一种鸭卵巢颗粒细胞的体外分离纯化培养方法与流程

1.本发明涉及卵巢颗粒细胞的分离纯化培养技术领域，具体为一种鸭卵巢颗粒细胞的体外分离纯化培养方法。


背景技术：

2.随着畜牧业大规模集约化生产的快速发展，鸭的产蛋量是制约鸭产业化发展的极为重要的因素之一，亟待育种工作者解决；卵巢是雌性动物的主要繁殖器官，卵巢上卵泡的周期性变化是其最主要的生理活动；鸭的等级卵泡有严格的阶级发育体系，依次经由原始卵泡、小白卵泡、大白卵泡、小黄卵泡、大黄卵泡以及排卵前卵泡发育成熟；在这个过程中，鸭可以通过调控等级卵泡的数量及其闭锁来调节排卵的速度，进而影响其自身的产蛋性能。
3.卵泡颗粒细胞是卵泡的重要组成部分，是卵泡发育和维持正常功能的重要条件，通过缝隙连接的方式以卵母细胞为中心围绕，在卵泡的发育、成熟、排卵及闭锁过程中均起重要作用，因此，颗粒细胞对维持卵巢繁殖功能即产蛋性状，也发挥着极其重要的作用；颗粒细胞可分泌激素受体刺激卵母细胞发育，同时对卵泡的选择具有决定性作用，卵巢颗粒细胞的自噬凋亡会直接导致卵泡的闭锁；卵泡颗粒细胞中可以分泌类固醇激素、促卵泡素和促黄体素等激素，还可以产生一些细胞因子(孕酮、干细胞生长因子和表皮生长因子等)，调控着卵泡和卵母细胞的生长发育。
4.近年来，越越多的研究聚焦到卵巢微环境的调节机制上，大量研究报道表明颗粒细胞在此过程中起到决定性作用；因此，探寻一种鸭卵巢颗粒细胞体外高效的分离纯化培养方法，对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡机制进行深入的研究，对于阐明卵巢颗粒细胞对家禽的产蛋性能所发挥的调控机制有着重要的理论和实际意义；现有的培养方法只采用机械分离的方法，在分离颗粒细胞膜的过程中，会混有大量的脂肪、膜层、血液等杂质，从而导致所获得的颗粒细胞纯度较低，根据图1可以看出，分离获得的细胞悬液中含有较多的杂质细胞，如血红细胞、白细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等等(箭头所示)，且培养24h贴壁及增殖效率极低(图2)，48h贴壁及增殖效率大约在50％左右(图3)。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种鸭卵巢颗粒细胞的体外分离纯化培养方法，解决了目前尚未有完善及高效的鸭卵巢颗粒细胞分离纯化培养方法的问题，该方法高效、系统，免去反复冲洗去除卵黄细胞及血细胞，得到的鸭卵巢颗粒细胞纯度高，活力好，鸭卵巢颗粒细胞24h贴壁率及增殖效率高达80％以上。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种鸭卵巢颗粒细胞的体外分离纯化培养方法，包括以下步骤：
8.(1)把母鸭固定好，用剪刀剪断气管，倒置使血液流尽，沿腹白线打开腹腔，取出直径12-15mm的排卵前卵泡f1-f6，放入装有1％双抗pbs缓冲液的容器里，4小时内转移至细胞
间；
9.(2)剪取完整的排卵前卵泡，单颗置于含有1％双抗dpbs溶液的培养皿中，撕掉最外层的血管膜，得到单颗完整的排卵前卵泡，并转移至干净的培养皿中；
10.(3)用眼科剪剪破卵黄膜使卵黄流出，而后用镊子夹取剩余膜层放入装有1％双抗pbs的培养皿中，震荡、漂洗出白色颗粒细胞层，接着用1％双抗pbs溶液继续漂洗白色颗粒细胞层2次；
11.(4)将漂洗干净的颗粒细胞层转移至1.5ml离心管中，用眼科剪将颗粒细胞层剪碎，而后采用0.25％胰蛋白酶4℃消化2.5min，终止消化后对颗粒细胞层进行重悬，用细胞筛过滤，收集过滤后的细胞悬液检测颗粒细胞密度，而后调整其密度在1
×
10
7-3
×
107个/ml；
12.(5)加入与细胞悬液体积比为1:200的37℃的fshr直标抗体，孵育1.5h，离心弃上清、pbs溶液润洗2次；再加入与细胞悬液体积比为1:200的37℃的lhr直标抗体，孵育1.5h，离心弃上清、pbs溶液润洗2次；而后将fshr和lhr双重特异性标记后的细胞悬液进行流式细胞分选，分选出双阳性细胞；
13.(6)将细胞培养皿用0.15mg/ml多聚赖氨酸溶液处理培养皿底部，每皿吸取细胞悬液1ml，再加入5％胎牛血清的培养基1ml，而后转移至37℃、5％co2恒温箱培养；
14.(7)培养24h，取细胞培养皿在倒置显微镜下观察细胞形态，再进行he染色、间接免疫荧光鉴定颗粒细胞特异性，合格后，消化并加入10％胎牛血清的培养基传代培养。
15.优选的，所述母鸭为180-330日龄的母鸭。
16.优选的，所述步骤(4)具体为：将漂洗后的颗粒细胞层置于1.5ml离心管中，加入1ml 0.25％胰蛋白酶，用眼科剪持续剪碎组织2min，置于4℃消化2.5min，使用移液器反复吹打30s使颗粒细胞层充分消化，令细胞团块分散，而后加入1ml 5％胎牛血清的培养基终止消化；1500rmp 4℃离心3min，弃去上清液，加入2ml pbs溶液重悬细胞，用细胞筛过滤后，调整细胞密度至1
×
107个/ml。
17.优选的，步骤(5)具体为：将步骤(4)获得的细胞悬液分装至1.5ml指形管中，每管1ml pbs溶液重悬细胞，而后加入5ul fshr直标抗体，37℃孵育1.5h，1500rmp 4℃离心3min，弃去上清液，pbs溶液反复润洗2次；而后加入1ml pbs溶液重悬细胞，再加入5ul lhr直标抗体，37℃孵育1.5h，1500rmp 4℃离心3min，弃去上清液，pbs溶液反复润洗2次；加入1ml pbs溶液重悬细胞，将fshr和lhr双重特异性标记后的细胞悬液进行流式细胞分选，分选出双阳性细胞。
18.优选的，步骤(6)中培养皿的制备为：吸取1ml 0.15mg/ml多聚赖氨酸溶液加入35mm细胞培养皿，室温静止30min后将残余多聚赖氨酸溶液吸出，而后将处理过的培养皿至于37℃烘干备用。
19.优选的，步骤(4)中，所述细胞筛为200目细胞筛。
20.与现有技术比，本发明达到的有益效果是：
21.本发明是针对鸭卵巢颗粒细胞分离纯化培养而设计的方法，该分离培养方法具有以下优点。
22.(1)采用本发明提供的分离培养方法得到的鸭卵巢颗粒细胞纯度高达98％，活力高，且鸭卵巢颗粒细胞的贴壁率高，可供继代培养、转染使用。
23.(2)本发明的提供的方法简单易行，经济实用，可操作性好。
附图说明
24.图1现有的鸭颗粒细胞分离培养方法获得的鸭颗粒细胞；
25.图2现有的鸭颗粒细胞分离培养方法体外培养24h贴壁效果；
26.图3现有的鸭颗粒细胞分离培养方法体外培养48h贴壁效果；
27.图4本发明fshr和lhr双标流式细胞分选结果；
28.图5本发明鸭颗粒细胞24h贴壁培养效果(200x)；
29.图6本发明颗粒细胞he染色结果(200x)；
30.图7本发明颗粒细胞特异性间接免疫荧光染色鉴定结果；
31.图8本发明鸭颗粒细胞分离培养方法获得的鸭颗粒细胞。
具体实施方式
32.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
33.本发明提供如下技术方案：
34.一种鸭卵巢颗粒细胞的体外分离纯化培养方法，包括以下步骤：
35.(1)把母鸭固定好，用剪刀剪断气管，倒置使血液流尽，沿腹白线打开腹腔，取出直径12-15mm的排卵前卵泡f1-f6，放入装有1％双抗pbs缓冲液的容器里，4小时内转移至细胞间；
36.(2)剪取完整的排卵前卵泡，单颗置于含有1％双抗dpbs溶液的培养皿中，撕掉最外层的血管膜，得到单颗完整的排卵前卵泡，并转移至干净的培养皿中；只需剥离卵泡表面血管膜，其余膜层不需要剥离，简化步骤，有效节省剥离其他膜层所需时间。
37.(3)用眼科剪剪破卵黄膜使卵黄流出，而后用镊子夹取剩余膜层放入装有1％双抗pbs的培养皿中，震荡、漂洗出白色颗粒细胞层，接着用1％双抗pbs溶液继续漂洗白色颗粒细胞层2次；其中，使卵黄从破口处缓慢流出，而后震荡、漂洗出白色颗粒细胞层，简便易行，能一次获得完整的颗粒细胞膜，效率提高。
38.(4)将漂洗干净的颗粒细胞层转移至1.5ml离心管中，用眼科剪将颗粒细胞层剪碎，而后采用0.25％胰蛋白酶4℃消化2.5min，终止消化后对颗粒细胞层进行重悬，用细胞筛过滤，收集过滤后的细胞悬液检测颗粒细胞密度，而后调整其密度在1
×
10
7-3
×
107个/ml，该细胞密度下能保证后期流式筛选效率，同时确保经流式筛选后的细胞培养密度，增加后期颗粒细胞贴壁效率。
39.(5)加入与细胞悬液体积比为1:200的37℃的fshr直标抗体，孵育1.5h，离心弃上清、pbs溶液反复润洗2次；再加入与细胞悬液体积比为1:200的37℃的lhr直标抗体，孵育1.5h，离心弃上清、pbs溶液反复润洗2次；而后将fshr和lhr双重特异性标记后的细胞悬液进行流式细胞分选，分选出双阳性细胞；
40.(6)将细胞培养皿用0.15mg/ml多聚赖氨酸溶液处理培养皿底部，每皿吸取细胞悬液1ml，加入5％胎牛血清的培养基1ml，而后转移至37℃、5％co2恒温箱培养；
41.(7)培养24h，取细胞培养皿倒置显微镜下观察细胞形态，得到的鸭颗粒细胞贴壁
率在80％以上，再进行he染色、间接免疫荧光鉴定(fshr lhr)颗粒细胞特异性，合格后，消化并加入10％胎牛血清的培养基传代培养。
42.优选的，所述母鸭为180-330日龄的母鸭，此日龄阶段母鸭处于产蛋期，能有效提高从排卵前卵泡中获得颗粒细胞的效率。
43.优选的，所述步骤(4)具体为：将漂洗后的颗粒细胞层置于1.5ml离心管中，加入1ml 0.25％胰蛋白酶，用眼科剪持续剪碎组织2min，而后置于4℃消化2.5min，最后使用移液器反复吹打30s使颗粒细胞层充分消化，令细胞团块分散，而后加入1ml 5％胎牛血清的培养基终止消化；1500rmp 4℃离心3min，弃去上清液，加入2ml pbs溶液重悬细胞，用细胞筛过滤后，调整细胞密度至1
×
107个/ml,该细胞密度下更能保证后期流式筛选效率，同时确保经流式筛选后的细胞培养密度，增加后期颗粒细胞贴壁效率。
44.优选的，步骤(5)具体为：将步骤(4)获得的细胞悬液分装至1.5ml指形管中，每管1ml pbs溶液重悬细胞，而后加入5ul fshr直标抗体，37℃孵育1.5h，1500rmp 4℃离心3min，弃去上清液，pbs溶液反复润洗2次；而后加入1ml pbs溶液重悬细胞，再加入5ul lhr直标抗体，37℃孵育1.5h，1500rmp 4℃离心3min，弃去上清液，pbs溶液反复润洗2次；加入1ml pbs溶液重悬细胞，将fshr和lhr双重特异性标记后的细胞悬液进行流式细胞分选，分选出双阳性细胞。免去反复冲洗去除卵黄细胞及血细胞，即可得到纯度高，活力好，贴壁率及成增殖效率高的鸭卵巢颗粒细胞。
45.优选的，步骤(6)中培养皿的制备为：吸取1ml 0.15mg/ml多聚赖氨酸溶液加入35mm细胞培养皿，室温静止30min后将残余多聚赖氨酸溶液吸出，而后将处理过的培养皿至于37℃烘干备用。采用多聚赖氨酸包被的培养皿可增加颗粒细胞贴壁率，从而提升该方法体外分离培养效果。
46.优选的，步骤(4)中，所述细胞筛为200目细胞筛，能有效过滤未完全消化的细胞团块及杂质等，避免流式筛选仪器堵塞。
47.上述方法中所述含有胎牛血清的培养基中胎牛血清浓度为其体积百分比，培养基中的培养液为dmem培养液。
48.下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
49.实施例1
50.鸭卵巢颗粒细胞的体外分离纯化培养方法，包括以下步骤：
51.(1)把180-330日龄的母鸭固定好，用剪刀剪断气管，倒置使血液流尽，沿腹白线打开腹腔，取出直径12-15mm的排卵前卵泡f1-f6，放入装有1％双抗pbs缓冲液的容器里，4小时内转移至细胞间；
52.(2)剪取完整的排卵前卵泡，单颗置于含有1％双抗dpbs溶液的培养皿中，轻轻撕掉最外层的血管膜，其余膜层不需要剥离，得到单颗完整的排卵前卵泡，并转移至干净的培养皿中；
53.(3)用眼科剪剪破卵黄膜使卵黄流出，而后用镊子夹取剩余膜层放入装有1％双抗pbs的培养皿中，轻轻震荡、漂洗出白色颗粒细胞层，接着用1％双抗pbs溶液继续漂洗白色颗粒细胞层2次；
54.(4)将漂洗后的颗粒细胞层置于1.5ml离心管中，加入1ml 0.25％胰蛋白酶，用眼
科剪持续剪碎组织2min，而后置于4℃消化2.5min，最后使用移液器反复吹打30s使颗粒细胞层充分消化，令细胞团块分散，而后加入1ml5％胎牛血清的培养基终止消化；1500rmp4℃离心3min，弃去上清液，加入2mlpbs溶液重悬细胞，用200目细胞筛过滤后，调整细胞密度至1
×
107个/ml；
55.(5)将步骤(4)获得的细胞悬液分装至1.5ml指形管中，每管1ml pbs溶液重悬细胞，而后加入5ul fshr直标抗体，37℃孵育1.5h，1500rmp 4℃离心3min，弃去上清液，pbs溶液反复润洗2次；而后加入1ml pbs溶液重悬细胞，再加入5ul lhr直标抗体，37℃孵育1.5h，1500rmp 4℃离心3min，弃去上清液，pbs溶液反复润洗2次；加入1ml pbs溶液重悬细胞，将fshr和lhr双重特异性标记后的细胞悬液采用型号为gallios的beckman cytoflex srt流式细胞分选仪进行流式细胞分选，分选出双阳性细胞，分选情况如图4，横纵坐标轴分别是fl1：绿色荧光通道1，fl3：红色荧光通道3；图中的四个区域分别是c
‑‑
：fshr lhr双阴性细胞；c- ：lhr单阳性细胞；c -:fshr单阳性细胞；c ：fshr lhr双阳性细胞，即所需筛选出的颗粒细胞；筛选相关数据如表1：
56.表1筛选情况表
57.通道细胞总数筛选总数通道总数总数940492.30100.00c
‑‑
146014.3315.53c- 7497.357.96c -310030.4332.96c 409540.1943.55
58.(6)吸取1ml 0.15mg/ml多聚赖氨酸溶液加入35mm细胞培养皿，室温静止30min后将残余多聚赖氨酸溶液吸出，而后将处理过的培养皿至于37℃烘干备用，每皿吸取细胞悬液1ml，加入5％胎牛血清的培养基1ml，37℃、5％co2恒温箱培养；
59.(7)培养24h，取样倒置显微镜下观察细胞形态，得到的鸭颗粒细胞贴壁率在85％，再取样进行he染色、间接免疫荧光鉴定(fshr lhr)颗粒细胞特异性，经鉴定符合要求，消化并加入10％胎牛血清的培养基传代培养。
60.实验结果：
61.因为其他细胞的存在会竞争营养，影响颗粒细胞的贴壁和增殖，而根据图5的结果显示鸭颗粒细胞贴壁形态完整，活力高，贴壁率高达85％、纯度高达98％；
62.根据图6显示细胞浆与细胞核染色均匀，面积较大，轮廓分明，大小均一，似多角形，呈大理石状铺贴，符合颗粒细胞典型特征。
63.根据图7的荧光染色是通过特定表达蛋白来鉴定颗粒细胞特异性，左上角是绿色:fshr，右上角是红色:lhr，左下角是蓝色:dapi，右下角d:merge。蓝色代表的是细胞核，可以看到细胞(蓝色细胞核)全部显示出fshr和lhr阳性。可见，肉眼所见的细胞都是颗粒细胞。
64.图8是本发明鸭颗粒细胞分离培养方法获得的细胞图，可见都是颗粒细胞。
65.综上所述，
66.根据本发明的培养方法免去反复冲洗去除卵黄细胞及血细胞，即可得贴壁心态完整，贴壁率高，纯度高、活力高的到的鸭卵巢颗粒细胞，其中贴壁率在80％以上，纯度高达98％；经过he染色、间接免疫荧光染色鉴定确实都是颗粒细胞，可供继代培养、转染使用。
67.需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
68.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限。