重损失。
3.植物病害的防治方法主要有植物检疫、抗病育种、农业防治、化学方式、物理机械防治和生物防治六种方法。其中，生物防治指一种或多种有益生物或天敌对病原微生物的控制，且不会对环境和人类健康产生不良影响。目前，市场上约有百种的微生物产品用于生物防治。微生物产品因具有不易污染环境、安全性高等特点已成为研究防治植物病害的热门之一。微生物农药包括活体微生物活体农药和代谢产物农药。例如，放线菌产生的阿维菌素很早被应用在植物病害防治上。
4.但目前，能够应用于植物病害防治的微生物种类仍不能满足生产实际需求。因此，进一步寻找具有抗植物病原微生物的菌种，对植物病害的生物防治存在重要意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一株能够防治植物病害的链霉菌及其应用。
6.本发明提供了保藏编号为gdmcc no：61901的链霉菌。
7.本发明从采集的南海海绵中分离获得多株放线菌，通过平板对峙法，筛选获得1株能够有效抑制多种植物病原真菌的拮抗菌株，在本发明实施例中将其编号为生防链霉菌(streptomyces sp.)hnbca1，简称hnbca1。将其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：61901。
8.本发明提供的保藏编号为gdmcc no：61901的链霉菌能够抑制多种以植物为宿主的病原微生物，因此，其能够用于防治植物病害。
9.本发明提供了所述链霉菌在制备防治植物病害的生防制品中的应用。
10.本发明中，所述植物病害为由真菌性植物病害。
11.一些实施例中，所述植物病害的病原菌为炭疽属真菌、棒孢菌属真菌、镰刀菌属真菌、拟盘多毛孢属真菌。
12.一些实施例中，所述植物病害的宿主包括火龙果、龙船花、芦笋、辣椒、木瓜、椰子、芒果、香蕉、豇豆或荔枝中至少一种。
13.一些具体实施例中，所述植物病害的病原菌包括：火龙果果腐病菌、小叶龙船叶点病菌、小叶龙船拟盘多毛孢叶斑病菌、龙船花炭疽病菌、芦笋茎枯病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒
棒孢叶斑病菌、木瓜溃疡病菌、椰子茎干腐烂病菌、芒果炭疽病菌、木瓜叶斑病菌、木瓜炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、豇豆轮纹病菌、豇豆绵腐病菌或荔枝霜疫霉病菌中至少一种。
14.本发明还提供了一种生防制品，其包括本发明所述的链霉菌，或包括由本发明所述的链霉菌经发酵提取制得的提取物。
15.本发明所述的链霉菌可直接以菌悬液的形式作为生防制剂。也可经发酵后提取活性物质作为生防制剂。
16.一些实施例中，所述的生防制品的制备方法包括：将本发明所述的链霉菌活化后，接种于所述培养基，经发酵、提取后，获得所述生防制品。
17.本发明所述培养基包括大米、水和海盐，其中，大米与水的质量比为(80～90)：(100～120)；海盐的质量分数为17～18g/l；所述提取的试剂为乙酸乙酯。
18.一些实施例中，所述培养基中大米与水的质量比为80：120；海盐的质量分数为17.5g/l。所述培养基的ph值为7.2
±
0.2。
19.一些实施例中，所述大米为粳米。
20.本发明中，所述发酵的条件包括25～30℃培养20～40d。一些实施例中，所述发酵的条件包括28℃培养30天。
21.本发明中，所述提取的条件包括以等体积乙酸乙酯提取，共提取三次；提取的温度为室温(28-35℃)，时间为12小时。
22.本发明所述提取后，还包括减压浓缩和干燥的步骤。
23.或者本发明所述提取后还包括减压浓缩、干燥和稀释的步骤。
24.其中，所述减压浓缩的温度为50℃。所述稀释的稀释液为水。
25.一些具体实施例中，所述生防制剂的制备方法包括：
26.(1)将所述链霉菌经平板活化后接种至tsb液体培养基中，在26℃～30℃以140～180rpm转速振荡培养3～5d，制备发酵种子液；
27.(2)接种量为10％将所述发酵种子液接种至大米固体培养基，28℃～32℃，静置发酵30d，获得发酵物；
28.(3)用等体积的乙酸乙酯浸提大米固体发酵物，共提取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩至干，得到发酵提取物。
29.本发明还提供了一种防治植物病害的方法，其为施用本发明所述的生防制品，或施用本发明所述制备方法制得的生防制品。
30.本发明从采集的南海海绵中分离获得链霉菌(streptomyces sp.)hnbca1,经实验验证，其具有抗菌效果好、防治效果稳定、抑菌谱较广的特点。因此，该菌种用于生物防治潜力大，具有较好的开发前景，如将其发酵提取物中的抑菌活性组分通过分离纯化等技术可进一步作为生物农药被开发应用于多种植物病害的防治。
31.生物保藏说明
32.生物材料streptomyces sp.hnbca1，分类命名:streptomyces sp.，于2021年08月30日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址为:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号为gdmcc no:61901。
附图说明
33.图1为实施例2中获得的生防链霉菌菌株hnbca1菌落形态图；
34.图2为实施例3中菌株hnbca1及相关菌株的系统发育树分析；
35.图3为实施例4中菌株hnbca1活菌对香蕉炭疽病菌的抑制效果；
36.图4为实施例7中菌株hnbca1发酵提取物在40℃、50℃、60℃水浴处理1h下对香蕉炭疽病菌的抑制效果。
具体实施方式
37.本发明提供了一株链霉菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
38.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
39.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
40.实施例1放线菌菌株筛选
41.从中国南海采集海绵样品，选用高氏合成一号培养基(广东环凯微生物科技有限公司销售的干粉培养基)，采用多浓度梯度稀释涂布法分离筛选，每天观察并挑取符合放线菌菌落形态的菌株转移至isp2培养基，分离纯化后，于甘油管-20℃保存。
42.所述高氏合成一号培养基按以下按重量体积比例的组分配备：可溶性淀粉20.0g/l，nacl 0.5g/l，feso
4 0.01g/l，kno
3 1.0g/l，k2hpo
4 0.5g/l，mgso
4 0.5g/l，琼脂15.0g/l，17.5g/l海盐，100μg/ml重铬酸钾，最终ph 7.3
±
0.2。
43.isp2培养基按以下按重量体积比例的组分配备：酵母浸粉4g/l，麦芽浸粉10g/l，葡萄糖4g/l，琼脂20g/l，17.5g/l海盐，ph值为7.2
±
0.2。
44.实施例2放线菌抗植物病原真菌活性测定
45.将分离得到的放线菌株转入pda培养基培养，待各菌株产生足量孢子后，以香蕉炭疽病菌为指示菌，通过平板对峙法培养测定放线菌的抑菌活性：制备直径7mm的香蕉炭疽病菌菌饼接种在pda平板(直径90mm)中央，距离菌饼上下2cm处为培养3d的放线菌带，以不接种放线菌的香蕉炭疽病菌平板为对照组，28℃恒温培养至对照组长满至整个平板后测量，每个处理重复3次。采用十字交叉法测量菌落直径，求出菌株对香蕉炭疽病菌的抑菌率。抑菌率(％)＝[(对照组病原菌生长直径-病原菌块直径)-(处理组病原菌生长直径-病原菌块直径)]/(对照组病原菌生长直径-病原菌块直径)*100％。根据结果将拮抗活性最强的菌株hnbca1作为入选菌株进行抑菌谱的测定。
[0046]
筛选获得的生防链霉菌株hnbca1的菌落形态图如图1所示。该海绵来源的生防链霉菌在isp2培养基(含1.75％的海盐)上生长良好。28℃培养5d后开始产生孢子，培养7d后孢子堆颜色呈现白色。
[0047]
实施例3菌株hnbca1的分子鉴定
[0048]
将放线菌hnbca1接种至isp2固体平板，28℃培养5d，挑取单菌落至isp2进行二次纯化。
[0049]
采用tsingke dna提取试剂盒(通用型)提取总dna。选用通用引物：27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')进行扩增。
[0050]
pcr扩增反应体系总体积50μl体系(1
×
金牌mix dna聚合酶45μl，引物27f 2μl，引物1492r 2μl，dna模板1μl。)。
[0051]
扩增条件为预变性98℃，2min，变性98℃，10s，退火56℃，10s，延伸72℃，10s，35个循环；终延伸72℃，5min。
[0052]
0.8％琼脂糖凝胶用于检测pcr反应后获得的片段(电压300v，时间12min)，使用凝胶成像仪观察电泳结果，阳性结果交由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司测序。该菌株的16s rrna基因序列如seq id no:1所示。
[0053]
将获得的上述序列在ncbi网站进行blast进行相似性比对，选择相似度大于98％的菌株的16s rrna基因序列作为参比对象，在mega-x软件中进行多序列比对，通过邻接法进行聚类分析和构建系统发育树(菌株hnbca1及相关菌株的系统发育树分析结果如图2所示)，根据kimura two parameter模型评估系统进化矩阵，自展值设定1000次用于评估进化树拓扑结构的稳定性。经过分子生物学研究鉴定为链霉菌streptomyces sp.，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省越秀区先烈中路100号广东省微生物研究所，保藏号：gdmcc no：61901。
[0054]
实施例4放线菌hnbca1抗菌谱测定
[0055]
以火龙果果腐病菌g.persicaria、小叶龙船叶点病菌phyllosticta capitalensis、小叶龙船拟盘多毛孢叶斑病菌neopestalotiopsis clavispora、龙船花炭疽病菌colletotrichum australianum、芦笋茎枯病菌phomopsis asparagi、辣椒炭疽病菌colletotrichum sp.、辣椒棒孢叶斑病菌corynespora cassiicola、豇豆轮纹病菌corynespora sp.、豇豆绵腐病菌pythium aphanidermatum(edson)fitzp、椰子茎干腐烂病菌thielaviopsis paradoxa、芒果炭疽病菌c.gloeosporioides、木瓜溃疡病菌l.theobromae、木瓜叶斑病菌phomopsis caricae-papayae fetrak&cif.、木瓜炭疽病菌colletotrichum gloeosporioidespenz.、香蕉炭疽病菌colletotrichum musae、香蕉枯萎病菌fusarium oxysporum f.sp.cubense、香蕉枯萎病菌fusarium oxysporum f.sp.cubense，foc4、荔枝霜疫霉病菌peronophythora litchii作为抗菌谱测定的指示菌(由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供)。
[0056]
采用平板对峙法测定放线菌hnbca1的抗菌谱，将放线菌株hnbca1转入pda培养基培养，待菌株产生足量孢子后，以上述植物病原菌为指示菌，通过平板对峙法培养测定放线菌的抑菌活性：每个植物病原菌株制备直径7mm的菌饼接种在pda平板(直径90mm)中央，距离菌饼上下2cm处为培养3d的放线菌带，以不接种放线菌的植物病原菌平板为对照组，28℃恒温培养至对照组长满至整个平板后测量，每个处理重复3次。采用十字交叉法测量菌落直径，求出菌株对各病原真菌的抑菌率。抑菌率(％)＝[(对照组病原菌生长直径-病原菌块直径)-(处理组病原菌生长直径-病原菌块直径)]/(对照组病原菌生长直径-病原菌块直径)
×
100％。对各植物病原真菌的抑菌率如下表1所示：
[0057]
表1放线菌hnbca1的抗菌谱测定
[0058][0059]
[0060]
由表1可知，菌株hnbca1对火龙果果腐病、小叶龙船叶点病、小叶龙船拟盘多毛孢叶斑病、龙船花炭疽病、芦笋茎枯病、辣椒炭疽病、辣椒棒孢叶斑病、木瓜溃疡病、椰子茎干腐烂病、芒果炭疽病、木瓜叶斑病、木瓜炭疽病、香蕉炭疽病、香蕉枯萎病菌、豇豆轮纹病、豇豆绵腐病、荔枝霜疫霉病菌均有不同程度的抑制效果，表明菌株hnbca1的抗菌谱较广。其中对木瓜炭疽病菌、木瓜溃疡病菌和香蕉炭疽病菌(菌株hnbca1活菌对香蕉炭疽病菌的抑制效果如图3)的抑菌效果最强，对芦笋茎枯病菌抑制能力最弱，对其余病原菌有中等抑制作用。
[0061]
实施例5菌株hnbca1拮抗作用持效性
[0062]
将菌株hnbca1转入pda培养基培养，待产生足量孢子后，以香蕉炭疽病菌为指示菌，通过平板对峙法培养测定放线菌的抑菌活性：制备直径7mm的香蕉炭疽病菌菌饼接种在pda平板(直径90mm)中央，距离菌饼上下2cm处为培养3d的放线菌带，以不接种放线菌的香蕉炭疽病菌平板为对照组，28℃恒温对峙培养7d、15d、30d、40d，每个处理重复3次。计算每个时期的抑菌率如下表2所示：
[0063]
表2菌株hnbca1在不同对峙培养时间内的抑菌率
[0064][0065]
由表2可知，菌株hnbca1的抑菌率随时间增长呈现逐渐下降，后趋于稳定的趋势。接种病原菌后对峙培养15d的抑菌率与对峙培养7d相比差异显著。对峙培养30d后的抑菌率趋于稳定。因此，菌株hnbca1对病原菌抑制有持久性。
[0066]
实施例6放线菌hnbca1发酵及其发酵物样品前处理方法
[0067]
将链霉菌streptomycessp.hnbca1经平板活化，接种于tsb液体培养基中，28℃、160rpm振荡培养3d，按照10％接种量接种到15kg大米培养基中，28℃培养30d得到固体发酵物。用等体积的乙酸乙酯萃取，反复萃取3遍，合并3次乙酸乙酯萃取液并在50℃下将其减压浓缩至干，得到粗提物(104g)。上述tsb液体培养基按以下按重量体积比例的组分配备：胰酪胨17g/l、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/l、氯化钠5g/l、磷酸氢二钾2.5g/l、葡萄糖2.5g/l，ph 7.3
±
0.2。
[0068]
大米发酵培养基按以下按重量体积比例的组分配备：大米80g，水120g，海盐17.5g/l，ph自然。
[0069]
实施例7菌株hnbca1发酵提取物抗植物病原真菌的热稳定性
[0070]
将发酵提取物配制成浓度为1mg/ml的样品液，分别置于40℃、50℃、60℃下水浴处理1h。以香蕉炭疽病菌为指示菌，通过平板滤纸片法测定放线菌的抑菌活性：制备直径7mm的香蕉炭疽病菌菌饼接种在pda平板(直径90mm)中央，距离菌饼上下左右2cm处放置一张直径8mm滤纸片，以无菌水和dmso作阴性对照，以香蕉炭疽病菌平板为对照组，每个处理重复3次，28℃恒温倒置培养10d。计算每个温度下的抑菌率如下表3所示：
[0071]
表3不同温度处理后的发酵提取物的抑菌率
[0072][0073]
菌株hnbca1发酵提取物在40℃、50℃、60℃水浴处理1h下对香蕉炭疽病菌的抑制效果如图4。
[0074]
由表3和图4可知，菌株hnbca1发酵提取物的抑菌率随温度升高而降低，但60℃高温下仍对病原真菌有较强抑菌效果，抑菌率达到69.23％
±
0.56％，表明其发酵提取物具有较好的热稳定性，在田间生物防治植物病原真菌病害中可发挥稳定防效。
[0075]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。