一株具有异养硝化-好氧反硝化功能的全海假单胞菌及其应用的制作方法

no:61718，保藏日期为2021年06月10日，保藏位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。
7.上述具有异养硝化
‑
好氧反硝化功能的全海假单胞菌在含氮污水脱氮处理中的应用，优选包括如下步骤：在含氮污水中接种上述具有异养硝化
‑
好氧反硝化功能的全海假单胞菌，进行培养，得到脱氮后的废水。
8.所述的含氮污水优选为水产养殖尾水。
9.所述的培养中的碳源为柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠中的至少一种；优选为柠檬酸钠。
10.所述的培养中的污水c/n为10～40，较优条件为c/n＝10。
11.所述培养中的污水ph值为6～7，优选为ph＝7。
12.所述培养中的温度为15℃～35℃，较优条件为t＝25～35℃。
13.上述培养的条件，是通过对含氮污水的碳源、c/n、ph值调整得到。
14.现有技术相比，本发明的有益效果表现为：
15.1、本发明的全海假单胞菌wm33应用于含氮水产养殖尾水处理领域，对水产养殖对象无不良影响，具有较高的水生生物生物安全性；并且对诺氟沙星、链霉素、盐酸四环素等多种临床常用抗生素表现为敏感，生态安全性较高。因此适宜在大多数的养殖水体应用。
16.2、本发明的全海假单胞菌wm33同时具有异养硝化和好氧反硝化功能；可利用多种有机碳源的同时对高浓度的有机碳有很强的耐受性，具有较好的水体有机碳去除能力。该菌株尤其适合于高c/n的含氮污水的处理。
17.3、本发明的全海假单胞菌wm33应用于含氮污水处理领域，在完全好氧的条件下，该菌株可分别利用以及作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮；其降解效率达到最高分别可达76.0％、92.1％和88.0％。
18.4、本发明的全海假单胞菌wm33能克服不同需氧量引起的硝化反硝化不相容问题，使硝化和反硝化作用在同一好氧反应器内同步进行成为可能。将该菌株运用于水产养殖水体的微生物脱氮工艺，有利于减少设备占地面积和建设成本，提高处理效率，还能大幅减少水产养殖过程中的周期性换水，具有良好的经济及环保效益，应用前景广阔。
附图说明
19.图1为本发明的全海假单胞菌wm33在营养琼脂平板上的菌落形态图。
20.图2为本发明的全海假单胞菌wm33的扫描电镜图及菌体大小统计结果图。
21.图3为本发明的全海假单胞菌wm33的革兰氏染色结果图。
22.图4为本发明的全海假单胞菌wm33的鱼类毒性试验结果图。
23.图5为本发明的全海假单胞菌wm33的常用抗生素耐药性实验结果图。
24.图6为本发明的全海假单胞菌wm33在不同有机碳源和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图。
25.图7为本发明的全海假单胞菌wm33在不同ph和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图。图8为本发明的全海假单胞菌wm33在不同c/n和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图。
26.图9为本发明的全海假单胞菌wm33在不同温度和不同无机氮源条件下的生长情况
和脱氮效果对比结果图。
具体实施方式
27.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
28.实验中三种氮元素的测定与分析方法均参考于国标，其中的测定与分析根据《水质
‑
氨氮的测定
‑
纳氏试剂分光光度法》(gb hj535
‑
2009)；的测定与分析根据《水质
‑
硝酸盐氮的测定
‑
紫外分光光度法》(gb hj/t346
‑
2007)；的测定与分析根据《水质
‑
亚硝酸盐氮的测定
‑
分光光度法》(gb 7493
‑
87)。
29.实验所用到的基础培养基使用121℃，20min高压蒸汽灭菌，其配方如下：
30.(1)微量元素溶液(g/l)：edta 50g，znso4·
7h2o 5.02g，cuso4·
5h2o 1.57g，feso4·
7h2o 5.0g，cocl2·
6h2o 1.61g，(nh4)6mo7o2·
4h2o 1.1g，cacl2·
2h2o 5.5g，mncl2·
4h2o 5.06g，ph 6.0；
31.(2)富集培养基(g/l)：kh2po
4 1.5g，mgso4·
7h2o 0.01g，na2hpo
4 7.9g，二水柠檬酸钠6.45g，nano
3 0.8415g，nh4cl 0.192g，nano
2 0.362g，微量元素溶液2ml，ph 7.2；
32.(3)btb固体培养基(g/l)：二水柠檬酸钠6.45g，1％btb(溴麝香草酚蓝)乙醇溶液1ml，kh2po
4 1.5g，mgso4·
7h2o 0.01g，na2hpo
4 7.9g，nano
3 0.8415g，nh4cl 0.192g，nano
2 0.362g，微量元素溶液2ml，琼脂20g，ph 7.0～7.5；
33.(4)单一氮源发酵培养基(dmⅰ)(g/l)：二水柠檬酸钠6.45g，kh2po
4 1.5g，mgso4·
7h2o 0.01g，na2hpo
4 7.9g，nh4cl 0.6036g，微量元素溶液2ml，ph 7.0；
34.(5)单一氮源发酵培养基(dmⅱ)(g/l)：二水柠檬酸钠6.45g，mgso4·
7h2o 0.01g，kh2po
4 1.5g，na2hpo
4 7.9g，nano
3 0.9590g，微量元素溶液2ml，ph 7.0；
35.(6)单一氮源发酵培养基(dmⅲ)(g/l)：二水柠檬酸钠6.45g，kh2po
4 1.5g，mgso4·
7h2o 0.01g，na2hpo
4 7.9g，nano
2 0.375g，微量元素溶液2ml，ph 7.0。
36.实施例1
37.(1)样品采集
38.本发明的全海假单胞菌wm33从广东省佛山市(北纬n:22
°
50
′
34
″
、东经e:113
°
57
′
25
″
)罗非鱼养殖池塘的水样以及泥样筛选分离得到。
39.样品采集根据《土壤环境监测技术规范》(hj/t 166
‑
2004)中的“混合样品采集方法”，采用梅花点采样法定点取样，从养殖池塘中采集表层、中层以及深层水体和底泥于无菌采样袋中，4℃冷藏运输储藏备用。
40.(2)异养硝化
‑
好氧反硝化菌株富集、分离与筛选
41.1)样品预处理：取池塘底泥10g，在超净工作台内接入装有90ml浓度为质量百分比0.9％的无菌生理盐水的300ml大口三角烧瓶中，并放入少许经过121℃高压蒸汽灭菌15min的玻璃珠，180r/min振荡1h以打散底泥样品，使泥样中的微生物充分悬浮于生理盐水中。
42.2)富集培养：取22.2ml上述底泥预处理混合液体加入到装有200ml富集培养基的500ml锥形瓶中，摇床内30℃、180r/min培养2～3天。每天向富集培养基中加入1ml浓度为质量百分比5％的nh4cl溶液以保持培养基内离子浓度。取养殖水样10ml接种于含90ml
富集培养基的300ml大口三角烧瓶中，摇床内30℃、180r/min振荡1h。
43.3)样品平板涂布：分别取步骤1)中经过预处理的底泥混合液体以及表层、中层以及深层水样1ml，于超净工作台内接入装有9ml无菌生理盐水的试管中，移液枪轻轻吹打或震荡混匀。从该试管取出1ml液体接入到新的装有9ml无菌生理盐水的试管中，重复该操作，依次把经预处理的底泥混合液体和水样原液梯度稀释为10
‑2～10
‑4浓度。分别取10
‑1～10
‑4浓度梯度的底泥和水样的原液100μl～200μl，直接涂布于btb平板培养基中，每个梯度设置3个平行组，1个空白对照组，在恒温生化培养箱中30℃倒置培养2～3天。
44.4)样品富集液平板涂布：将步骤2)富集培养后的菌悬液梯度稀释，过程如下：从步骤2)中的锥形瓶中取1ml菌悬液接入装有9ml无菌生理盐水的试管中，充分混匀，即稀释浓度为10
‑1。再从此试管中吸取1ml液体接入到新的装有9ml无菌生理盐水的试管中混匀，重复此步骤，依次稀释达到10
‑2～10
‑8浓度梯度。然后从每个浓度梯度的混合液中各取100μl～200μl，分别涂布于提前制作好的btb固体平板培养基上，标明稀释梯度与日期，在生化培养箱中30℃倒置培养2～3天。
45.5)分离纯化：用接种环挑取上述培养基上不同形态的菌落。采用平板划线分离法在btb固体平板培养基上划线进行分离纯化，划线后平板于超净工作台内敞小口正置于室温下5分钟后倒置于恒温生化培养箱内30℃培养2～3天。重复此步骤，挑取单菌落反复划线纯化3～4次。观察没有形态异常菌落后挑取单菌落经过结晶紫单染色后于显微镜下镜检验纯(100倍油镜)；
46.6)点接初筛：使用接种针挑取纯化后菌株点接于btb反硝化鉴定培养基(btb固体平板培养基)中培养2～3天。根据菌落生长情况和菌落周围btb培养基中蓝色晕圈大小挑选出反硝化能力高的菌株，通常来说蓝色晕圈越大，反硝化能力越高。并分别接种于营养琼脂斜面30℃恒温培养2～3天后试管置于4℃保藏。
47.7)硝化与反硝化性能复筛：用接种环取上述得到的菌株3环活化斜面接种于营养肉汤中，摇床30℃、180r/min培养1天，测定其od
600
。再以1％(v/v)的接种量分别接种至以nh4cl、nano3以及nano2作为唯一无机氮源的dmⅰ、dmⅱ以及dmⅲ发酵培养基中，30℃、180r/min震荡培养，0h、24h、48h取培养液测其od
600
，5000r/min、5min低速离心后取上清液，分别测定三种氮元素含量。
48.(3)鉴定
49.1)形态和生理生化特征鉴定
50.经过上述筛选分离后得到一株异养硝化
‑
好氧反硝化的菌株wm33，菌落(如图1所示)在营养琼脂上为白色不透明，表面隆起，呈圆形、光滑湿润而有闪光，边缘完整；该菌株菌体长为1.43
±
0.28μm，宽为0.54
±
0.04μm，直杆状，无鞭毛(如图2所示)；为革兰氏反应阴性(如图3所示)。测定其生理生化特征，测定结果如表1所示。
51.表1 菌株wm33生理生化特征
[0052][0053]
注：“ ”为阳性；
“‑”
为阴性
[0054]
2)通过分子生物学方法对异养硝化
‑
好氧反硝化菌株wm33鉴定
[0055]
菌株wm33的dna提取采用takara lysis buffer for microorganism to direct pcr裂解酶。以提取得到的dna为模板扩增其16s rdna，扩增采用一对通用引物(由上海生物工程有限公司合成)：上游引物(27f)：5'
‑
agagtttgatcctggctcag
‑
3'；下游引物(1492r)：5'
‑
ggctaccttgttacgactt
‑
3'。pcr反应体系(25μl)：2
×
unique
tm taq master mix(with dye)12.5μl，浓度为10μm的上游引物和下游引物各1μl，dna模板1μl(约50
‑
200ng)，ddh2o 9.5μl。pcr程序如下：94℃5min；94℃1min、55℃1min、72℃1.5min，30个循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳分析结果。pcr产物测序由上海生物工程有限公司完成。
[0056]
菌株wm33的16s rdna序列长度为1441bp，核苷酸序列如下：
[0057]
ggcatggcggcagctacacatgcaagtcgagcggatgacgggagcttgctccttgattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgttccgaaaggggcgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagtgggggatcttcggacctcacgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcgagctagagtatggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggaatccttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatgcagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcga
ctgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggacggtaccacggtggatcagtgc。
[0058]
综合其16s rdna、细菌形态、菌落形态以及生理生化等各项鉴定项目，判断菌株wm33为全海假单胞菌(pseudomonas perfectomarina)。查阅相关资料发现尚无以全海假单胞菌(pseudomonas perfectomarina)净化养殖尾水或其他含氮污水中无机氮的相关报道。该菌株已于2021年06月10日保藏位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61718。
[0059]
实施例2
[0060]
全海假单胞菌wm33环境安全评价
[0061]
(1)鱼类毒性试验：选取体长在3
±
1cm范围内，健康的斑马鱼(danio rerio)(购置于广东省广州市荔湾区芳村花地湾的广州花地湾花鸟鱼虫批发市场)，于持续曝气的大水体中暂养30～45天，期间正常喂食与定期换水。状态稳定后随机分配到15l玻璃缸中，设置加入菌液的实验组和加入等体积无菌水的对照组，每个实验组30条斑马鱼，每组设置3个重复。取过夜培养的菌液，3000r/min、5min离心后弃上清，用无菌pbs缓冲液重悬，重复1～2次后用灭菌水悬浮，稀释后得到不同浓度的菌液测定其菌浓度和od
600
，并建立菌浓度和吸光度之间的标准曲线，根据测定的标准曲线得到od
600
与菌浓度之间的关系，调节实验水体中菌量约为1
×
106cfu/ml，空白对照组则加入等量的灭菌水。实验期间，实验对象正常喂养且每三天对实验水体进行完全更换，换水后重复上述方法分别加入菌液和灭菌水，记录下每个组斑马鱼存活率，实验持续10d。
[0062]
(2)常用抗生素耐药性实验：抗生素耐药性实验(抗生素纸片药敏试验)评判标准根据《抗菌药物敏感性试验的技术要求》(ws/t 639
‑
2018)(见表2)，实验方法依据上述标准中的“纸片扩散法”要求进行。具体步骤如下：
[0063]
a)配制mha(广东环凯微生物科技有限公司)平板，校正ph 7.2～7.4；
[0064]
b)使用打孔器和定性滤纸打出直径约6mm的纸片，灭菌后干燥备用；
[0065]
c)根据抗菌药物种类制作对应药物含量的纸片；
[0066]
d)取菌株分别接种于营养肉汤培养基中，30℃、180r/min培养至对数期；
[0067]
e)取100～150μl菌液在mha平板上均匀涂布，室温干燥5min；
[0068]
f)用无菌镊子将含有抗生素的纸片贴于mha平板中央，每个实验重复3次，另设置3个含有无菌水的纸片贴于mha平板中央作为空白对照；
[0069]
g)15min内倒置平板，于30℃恒温培养18h；
[0070]
h)使用ip54金属壳数显游标卡尺(永康市晶思达贸易有限公司)测量抑菌圈直径。
[0071]
表2 抗生素耐受性评判标准
[0072][0073]
(3)结果
[0074]
鱼类毒性试验中，在正常条件下养殖10天，对照组斑马鱼存活率为100％，实验组含菌量约为106cfu/ml，高于常见病原菌的致病剂量(104cfu/ml)。实验组斑马鱼存活率高于99％，与对照组无显著差异(p>0.05)。初步判断全海假单胞菌wm33具有较高的水生生物生物安全性(见图4)。
[0075]
菌株wm33抗生素耐药性实验结果显示(见表3和图5)，全海假单胞菌wm33对所使用的多种常见临床抗生素皆表现为敏感(图5)，表明其生态安全性较高。实验同时为做好菌株使用环节中的防范和应急措施提供指导。
[0076]
表3 抗生素耐药性实验
[0077]
抗生素种类抑菌环大小(mm)敏感种类诺氟沙星34.67
±
1.53s氯霉素0r硫酸庆大霉素20.33
±
1.53s盐酸四环素26
±
1s环丙沙星37.33
±
0.58s头孢他啶18.67
±
3.21i左氧氟沙星25
±
1s链霉素15
±
1s
[0078]
实施例3
[0079]
全海假单胞菌wm33最优生长及脱氮条件
[0080]
(1)不同有机碳源对全海假单胞菌wm33生长及脱氮性能影响
[0081]
选择草酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠以及柠檬酸钠四种碳源，固定c/n＝10，30℃、180r/min、ph＝7.0等培养条件。以dm发酵培养基(见本发明具体实施方式)为基础，草酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠四种有机碳源每升培养基加入量分别为0.67g、0.81g、0.41g、1.29g；作为单一无机氮源的nh4cl(dmⅰ)、nano3(dmⅱ)、nano2(dmⅲ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃、180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入不同有机碳源的上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h取培养液测定其od
600
，5000r/min、5～10min低速离心后取上清分
别测定三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析选择草酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠以及柠檬酸钠四种不同的有机碳源对全海假单胞菌wm33生长情况及好氧反硝化作用的影响。
[0082]
(2)不同c/n对全海假单胞菌wm33生长及脱氮性能影响
[0083]
选择柠檬酸钠作为反硝化培养基碳源，固定30℃、180r/min、ph＝7.0等培养条件，设置c/n梯度为10、20、30、40。每种梯度的培养基柠檬酸钠加入量为1.29g/l、2.58g/l、3.87g/l、5.16g/l；作为单一无机氮源的nh4cl(dmⅰ)、nano3(dmⅱ)、nano2(dmⅲ)，每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃、180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h取培养液测定其od
600
，5000r/min、5～10min低速离心后取上清分别测定三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析10、20、30、40四种不同的c/n对全海假单胞菌wm33生长情况及好氧反硝化作用的影响。
[0084]
(3)不同ph对全海假单胞菌wm33生长及脱氮性能影响
[0085]
固定c/n＝10，30℃、180r/min、柠檬酸钠为单一有机碳源等培养条件，设置ph梯度为5、6、7、8、9。作为单一无机氮源的nh4cl(dmⅰ)、nano3(dmⅱ)、nano2(dmⅲ)，每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃、180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h取培养液测定其od
600
，5000r/min、5～10min低速离心后取上清分别测定三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析5、6、7、8、9五种不同的ph对全海假单胞菌wm33生长情况及好氧反硝化作用的影响。
[0086]
(4)不同温度对全海假单胞菌wm33生长及脱氮性能影响
[0087]
固定c/n＝10、ph＝7.0、180r/min、柠檬酸钠为单一有机碳源等培养条件，设置温度梯度为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃。作为单一无机氮源的nh4cl(dmⅰ)、nano3(dmⅱ)、nano2(dmⅲ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃、180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h取培养液测定其od
600
，5000r/min、5～10min低速离心后取上清分别测定三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析15℃、20℃、25℃、30℃、35℃五种不同的温度对全海假单胞菌wm33生长情况及好氧反硝化作用的影响。
[0088]
通过实施例2(图6)和实施例1(表1)可以看出，全海假单胞菌wm33能够用柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠等多种有机碳源生长。利用琥珀酸钠和乙酸钠生长时，平台期的最大生物量不如柠檬酸钠高。最适宜的生长和脱氮的ph为6
‑
7(图7)；在c/n为10
‑
40范围内皆能生长且降解三种无机氮，随着c/n条件在10
‑
40的范围内递增，全海假单胞菌wm33对于的降解能力逐步受到抑制(图8)；温度梯度实验表明，全海假单胞菌wm33在t＝25
‑
35℃时的生长速度和无机氮降解效率明显要大于t＝15
‑
20℃(图9)全海假单胞菌wm33在c/n为10～40、ph为6～7、温度为15℃～35℃下都能生长，c/n、温度适应范围较大。15℃下生长
速度减缓。在10～40范围内，c/n越高，对其硝酸盐利用的抑制作用逐步提高。ph＝5、15℃～20℃时生长缓慢。c/n大于20时不影响其生长却能抑制其对硝酸盐的降解。综上所述，全海假单胞菌wm33最佳脱氮条件为碳源使用柠檬酸钠、c/n＝10、ph＝7、t＝35℃。降解率最高可分别达到76.0％、92.1％、88.0％。
[0089]
本发明的全海假单胞菌wm33应用于含氮水产养殖尾水处理领域，对水产养殖对象无不良影响，具有较高的水生生物生物安全性；并且对多种临床常用抗生素表现为敏感，生态安全性较高。因此适宜在大多数的养殖水体应用；其同时具有异养硝化和好氧反硝化功能；可利用多种有机碳源的同时对高浓度的有机碳有很强的耐受性，具有较好的水体有机碳去除能力。该菌株尤其适合于高c/n的含氮污水的处理；在完全好氧的条件下，该菌株可分别利用和作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮；该菌株能克服不同需氧量引起的硝化反硝化不相容问题，使硝化和反硝化作用在同一好氧反应器内同步进行成为可能，具有良好的经济及环保效益，应用前景广阔。
[0090]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。