具有抗胰腺癌活性的天然化合物及其分离方法及应用与流程

1~fr.3-6；其中fr.3-3进一步通过硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱得到2个组分fr.3-3.1、fr.3-3.2和纯化合物2；fr.3-3.1用石油醚-乙酸乙酯再次纯化，得到化合物 24。
[0009] fr.4通过硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱得到10个组分fr.4-1~fr.4-10。其中fr.4-4进一步通过c
18
反相硅胶柱分离、甲醇/水梯度洗脱，产生九个组分fr.4-4.1~fr.4-4.9。其中组分fr.4-4.6用制备型 hplc纯化，依次得到化合物 10、化合物11。fr.4-4.5用制备型 hplc纯化，依次得到化合物 17、化合物16。fr.4-4.4用制备型 hplc纯化，依次得到化合物 13、化合物12。fr.4-6用硅胶柱进行色谱分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到九个亚组分fr.4-6-1~fr.4-6-9，其中fr.4-6-4通过硅胶用二氯甲烷-丙酮分离，得到三个组分fr.4-6-4.1~fr.4-6-4.3；fr.4-6-4.2再用制备型 hplc纯化，依次得到化合物 22和化合物1。
[0010]
fr.6用葡聚糖凝胶sephadex lh-20分离，二氯甲烷-甲醇洗脱，得到六个组分fr.6-1~fr.6-6。fr.6-2用硅胶柱进行色谱分离，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，获得11个组分fr.6-2-1~fr.6-2-11；fr.6-2-4通过硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到六个组分fr.6-2-4.1~fr.6-2-4.6；fr.6-2-4.1用硅胶柱色谱纯化，并用石油醚-乙酸乙酯洗脱，依次得化合物7和化合物9；fr.6-2-4.2进一步通过硅胶分离，石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到三个组分fr.6-2-4.2.1~fr.6-2-4.2.3，其中fr.6-2-4.2.2用制备型 hplc纯化，依次得到化合物 21、化合物3和化合物8。fr.6-2-4.4用制备型 hplc洗脱，得到化合物 20。fr.6-2-4.6用制备型 hplc洗脱，得到化合物 6；fr.6-2-4.7通过ptlc分离，得到化合物4和化合物5。fr.6-2-9用制备型 hplc分离，得到化合物14；fr.6-2-9重结晶后用乙酸乙酯洗涤得化合物19；fr.6-2-9通过制备型ptlc分离，并用二氯甲烷-甲醇（10:1，v/v）展开，得到化合物15。fr.6-4-2.3用制备型 hplc（甲醇/水= 60/40，流速10 ml/min），得到化合物18。fr.6-6-10用制备型 hplc（甲醇/水= 70/30，流速10 ml/min）纯化，得到化合物 23。
[0011]
通过上述方法分离得到24和化合物，其中5个化合物具有抗胰腺癌活性，包括一个香豆素类化合物（化合物7）、三个苯丙素类化合物（化合物10、13、17）和一个木质素类化合物（化合物20）。所述上5个具有抗胰腺癌活性的化合物结构式如下：。
[0012]
二、化合物7、10、13、17、20的抗胰腺癌活性
本实验用人源胰腺癌细胞capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990细胞，取对数生长期的capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990细胞，接种于96孔板（每孔1
×
104个细胞），待细胞贴壁后，分别加入浓度范围为0.1-100
ꢀµ
m梯度的待测化合物，培养72 h，然后每孔加入10
ꢀµ
l cck-8溶液继续培养4小时，振荡10 min，酶标仪450 nm测定吸光度值，采用cck-8法检测天然化合物3、7、10、17、20对胰腺癌细胞capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990细胞的增殖抑制作用，根据吸光值计算sw1990胰腺癌细胞的存活率，并计算测试化合物ic
50
值。
[0013]
表1为化合物3、7、10、17、20对胰腺癌细胞capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990细胞抑制作用。表1的结果显示，化合物7抑制胰腺癌细胞capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990的ic
50
值分别为7.74
±
1.12
µ
m、6.68
±
1.11
µ
m、6.25
±
0.54
µ
m、5.35
±
0.33
ꢀµ
m；化合物10抑制胰腺癌细胞capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990的ic
50
值分别为7.08
±
1.93
µ
m、8.83
±
2.13
µ
m、21.95
±
2.10
µ
m、30.81
±
2.02
ꢀµ
m；化合物13抑制胰腺癌细胞capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990的ic
50
值分别为8.25
±
1.32
µ
m、12.45
±
3.21
µ
m、15.24
±
0.51
µ
m、 18.35
±
0.45
µ
m；化合物17抑制胰腺癌细胞capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990的ic
50
值分别为9.52
±
0.56
µ
m、8.58
±
0.24
µ
m、12.25
±
1.25
µ
m、11.24
±
2.10
µ
m；化合物20抑制胰腺癌细胞capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990的ic
50
值分别为17.23
±
1.80
µ
m、24.00
±
4.80
µ
m、47.31
±
1.09
µ
m、12.55
±
1.29
µ
m；阳性对照紫杉醇抑制胰腺癌细胞capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990的ic
50
值分别为6.51
±
1.34
µ
m、0.32
±
0.13
µ
m、11.96
±
1.80
µ
m、5.32
±
0.90
µ
m。以上结果显示，化合物3、7、10、17、20对胰腺癌capan-2、cfpac-1、panc-1、sw1990细胞都有显著的增殖抑制作用，表明化合物3、7、10、17、20能够明显抑制胰腺癌细胞的增殖，具有抗胰腺癌潜在作用，具有开发胰腺癌治疗药物的潜能。
具体实施方式
[0014]
实施例1：化合物7、10、13、17、20的分离工艺，包括以下步骤：将10kg干燥的羌活根及根茎用70%甲醇室温提取提取3次，每次7天，提取液合并， 蒸发浓缩至无醇味，得到总提取液3kg。将总提取物用水分散后，分别用石油醚（60~90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相；
乙酸乙酯相（170g）通过硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮（50:1~0:1，v/v）梯度洗脱，依次得到八个组分fr.1-fr.8；组分fr.3（12.0 g）用硅胶柱进行色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（20:1~0:1，v/v）梯度洗脱，得到6个组分fr.3-1~fr.3-6。其中fr.3-3（5.3 g）进一步通过硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯（10:1~0:1，v/v）洗脱得到组分fr.3-3.1、fr.3-3.2和纯化合物2（3 g）；fr.3-3.1（36 mg）用石油醚-乙酸乙酯（3:1，v/v）再次纯化，得到化合物 24 (16.3 mg)。
[0015] fr.4（14.6 g）通过硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯（20:1~0:1，v/v）洗脱得到10个组分fr.4-1~fr.4-10。其中fr.4-4（1.1 g）进一步通过c
18
反相硅胶柱分离、甲醇/水（甲醇体积50%~100%）梯度洗脱，产生九个组分fr.4-4.1~fr.4-4.9。其中组分fr.4-4.6（135 mg）用制备型 hplc（石油醚-乙酸乙酯，1:9，v/v，流速为4 ml/min）纯化，依次得到化合物 10（9.6 mg，tr=11 min）、化合物11（39.1 mg，t
r = 19 min）；fr.4-4.5（68.7 mg）用制备型 hplc（石油醚-乙酸乙酯，1:9，v/v，流速为4 ml/min）纯化，依次得到化合物 17（6.6 mg，t
r = 12 min）、化合物16（26.5 mg，t
r = 21.6 min）；fr.4-4.4（47.9 mg）用制备型 hplc（石油醚-乙酸乙酯，1.5:8.5，v/v，流速为4 ml/min）纯化，依次得到化合物 13（4.4 mg，tr= 9.4 min）、化合物12（12 mg，tr=13.5 min）。fr.4-6（1.3g）用硅胶柱进行色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（20:1~0:1，v/v）洗脱，得到九个亚组分fr.4-6-1~fr.4-6-9，其中fr.4-6-4 （601.4 mg） 通过硅胶用二氯甲烷-丙酮（10:1，v/v）分离，得到三个组分fr.4-6-4.1~fr.4-6-4.3，fr.4-6-4.2（350 mg）再用制备型 hplc（甲醇/水= 75/25，流速10 ml/min）纯化，依次得到化合物 22（38.6 mg，t
r = 23 min）和化合物1（16.2 mg，t
r = 36 min）。
[0016]
fr.6（49g）用葡聚糖凝胶sephadex lh-20分离，二氯甲烷-甲醇（10:1，v/v）洗脱，得到六个组分fr.6-1~fr.6-6。fr.6-2（13g）用硅胶柱进行色谱分离，用二氯甲烷-甲醇（50:1~0:1，v/v）梯度洗脱，获得11个组分fr.6-2-1~fr.6-2-11；fr.6-2-4（7.36g）通过硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯（50:1~0:1，v/v）梯度洗脱，得到六个组分fr.6-2-4.1~fr.6-2-4.6；fr.6-2-4.1（68mg）用硅胶柱色谱纯化，并用石油醚-乙酸乙酯（3:1，v/v）洗脱，依次得化合物7（43.7mg）和化合物9（21mg）；fr.6-2-4.2 （1.4g）进一步通过硅胶分离，石油醚-乙酸乙酯（10:1~0:1，v/v）洗脱，得到三个组分fr.6-2-4.2.1~fr.6-2-4.2.3，其中fr.6-2-4.2.2（282.7 mg）用制备型 hplc（甲醇/水= 80/20，流速10 ml/min）纯化，依次得到化合物 21（27.5 mg，t
r = 25.6 min）、化合物3（93.9 mg，t
r = 28.9 min）和化合物8（15.4 mg，t
r = 32.3 min）。fr.6-2-4.4（243 mg）用制备型 hplc（甲醇/水= 75/25，流速10 ml/min）洗脱，得到化合物 20（129.1 mg，t
r = 22.5 min）。fr.6-2-4.6（113.2 mg）用制备型 hplc（甲醇/水= 75/25，流速10 ml/min）洗脱，得到化合物 6（80 mg，t
r = 24 min）；fr.6-2-4.7（40mg）通过ptlc（二氯甲烷-甲醇，10:1，v/v）分离，得到化合物4（25mg）和化合物5（8mg）。fr.6-2-9（47 mg）用制备型 hplc（甲醇/水= 75/25，流速10 ml/min）分离，得到化合物14（13.6 mg，t
r = 14 min）；fr.6-2-9重结晶后用乙酸乙酯洗涤得化合物19（14.8mg）；fr.6-2-9通过制备型ptlc分离，并用二氯甲烷-甲醇（10:1，v/v）展开，得到化合物15（8mg）。fr.6-4-2.3（65 mg）用制备型 hplc（甲醇/水= 60/40，流速10 ml/min），得到化合物18（23 mg，t
r = 15 min）。fr.6-6-10 （53 mg）用制备型 hplc（甲醇/水= 70/30，流速10 ml/min）纯化，得到化合物 23（35 mg，t
r 18 min）。
[0017]
对其中具有抗胰腺癌活性的5个化合物进行数据表征，具体如下：
化合物7的实验数据如下：白色无定形粉末；红外光谱ir (kbr)ν
max
1712,1617,1586,1452 cm-1
；氢谱1h 和碳谱
13
c nmr见表1；高分辨质谱hresims m/z481.1572 [m na]
(calcd.for c
28h26
o6na,481.1600)。
[0018]
化合物10的实验数据如下：黄色油状；红外光谱ir (kbr) ν
max
3405, 1705,1633, 1593, 1429 cm-1
；氢谱1h 和碳谱
13
c nmr见表1；高分辨质谱hresims m/z287.1259[m na]
(calcd.for c
15h20
o4na, 287.1254)。
[0019]
化合物13的实验数据如下：黄色油状；红外光谱ir (kbr) ν
max
3424,1704,1633,1515,1430 cm-1
；氢谱1h 和碳谱
13
c nmr见表2；高分辨质谱hresimsm/z259.0951[m na]
(calcd.for c
13h16
o4na,259.0941)。
[0020]
化合物17的实验数据如下：黄色油状；红外光谱ir (kbr) ν
max
3424,1706,1632,1593,1430 cm-1
；氢谱1h 和碳谱
13
c nmr见表2；高分辨质谱hresims m/z285.1105[m na]
(calcd.for c
15h18
o4na, 285.1097)。
[0021]
化合物20的实验数据如下：浅褐色油状；红外光谱ir (kbr) ν
max
3430,2925,2857,1729,1665,1586,1466,1291,1048 cm-1
；氢谱1h 和碳谱
13
c nmr见表3；高分辨质谱hresims m/z515.2040 [m na]
(calcd. for c
29h32
o7na, 515.2041)。
[0022]
实施例2、化合物7、10、13、17、20用于制备抗胰腺癌药物以化合物7、10、13、17、20中的至少一种化合物为活性物质，并按药剂学可接受的辅料和规工艺制备成内服制剂（如胶囊剂、片剂、颗粒剂等）或注射剂等。