一种小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物学和肿瘤学技术领域，具体涉及一种基于3d培养条件下温石棉诱导的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株及其应用。


背景技术：

2.致癌是一种后果严重的毒性效应，因此化学物的致癌作用评估是一项极其重要、慎重而又复杂的工作，评价化学物对人类致癌性的方法，目前有人群流行病学调查、哺乳动物长期致癌实验、体外实验三种。在长期动物实验前，可先进行致突变实验、细胞恶性转化实验和哺乳动物短期致癌实验来对化学物致癌性进行初步推测和筛检，其中以细胞恶性转化实验应用最为广泛。
3.细胞恶性转化后将形成与肿瘤相关的表型改变，包括细胞形态、细胞生长能力、生化表型等变化，以及移植于动物体内形成肿瘤的能力。通过细胞形态及细胞生长排列的观察、细胞增殖的检测、以及锚着不依赖性的检测等实验，可以评价恶性转化结局，其中锚着不依赖性即软琼脂集落形成实验是目前公认的验证细胞恶性转化是否成功较为可靠的指标。
4.石棉是天然的纤维状的硅酸盐类矿物质的总称，具有高抗张强度、高挠性、耐化学和热侵蚀、电绝缘和具有可纺性。石棉主要包括青石棉、温石棉、铁石棉等。国际癌症研究机构(iarc)已将所有类型的石棉定为ⅰ类致癌物，即所有类型的石棉都可导致恶性肿瘤的发生。
5.细胞恶性转化模型不仅是极好的研究致癌物致癌机制的材料，还可以用于恶性肿瘤诊断与治疗的基础研究。现有报道提供了多种温石棉2d水平诱导细胞恶性转化的方法，如yang h等用温石棉诱导了间皮细胞的恶性转化，其具体方法是：将间皮细胞hm与巨噬细胞共培养，用10ng/ml的tnf-α进行预处理后加入5μg/cm2的温石棉处理48小时，然后持续用含tnf-α的培养液进行培养4周，结果可见细胞聚集灶(foci)形成(tnf-alpha inhibits asbestos-induced cytotoxicity via a nf-kappab-dependent pathway,a possible mechanism for asbestos-induced oncogenesi)。该方法在转化过程中，采用了与巨噬细胞共培养的技术，并加入了tnf-α减少温石棉的毒性；但是该报道仅检测了在培养板中培养细胞的foci形成，并未经软琼脂集落形成实验验证转化细胞的锚着不依赖性生长，无法证明已成功转化。类似的报道还有温石棉诱导的人支气管上皮细胞的恶性转化，青石棉诱导的间皮细胞的恶性转化。
6.以往细胞恶性转化试验多采用二维单层细胞培养，但在二维培养体系中，肿瘤细胞在固体培养板表面贴壁呈单层生长，约50％的表面积与培养板接触、其余50％的表面积与培养基接触，仅有很少部分与其他细胞或基质接触。研究表明，体内肿瘤微环境在肿瘤细胞的增殖、分化、转移和耐药等方面发挥重要作用，而二维培养体系缺乏体内肿瘤微环境下细胞-细胞间、细胞-细胞外基质间的动态相互作用，不能准确反映体内肿瘤真实的生长情况。
7.近年来发展起来的三维细胞培养(three-dimensionalcell culture，3dcc)技术可以弥补上述缺点，目前未见应用三维培养技术进行温石棉诱导细胞恶性转化的报道。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于构建一种具有与体内肿瘤相似形态学和细胞生物学特性的温石棉诱导的细胞恶性转化模型。
9.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.本发明采用温石棉对3d培养条件下的小鼠胚胎成纤维细胞(nih/3t3)进行低剂量长期间断染毒以及染毒后撤离温石棉处理继续培养的方法，获得了一株发生恶性转化的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株，相较原始nih/3t3细胞，该细胞呈现出叠层生长及锚着不依赖性生长特性。该转化株于2021年7月7日保藏于位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctcc no：c2021138，分类命名为：小鼠胚胎成纤维细胞系nih3t3/3as-t。
11.三维细胞培养(3dcc)模拟了体内肿瘤细胞生长的微环境，三维培养条件下细胞几乎100％表面积都与其他细胞或基质接触，所培养的细胞具有特征性生物信号转导，可以影响细胞增殖、黏附、迁移和基因表达等功能，克服传统2d培养系统因无法模拟体内的结构组织和连接，导致细胞形态、存活力、增殖、分化、基因和蛋白表达、对刺激的反应、药物代谢及普通细胞功能性受到限制或减弱等问题。
12.本发明还提供了上述的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株的子代细胞。研究表明，传代后的子代细胞保留了所述小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株的细胞生物学特性。
13.进一步的，本发明提供了所述的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株在作为石棉致癌机制研究的细胞模型中的应用。所述石棉为温石棉。
14.本发明还提供了所述的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株在提取纤维瘤特异性肿瘤标志物中的应用。分析小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株中存在的特异性物质，有望将其开发成用于诊断温石棉所致的纤维瘤的肿瘤标志物，进而应用到纤维肉瘤检测试剂盒的开发。
15.本发明还提供了所述的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株在筛选或评估治疗纤维瘤药物中的应用。以所述小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株作为药物作用载体，来筛选对纤维瘤有治疗作用的化合物，或评估化合物对治疗纤维瘤的药效。
16.进一步的，本发明还提供了一种3d培养条件下温石棉诱导小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化的方法，包括以下步骤：
17.(1)将对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3消化后用完全培养基重悬，得到密度为1～2
×
106个细胞/ml的单细胞悬液，再在冰浴下，将单细胞悬液和matrigel基质胶等体积混合，铺入细胞培养板中，37℃孵育30～45分钟后，加入完全培养基培养20～24h；
18.(2)弃去培养基，加入1.0～1.5μg/ml的温石棉溶液处理48h后，换成完全培养基继续培养7天；
19.(3)再重复步骤(2)两次；
20.(4)收集细胞，筛选获得发生恶性转化的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株。
21.优选的，所述单细胞悬液的密度为1
×
106个细胞/ml，温石棉溶液处理的浓度为
1.25μg/ml。所述温石棉溶液的稀释剂为磷酸缓冲液。
22.本发明具备的有益效果：
23.本发明提供的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株是在3d培养条件下由小鼠胚胎成纤维细胞经温石棉多阶段多次染毒处理后，发生恶性转化获得。3dcc模拟了体内肿瘤细胞生长的微环境，构建的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化株具有与体内肿瘤细胞相似的形态学和细胞生物学特性，在作为致癌物致癌机制研究的细胞模型等多个方面具有良好的应用前景。
附图说明
24.图1为3d-ct和3d-石棉细胞活性试验(od值)检测结果图。其中，石棉为温石棉(asb)；3d-ct表示3d培养条件下的对照细胞nih/3t3；3d-石棉表示3d培养条件下的温石棉转化的nih/3t3细胞，同下图的3d-asb。
25.图2为细胞锚着不依赖性生长实验检测结果图，其中，(a)为3d-ct细胞和3d-asb细胞实物图，(b)为两种细胞的统计结果,**表示p《0.01。
26.图3为3d-ct和3d-asb细胞的划痕试验结果比对图，其中，(a)为划痕试验照片，(b)为统计结果，****表示p《0.0001。
27.图4为3d-ct和3d-asb细胞侵袭试验结果统计图，其中，(a)为镜下细胞照片，(b)为统计结果，**表示p《0.01。
28.图5为3d-ct和3d-asb细胞迁移试验结果统计图，其中，(a)为镜下细胞照片，(b)为统计结果，****表示p《0.0001。
29.图6为流式细胞仪检测3d-ct和3d-asb细胞凋亡变化统计结果图，**表示p《0.01。
30.图7为流式细胞仪检测3d-ct和3d-asb细胞周期变化统计结果图。
31.图8为3d-ct和3d-asb裸鼠成瘤试验结果统计图。
32.图9为2d-asb和3d-asb裸鼠成瘤试验结果统计图。
33.图10为3d-ct和3d-asb裸鼠成瘤病理观察图。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。
35.若无特别说明，实施例中采用的实验方法为本领域常用技术手段；若无特别说明，实施例中采用的原料、试剂均为市售商品。
36.小鼠胚胎成纤维细胞(nih/3t3)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
37.实施例1
38.纤维制备：温石棉来自日本矿物纤维协会。使用时称取5mg温石棉纤维悬于1ml pbs液中，配成5mg/ml的母液，在冰水中超声处理成为均匀的悬浮液。超声条件：180w，10s开，5s关，共30个循环。超声后高压灭菌。
39.细胞培养：小鼠胚胎成纤维细胞(nih/3t3)用含10％胎牛血清的dmem培养液，在37℃、5％co2饱和湿度的环境中培养，细胞每3-4天传代1次，按1:3接种。细胞分为转化组和阴性对照组，每组各设3孔做平行对照。
40.3d条件下石棉诱导的细胞转化：实验前1天，将matrigel基质胶放入4℃冰箱过夜。实验当天，胰蛋白酶消化nih/3t3细胞，制成单细胞悬液，1000r离心5分钟。用完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为1
×
106细胞/ml。将100μl细胞悬液与100μl基质胶混合(细胞悬液与基质胶的比例为1:1，v/v)铺入24孔板中。以上操作均置于冰上进行。将孔板置于37℃恒温箱中孵育30-45分钟后，在每孔中加入500μl完全培养基。细胞接种后24h，弃去旧培养液，转化组加入用pbs稀释的1.25μg/ml温石棉，对照组加入同等体积的pbs，每组设三个平行样。48h后换正常培养基继续培养，7天后换液，继续用温石棉处理48h后换新鲜培养基，再7天后换液，再7天，即共21天后收集细胞。经2次染毒的实验方法对nih/3t3细胞进行恶性转化后，收获了一株细胞3d-asb。于2021年7月7日保藏于位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctccno:c2021138。分类命名为：小鼠胚胎成纤维细胞系nih3t3/3as-t。
41.实施例2
42.cck8试验测细胞活性。
43.细胞弃去培养基，每孔加入110μl cck-8试剂与培养液的混合液(体积比为1:10)，37℃、5％co2培养箱中继续孵育3h后，在450nm波长下，酶标仪检测每孔od值，根据od值计算细胞活性。公式为[(odas-odab)/(odac-odab)]
×
100％。其中，odas、odac、odab分别表示实验组、对照组和空白组的od值。结果见图1，3d-asb细胞活性高于对照组，但没有统计学意义。
[0044]
实施例3
[0045]
软琼脂克隆形成实验测转化细胞的恶性细胞生物学特性。
[0046]
取消化下来的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，并进行细胞计数，用含20％胎牛血清的dmem培养液调整细胞密度至1000个/ml。用蒸馏水分别制备出1.2％和0.6％两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃。按1:1比例使1.2％的琼脂糖和2
×
dmem培养基(含有2
×
抗生素和20％的小牛血清)混合后，取1.5ml混合液注入6孔板中，冷却凝固，可作底层琼脂置co2温箱中备用。按1:1比例使0.6％的琼脂糖和2
×
dmem培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2ml的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2％琼脂糖底层的6孔板中(即每孔接入200个细胞)，遂形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃5％co2温箱中培养10～14天。隔天补加200μl dmem完全培养基，以防止过于干燥。当出现克隆时，每孔加入1ml 0.005％结晶紫染液染色1h以上。用pbs清洗，计数，计算：克隆形成率＝克隆数/接种细胞数*100％。
[0047]
如图2所示，3d-asb组的细胞呈现出叠层生长及锚着不依赖性生长特性，表明成功获得恶性转化细胞模型。
[0048]
实施例4
[0049]
划痕试验检测细胞运动转移的能力。
[0050]
用marker笔在6孔板背后，用直尺比着均匀划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。将细胞以6
×
105个/孔接种于6孔板中，37℃、5％co2培养箱中培养过夜。第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕。用pbs清洗细胞3次，去除划落细胞，加入无血清培养基继续培养，0、12、24、48h在100倍镜下拍照处理。
[0051]
结果如图3所示，3d-asb组细胞迁移速度明显比3d-ct组细胞快(p《0.001)。
[0052]
实施例5
[0053]
transwell法检测细胞侵袭和迁移能力。
[0054]
在transwell上室加入80μl matrigel(4μg/ul)。置37℃30min使matrigel聚合成凝胶；胰酶消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用pbs洗1遍，用含0.5％bsa的无血清培养液重悬，调整细胞浓度至5*104/ml；取细胞悬液200μl加入transwell上室，下室加入500μl含10％fbs的培养液；培养箱中孵育24h后，取出transwell上室，弃去孔中培养液，用棉签轻轻擦掉上层未穿过膜的细胞。pbs洗2遍，4％多聚甲醛溶液4度固定15分钟，将小室适当风干；0.1％结晶紫染色20min，用pbs洗3遍；将小室倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥；200倍显微镜下随机3个视野观察细胞，计数。
[0055]
结果表明，如图4所示，在3d培养条件下，经石棉转化的nih/3t3细胞的侵袭能力增强(p《0.01)。
[0056]
如图5所示，在3d培养条件下，经石棉转化的nih/3t3细胞的迁移能力增强(p《0.0001)。
[0057]
实施例6
[0058]
流式细胞仪检测细胞凋亡改变。
[0059]
细胞经传代培养至单层铺满，胰酶消化后收集于离心管中，1000g离心5min，弃培养液；pbs悬浮洗涤细胞，1000g、5min离心细胞；500μl的结合缓冲液悬浮细胞，加入annexin v-fitc/pi 15μl，室温放置5min；进行流式细胞仪分析。
[0060]
结果如图6所示，与3d-ct细胞相比，经石棉转化的3d-asb细胞出现耐凋亡特性，细胞凋亡显著减少(p《0.01)。
[0061]
实施例7
[0062]
流式细胞仪检测细胞周期变化。
[0063]
细胞经传代培养至单层铺满，胰酶消化后收集于离心管中，1000g离心5min；pbs悬浮洗涤细胞2次，1000g、5min离心后收集；再用0.3ml pbs重新充分悬浮细胞，避免细胞有结团现象；以终浓度70-75％比例加入预冷的纯乙醇，固定至少2h；1000g离心5min，弃去乙醇；1ml pbs悬浮清洗细胞沉淀，放置1min，1000g离心5min；用500μl pi/triton x-100染液悬浮细胞沉淀，37℃放置15min后使用流式细胞仪进行检测。
[0064]
结果如图7所示，相比对照组3d-ct细胞，石棉转化细胞3d-asb g1期比例增加，s m期比例缩短，说明石棉转化细胞阻滞在g1期的比例增加。
[0065]
实施例8
[0066]
裸鼠皮下荷瘤实验：取处于对数生长期的细胞，细胞达80-90％左右密度为宜。收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。胰酶消化细胞后用预冷的pbs洗两遍，用pbs吹打细胞沉淀，调整细胞浓度为1
×
107/ml，皮下瘤接种的细胞量为1
×
106个细胞/支，接种体积为0.1ml。细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下，半小时内完成，途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢。选择6周龄裸鼠，体重18-20g左右。4周后取瘤，福尔马林固定用做he染色。游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位，v＝1/2ab2(a为长径，b为短径)，
[0067]
结果如图8，图9所示，3d-asb细胞裸鼠成瘤体积比对照组3d-ct的小，而比2d培养的石棉转化细胞裸鼠成瘤体积大。
[0068]
裸鼠成瘤的瘤组织病理观察结果如图10所示，3d-ct：镜下可见组织中间大量中性
坏死细胞伴出血，周围是梭形成纤维细胞，分界明显。3d-asb：镜下可见组织内梭形成纤维细胞杂乱无章，中间夹杂着大量低分化细胞，核分裂像多，异型性明显。