KRT10定点基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的构建及应用的制作方法

krt10定点基因敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato小鼠模型的构建及应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种krt10定点基因敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato小鼠模型的构建及应用。


背景技术：

2.表达krt10(角蛋白10)的krt10

细胞位于皮肤的棘层，由基底层分化而来，属于分化的角质细胞。krt10

细胞在维持细胞分化、保持皮肤屏障等功能方面发挥了重要作用。目前，尚未有研究报道关于krt10

细胞的其他作用。并且，对于krt10

细胞在其损伤修复、逆分化过程中发挥的作用知之甚少。


技术实现要素：

3.本发明目的在于提供krt10定点基因敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato小鼠模型的构建及应用，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
4.本发明一方面提供了krt10定点基因敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
5.通过合成或是合成后体外转录的方式获得sgrna，构建cas9/sgrna质粒，所述sgrna的核苷酸序列为：5
’‑
agtctcttcatacgggccactgg-3’(seqidno.1)；
6.构建krt10定点基因敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato的重组打靶载体；
7.将所述cas9/sgrna质粒和所述重组打靶载体通过显微注射的方式注射到供体小鼠的受精卵中，得到转染受精卵；
8.将所述转染受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，诞下f0代小鼠，对所述f0代小鼠进行基因型鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为嵌合体小鼠；
9.将所述嵌合体小鼠与野生型小鼠杂交，后代经基因型鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为f1代小鼠；
10.鉴定所述f1代小鼠，正确重组且没有随机插入的即为在krt10基因启动子后面定点敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato的小鼠，得到所述小鼠模型。
11.进一步，所述p2a-crepr1-t2a-tdtomato的核苷酸序列如seqidno.2所示。
12.进一步，所述重组打靶载体是通过同源重组的方式在krt10基因终止密码子位点定点敲入所述p2a-crepr1-t2a-tdtomato得到krt10-p2a-crepr1-t2a-tdtomato表达框。
13.进一步，所述重组打靶载体包含长度约为2kb的5’同源臂、p2a-crepr1-t2a-tdtomato和长度约为2kb的3’同源臂。
14.进一步，所述供体小鼠为c57bl/6j小鼠。
15.进一步，所述假孕母鼠为c57bl/6j小鼠。
16.进一步，采用pcr鉴定方法对所述f0代小鼠进行基因型鉴定；f0代小鼠鉴定方法包
括以下引物：
17.ege-sty-061-l-gt-f：5
’‑
gcagaaaagaatcgcaaggatgctg-3’(seqidno.3)；
18.ege-sty-061-l-gt-r：5
’‑
aaacgctgtgagctcgacacaactc-3’(seqidno.4)；
19.ege-sty-061-r-gt-f：5
’‑
gtggcagatcccacaggagtttgtc-3’(seqidno.5)；
20.ege-sty-061-r-gt-r：5
’‑
agggtggggcttacaacaataggta-3’(seqidno.6)。
21.进一步，采用pcr鉴定方法对所述f1代小鼠进行基因型鉴定；f1代小鼠鉴定方法包括以下引物：
22.ege-sty-061-l-gt-f：5
’‑
gcagaaaagaatcgcaaggatgctg-3’(seqidno.3)；
23.ege-sty-061-l-gt-r：5
’‑
aaacgctgtgagctcgacacaactc-3’(seqidno.4)；
24.ege-sty-061-r-gt-f：5
’‑
gtggcagatcccacaggagtttgtc-3’(seqidno.5)；
25.ege-sty-061-r-gt-r：5
’‑
agggtggggcttacaacaataggta-3’(seqidno.6)；
26.ege-sty-061-wt-f：5
’‑
gctgaaactagctggggtaatctgaa-3’(seqidno.7)；
27.ege-sty-061-wt-r：5
’‑
agacgaaaggactctaccctcaggt-3’(seqidno.8)；
28.ege-sty-061-mut-f：5
’‑
tgatctacaaggtgaagatgcgcgg-3’(seqidno.9)；
29.ege-sty-061-mut-r：5
’‑
cgatccctgaacatgtccatcag-3’(seqidno.10)。
30.进一步，f0代小鼠及f1代小鼠的鉴定方法均采用相同的反应条件，如表1所示。
31.表1pcr鉴定反应程序
[0032][0033]
进一步，所述鉴定随机插入的方法为通过southernblot排除随机插入。所用southernblot酶切位点为ncoi和econi。核苷酸序列如seqidno.17所示的3’probe用于检测是否发生正确重组，若发生正确重组，将会出现野生型和突变型两个条带；若未正确重组，将只会出现野生型条带。核苷酸序列如seqidno.18所示的creprobe用于检测是否含有随机插入，若发生正确重组，将只会出现目的条带；若存在随机插入，将会出现多个条带。
[0034]
本发明另一方面提供了由上述构建方法获得的小鼠模型，在krt10基因对krt10

细胞发育和分化相关研究中的应用。
[0035]
本发明包括以下有益效果：
[0036]
所述小鼠模型与mt/mg小鼠(jaxno:007676)杂交后，可得到krt10-crepgr-tdtomato；mt/mg小鼠，经米非司酮诱导可特异性追踪krt10

细胞，使krt10

细胞的细胞膜由红色变为绿色。将所述小鼠模型与floxed小鼠交配后，给予诱导，可特异性敲除krt10

细胞中的目的基因。将所述小鼠模型与条件性过表达转基因小鼠交配后，给予诱导，可特异性过
表达krt10

细胞中的目的基因。该小鼠为研究表皮角质细胞对伤口修复影响、逆分化及其作用机制等相关研究提供了理想的模型。
附图说明
[0037]
图1是在krt10基因终止密码子位点定敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato的打靶策略示意图；
[0038]
图2是实施例2中sgrna活性检测结果柱状图；
[0039]
图3是实施例3中cas9/sgrna质粒图谱；
[0040]
图4是实施例4中所述重组打靶载体图谱；
[0041]
图5是实施例5中f0代小鼠基因型鉴定结果图；
[0042]
图6是实施例6中f1代小鼠扩增产物长度3450bp的鉴定结果图；
[0043]
图7是实施例6中f1代小鼠扩增产物长度3459bp的鉴定结果图；
[0044]
图8是实施例6中f1代小鼠扩增产物长度361bp的鉴定结果图；
[0045]
图9是实施例6中f1代小鼠扩增产物长度482bp的鉴定结果图；
[0046]
图10是实施例7中southern blot检测结果图；
[0047]
图11是实施例8中所述小鼠模型表达红色荧光图；
[0048]
图12是实施例8中krt10-crepr1-tdtomato；mt/mg小鼠的体内追踪图。
具体实施方式
[0049]
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0050]
实施例1，验证构建品系小鼠dna序列。
[0051]
选取c57bl/6j小鼠作为供体小鼠，利用引物对：ege-sty-061-msd-f:5
’ꢀ‑
gcatcaagcttggtaccgatgctgaaacta-3’(seq id no.11)和 ege-sty-061-msd-r:5
’‑
acttaatcgtggaggatgatctcatactggt-3
’ꢀ
(seq id no.12)，进行pcr扩增对c57bl/6j的鼠尾靶位点序列进行pcr扩增并测序验证，以保证构建品系小鼠的dna序列能够与后续设计的sgrna识别序列相适应。
[0052]
经测序，确认本实施例的扩增产物长度为763bp，与c57bl/6j小鼠的dna 序列完全一致。
[0053]
实施例2，sgrna的设计及获得。
[0054]
根据实施例1测序所知的靶位点序列，设计出7条潜在的sgrna，分别为：
[0055]
sgrna1：5
’‑
agtgatcaggacgattattgagg-3’(seq id no.11)；
[0056]
sgrna2：5
’‑
agtgatcaggacgattattgagg-3’(seq id no.12)；
[0057]
sgrna3：5
’‑
agtctcttcatacgggccactgg-3’(seq id no.1)；
[0058]
sgrna4：5
’‑
gacgaaaggactctaccctcagg-3’(seq id no.13)；
[0059]
sgrna5：5
’‑
aataatcgtcctgatcactttgg-3’(seq id no.14)；
[0060]
sgrna6：5
’‑
catagaagagtctcttcatacgg-3’(seq id no.15)；
[0061]
sgrna7：5
’‑
tactaacaagctattacaaaagg-3’(seqidno.16)。
[0062]
采用百奥赛图公司自主研发的crispr/cas9活性检测方法-ucatm方式进行检测sgrna的活性，检测结果如图2所示，其中sgrna3的活性最高，用sgrna3序列作为sgrna进行后续构建。
[0063]
将筛选所得sgrna连入带有t7启动子的质粒载体上并进行体外转录，得到进行显微注射的rna，最后通过电泳获得纯化的所述sgrna的片段。
[0064]
实施例3，构建cas9/sgrna质粒。
[0065]
通过实施例2设计的sgrna序列合成oligos(低聚核苷酸)，然后通过退火聚合的方式将sgrna连入pcs载体中，连接产物转化后送样测序正确；其中cas9/sgrna质粒载体的大小为9918bp，图谱如图3所示。
[0066]
实施例4，构建重组打靶载体。
[0067]
在krt10基因的终止密码子位点定敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato得到krt10-p2a-crepr1-t2a-tdtomato表达框，进而获得所述krt10定点基因敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato的重组打靶载体。通过酶切鉴定和测序，所述重组打靶载体包含约2kb的5’同源臂、p2a-crepr1-t2a-tdtomato片段和约2kb的3’同源臂。所述酶切鉴定选用的酶切位点有三对，分别为：酶切位点scai hindiii，得到的片段大小为4531bp 2467bp 2177bp 717bp；酶切位点apai bamhi，得到的片段大小为5397bp 3943bp 552bp；酶切位点ecori sali，得到的片段大小为6393bp 3509bp；所述重组打靶载体图谱如图4所示。
[0068]
实施例5，获取f0代小鼠。
[0069]
将实施例3所得cas9/sgrna质粒和实施例4所得重组打靶载体通过显微注射的方式注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，得到转染受精卵。将所述受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，诞下嵌合体小鼠，经pcr鉴定基因型，呈阳性的为f0代小鼠。具体鉴定方法是采用两对引物对进行复合扩增，从扩增产物长度判断小鼠基因型。
[0070]
ege-sty-061-l-gt-f：5
’‑
gcagaaaagaatcgcaaggatgctg-3’(seqidno.3)与ege-sty-061-l-gt-r：5
’‑
aaacgctgtgagctcgacacaactc-3’(seqidno.4)应当扩增出3450bp产物；ege-sty-061-r-gt-f：5
’‑
gtggcagatcccacaggagtttgtc-3’(seqidno.5)与ege-sty-061-r-gt-r：5
’‑
agggtggggcttacaacaataggta-3’(seqidno.6)应当扩增出3459bp产物。同时满足上述扩增产物条件的即为f0代小鼠。
[0071]
实验结果如图5所示，图中“ey61-数字”代表“嵌合体小鼠编号”，pc1代表positivecontrol(阳性对照)，wt代表wildtype(野生型)c57bl/6j小鼠。图5(a)、图5(b)为第一对引物的鉴定结果，图5(c)、图5(d)为第二对引物的鉴定结果。实验编号为ey61-002和ey61-023的小鼠为阳性f0代小鼠，实验编号为ey61-033、ey61-043和ey61-052为疑似阳性f0代小鼠，共获得2只阳性、3只疑似阳性的f0代小鼠。
[0072]
实施例6，获取f1代小鼠。
[0073]
将实施例5所得f0代小鼠与野生纯合的c57bl/6j小鼠杂交，诞下的小鼠仅pcr鉴定基因型，呈阳性的为f1代小鼠。使用以下引物进行扩增：
[0074]
ege-sty-061-l-gt-f：5
’‑
gcagaaaagaatcgcaaggatgctg-3’(seqidno.3)；
[0075]
ege-sty-061-l-gt-r：5
’‑
aaacgctgtgagctcgacacaactc-3’(seqidno.4)；
[0076]
ege-sty-061-r-gt-f：5
’‑
gtggcagatcccacaggagtttgtc-3’(seqidno.5)；
[0077]
ege-sty-061-r-gt-r：5
’‑
agggtggggcttacaacaataggta-3’(seqidno.6)；
[0078]
ege-sty-061-wt-f：5
’‑
gctgaaactagctggggtaatctgaa-3’(seqidno.7)；
[0079]
ege-sty-061-wt-r：5
’‑
agacgaaaggactctaccctcaggt-3’(seqidno.8)；
[0080]
ege-sty-061-mut-f：5
’‑
tgatctacaaggtgaagatgcgcgg-3’(seqidno.9)；
[0081]
ege-sty-061-mut-r：5
’‑
cgatccctgaacatgtccatcag-3’(seqidno.10)。
[0082]
实验结果如图6至9所示，图中“1ey61-数字”代表“f1代小鼠编号”，wt代表wildtype(野生型)c57bl/6j小鼠。图6(a)和图6(b)为ege-sty-061-l-gt-f/ege-sty-061-l-gt-r的产物电泳图，产物长度应当为3450bp。图7(a)和图7(b)为ege-sty-061-r-gt-f/ege-sty-061-r-gt-r的产物电泳图，产物长度应当为3459bp。图8(a)和图8(b)为ege-sty-061-wt-f/ege-sty-061-wt-r的产物电泳图，产物长度应当为361bp。图9(a)和图9(b)为ege-sty-061-wt-f/ege-sty-061-mut-r的产物电泳图，产物长度应当为482bp。若实验编号对应的扩增产物分别出现3450bp、3459bp，以及361bp或482bp的条带，则为阳性小鼠。鉴定结果表明，实验编号为1ey61-002，1ey61-003，1ey61-004，1ey61-009，1ey61-011，1ey61-012，1ey61-013，1ey61-014，1ey61-016，1ey61-019，1ey61-022，1ey61-024，1ey61-026，1ey61-029，1ey61-030，1ey61-031，1ey61-032，1ey61-033，1ey61-034，1ey61-035，1ey61-037，1ey61-038，1ey61-040，1ey61-042，1ey61-043，1ey61-047，1ey61-048，1ey61-049，1ey61-051，1ey61-052，1ey61-053，1ey61-055，1ey61-060，1ey61-064，1ey61-065，1ey61-066，1ey61-068，1ey61-074，1ey61-075，1ey61-079，1ey61-085，1ey61-086和1ey61-088为阳性的f1代小鼠，共获得43只发生重组的f1代小鼠。
[0083]
实施例7，获得krt10定点基因敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato小鼠模型。
[0084]
将实施例6获得的f1代小鼠进行基因型鉴定，同时采用southernblot排除随机插入，鉴定结果显示为正确重组的即为在krt10启动子后面定点敲入p2a-crepr1-t2a-tdtomato的小鼠，得到所述小鼠模型。所述southernblot的酶切位点为ncoi和econi。3’probe如seqidno.17所示，用于检测是否发生正确重组，若发生正确重组，将会出现野生型和突变型两个条带；若未正确重组，将只会出现野生型条带。creprobe如seqidno.18所示，用于检测是否含有随机插入，若发生正确重组，将只会出现目的条带；若存在随机插入，将会出现多个条带。southehernblot检测结果如图10(a)、图10(b)、图10(c)所示，实验编号为1ey61-002、1ey61-003、1ey61-004、1ey61-009、1ey61-011和1ey61-012的为阳性的f1代小鼠(有随机插入)；实验编号为1ey61-068、1ey61-085、1ey61-086、1ey61-074、1ey61-075、1ey61-079和1ey61-088为阳性的f1代小鼠。
[0085]
实施例8，小鼠模型诱导试验。
[0086]
将实施例7所得小鼠模型与mt/mg等追踪体系相关小鼠交配后，可得到krt10-crepgr-tdtomato；mt/mg小鼠，经ru486诱导后特异追踪krt10

细胞的变化。将小鼠模型与floxed小鼠杂交后，得到krt10-pr1-cre

；tg
f/
的f2代小鼠，然后将该小鼠相互近交获得基因型为krt10-pr1-cre

；tg
f/f
的f3代小鼠，经ru486诱导后特异敲除krt10

细胞中的tg
f/f
基因。将小鼠模型与条件性过表达转基因小鼠交配后，得到krt10-pr1-cre

；tg
δ/
的f2代小鼠，经ru486诱导后可特异性过表达krt10

细胞中的目的基因。给予诱导为给予米非司酮(ru486)诱导，所述ru486的用量为0.1mg/g，连续给药5天。
[0087]
试验结果如图11和12所示。图11(a)为小鼠模型背部荧光图，图11(b)为新生鼠背
部免疫荧光染色图，蓝色为dapi，染的是细胞核；红色为tdtomato，是所述小鼠模型自带的红色荧光；绿色染的是krt14的抗体，是表皮基底层干细胞的标志物，所述krt14抗体的品牌是biolegend，所用比例为1:100，货号是906001。所述图12中，蓝色为dapi，染的是细胞核；绿色为“mg”，代表的是追踪krt10

细胞；红色为“mt”，染的是细胞膜，粉色的是krt14，是基底层干细胞的标志物。
[0088]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。