用于创伤修复的组合物及其制备方法和应用与流程

1.本技术属于生物医药技术领域。具体而言，本技术涉及用于创伤修复的组合物、其制备方法以及其所述组合物在制备用于修复组织创伤的药物中的用途。


背景技术：

2.创伤修复，特别是皮肤移植后的创伤修复会经历48h的缺血、缺氧阶段。增加创伤修复过程中的早期血管化是改善创伤修复，特别是皮肤创伤修复的关键因素。富血小板血浆(platelet rich plasma,prp)是一种正在研究用于组织愈合的自体全血来源的生物制剂/生物材料。间充质干细胞也已经被证实具有促进血管生成的能力，但其不适合局部使用。
3.因此，需要开发出新的组合物及适宜的剂型来用于受损组织的修复。


技术实现要素：

4.第一方面，本技术提供了一种用于创伤修复的组合物，其包含间充质干细胞和富血小板血浆。
5.在一些优选实施方案中，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
6.在一些实施方案中，所述组合物还包含药用辅料，其中所述药用辅料与间充质干细胞和富血小板血浆一起被配制成药学上可接受的剂型。
7.在一些优选实施方案中，所述剂型为凝胶剂。
8.在一些实施方案中，所述药用辅料为凝血酶。
9.在一些优选实施方案中，所述凝血酶为牛凝血酶。
10.第二方面，本技术提供了制备用于创伤修复的组合物的方法，其包括以下步骤：
11.a.从个体组织分离间充质干细胞，并对其进行扩增；
12.b.分离静脉全血，得到富血小板血浆；
13.c.将步骤a的间充质干细胞和步骤b的富血小板血浆混合；以及任选地，
14.d.向步骤c得到的混合物中加入药用辅料，配制成药学上可接受的剂型，优选地，所述剂型为凝胶剂。
15.在一些实施方案中，所述药用辅料为凝血酶，更优选地，所述凝血酶为牛凝血酶。
16.在一些实施方案中，步骤a中的个体组织为脐带、胎盘、脂肪或牙髓，优选地，所述组织为脂肪组织。
17.在一些实施方案中，在步骤a中，用消化酶从所述组织中分离间充质干细胞，随后将所述间充质干细胞用无血清培养基培养传代，优选地进行4次传代。
18.在一些实施方案中，在步骤b中，所述富血小板血浆是以添加了抗凝剂的静脉全血为原料经过两次离心获得的，优选地所述抗凝剂为枸橼酸钠。
19.第三方面，本技术提供了本技术第一方面所述的组合物在制备用于修复组织创伤的药物中的用途。
20.在一些实施方案中，所述组织为皮肤。在优选的实施方案中，所述药物局部施用于创伤部位。
附图说明
21.图1显示了间充质干细胞的照片。
22.图2显示了prp凝胶(图2a)以及脂肪间充质干细胞和prp的凝胶组合物(图2b)的扫描电子显微镜(sem)照片。箭头指示脂肪间充质干细胞和prp的凝胶组合物。
23.图3显示用含1
×
106个adsc的0.5ml生理盐水(图3a和3b)和1ml prp凝胶(图3c和3d)处理大鼠创伤后，在第0天和第60天时的间充质干细胞在大鼠移植位置的示踪。
24.图4显示用1ml生理盐水(对照)、含1
×
106个adsc的0.5ml生理盐水、1ml prp凝胶和1ml prp adsc的凝胶组合物处理大鼠创伤后，大鼠创伤修复性能的检测结果。图4a和图4b分别显示经以上四种不同处理的创伤皮肤在第0周、第2周、第4周和第8周时测量的收缩％和弹性模量(mpa)。图4c和图4d分别显示在第12周时，对经以上四种不同处理的创伤皮肤进行he染色和masson染色的图片。图4e显示经以上四种不同处理的创伤皮肤在第12周时测量的表皮厚度(μm)。*表示p《0.05。
25.发明详述
26.定义
27.提供以下定义用以更好地说明本技术的内容以及在实践本技术的各项发明中指导本领域普通技术人员。除非另外说明，本技术中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。
28.本文中所用的术语“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”或“包含”可以表示包括或包含没有列出的其他组分或步骤或其他要素，也可以表示仅包括或包含列出的组分或步骤或其他要素。
29.本文中使用的术语“皮肤”是指身体表面的包在肌肉外面的组织，是人的身体器官中最大的器官，覆盖全身，它使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。
30.本文中使用的术语“创伤愈合”是指机体遭受外力作用，皮肤等组织出现离断或缺损后的愈复过程，损伤的程度及组织的再生能力决定修复的方式、愈合的时间及瘢痕的大小。机体的全身和局部因素，均可影响组织的再生修复。
31.本文中使用的术语“皮肤创伤愈合”是指由于遭受外力作用，皮肤组织出现离断或缺损后的愈复过程。
32.本文中使用的术语“富血小板血浆(prp)”是一种正在研究的用于软组织愈合的自体全血来源的生物制剂/生物材料。富血小板血浆中含有大量的血小板，一般为外周血的3倍以上，血小板经活化后能释放出多种细胞因子，如血管内皮生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子(igf)、成纤维细胞生长因子(fgf)等，可以促进细胞增殖、分化、组织修复等。
33.本文中使用的术语“药用辅料”是指在制剂处方设计时，为解决制剂的成型性、有效性、稳定性、安全性加入处方中除主药以外的一切药用物料的统称。
34.本文中使用的术语“间充质干细胞(msc)”是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，并且来源广泛，例如可来源于骨髓、脐带血、脐带组
织、胎盘组织和脂肪组织等。
35.本文中使用的术语“脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，adscs)”是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。
36.本文中使用的术语“消化酶”是一类参与消化的酶的总称。一般消化酶的作用是水解，有的消化酶由消化腺分泌，有的参与细胞内消化。细胞外消化酶中，有以胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、羧肽酶原等一些不活化酶原的形式分泌然后再被活化的。
37.本文中使用的术语“无血清培养基”是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。
38.本文中使用的术语“凝血酶”是一种白色至灰白色非结晶物质，一般为冻干粉。凝血酶为止血药，临床上主要适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管以及实质性脏器出血的止血；用于外伤、手术、口腔、耳、鼻、喉、泌尿、烧伤、骨科、神经外科、眼科、妇产科以及消化道等部位出血的止血。凝血酶直接作用于血液凝固过程的最后一步，促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，从而达到速效止血的目的。凝血酶还能促进上皮细胞的有丝分裂，加速创伤愈合，是一种速效的局部止血药。凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管、实质性脏器的出血及其他各种出血。
39.本文中使用的术语“传代培养”是指需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿(瓶)内，再进行培养的过程。
40.本文中使用的术语“抗凝剂”是一种能够阻止血液凝固的化学试剂或物质，如天然抗凝剂(肝素、水蛭素等)；ca2

螯合剂(柠檬酸钠、氟化钾)等。
41.本文中使用的术语“masson染色”是指用两种或三种阴离子染料混合，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。该染色是用来显示组织中纤维以及炎性因子的染色方法之一。
42.本文中使用的术语“he(hematoxylin-eosin staining)染色”为苏木精-伊红染色，是石蜡切片技术中常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。he染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
具体实施方式
43.应理解，在本技术的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
44.本技术提供了一种用于创伤修复的组合物，其包含间充质干细胞和富血小板血浆。本技术的发明人通过体内实验发现本技术的组合物给药后可以有效地促进损伤部位血管形成能力，从而促进创伤愈合。
45.间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的多种组织中。目前，我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺、牙髓等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞。间充质干细胞有以下三个显著的特点：
46.a.间充质干细胞来源广泛，易于提取，可大量扩增，并且体外培养的间充质干细胞是贴壁生长的；
47.b.间充质干细胞高表达cd73、cd90和cd105，不表达cd31、cd34、cd45、hladr、cd14、cd19和cd11b等标志物；
48.c.在合适的刺激因素下，间充质干细胞能分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等多种组织的细胞。
49.在一些优选实施方案中，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞(adsc)。
50.在一些实施方案中，所述组合物还包含药用辅料，其中所述药用辅料与间充质干细胞和富血小板血浆一起被配制成药学上可接受的剂型。
51.在一些优选实施方案中，所述剂型为凝胶剂。
52.在一些实施方案中，所述药用辅料为凝血酶。
53.在一些优选实施方案中，所述凝血酶为牛凝血酶。
54.本技术还提供了制备用于创伤修复的组合物的方法，其包括以下步骤：
55.a.从个体组织分离间充质干细胞，并对其进行扩增；
56.b.分离静脉全血，得到富血小板血浆；
57.c.将步骤a的间充质干细胞和步骤b的富血小板血浆混合；以及任选地，
58.d.向步骤c得到的混合物中加入药用辅料，配制成药学上可接受的剂型，优选地，所述剂型为凝胶剂。
59.在一些实施方案中，所述药用辅料为凝血酶，更优选地，所述凝血酶为牛凝血酶。
60.在一些实施方案中，步骤a中的个体组织为脐带、胎盘、脂肪或牙髓，优选地，所述组织为脂肪组织。
61.在一些实施方案中，在步骤a中，用消化酶从所述组织中分离间充质干细胞，随后将所述间充质干细胞用无血清培养基培养传代，优选地进行4次传代。
62.在一些实施方案中，在步骤a中，将个体组织剪碎，在37℃下，用消化酶将个体组织消化处理20-40min，以及加入培养基以终止消化反应。
63.在一些实施方案中，在剪碎个体组织之前，用pbs缓冲液清洗所述组织。
64.在一些实施方案中，在步骤a中，将所述间充质干细胞以约8000个/cm2的密度接种在含有无血清培养基的培养瓶中，然后置于37℃和5％co2的饱和湿度细胞培养箱中进行培养，隔天更换所述培养基，培养至约80-90％的融合度时，进行传代。
65.在一些实施方案中，在步骤b中，所述富血小板血浆是以添加了抗凝剂的静脉全血为原料经过两次离心获得的，优选地所述抗凝剂为枸橼酸钠。
66.在一些实施方案中，步骤b包括以下步骤：
67.1)将采集的静脉全血与抗凝剂混合均匀；
68.2)将步骤1)中的混合物进行第一次低速离心；
69.3)将步骤2)离心后的上层血浆和血小板层吸至另一新的离心管中；
70.4)将步骤3)中的所得物进行第二次低速离心；
71.5)弃去步骤4)离心后的上清液，剩余液体即为富血小板血浆。
72.在一些优选的实施方案中，所述抗凝剂为edta、肝素、草酸盐、枸橼酸盐或以上的组合。
73.不同的抗凝剂其抗凝原理略有不同。枸橼酸盐与edta的抗凝原理相同：是与血液中ca离子结合成螯合物，使ca失去活性，中断凝血过程，从而达到抗凝的目的。肝素是通过加强抗凝血酶ⅲ，灭活丝氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成来达到抗凝的目的。草酸盐是通过其草酸根与血液中的ca离子形成草酸钙沉淀，使其无凝血功能。
74.在一些实施方案中，步骤2)中的第一次低速离心的条件不同于步骤4)中第二次低速离心的条件。
75.在一些实施方案中，步骤2)中的第一次低速离心的条件为：离心力为200g，离心时间为10min；并且步骤4)中的第二次低速离心的条件为：离心力为800g，离心时间为6min。
76.在一些实施方案中，在步骤c中，每1ml所述富血小板血浆与1
×
106个第4代间充质干细胞混合，以及任选地，在步骤d中，以l ml富血小板血浆:10u凝血酶的比例将牛凝血酶加入富血小板血浆和间充质干细胞的混合物中。
77.本技术还提供了本技术第一方面所述的组合物在制备用于修复组织创伤的药物中的用途。
78.在一些实施方案中，所述药物以凝胶剂的形式局部施用于组织创伤部位(例如皮肤创伤部位)，显著促进了损伤组织的修复或再生，对组织损伤具有良好的治疗效果。
79.上述公开内容总体上描述了本技术，现在将通过以下实施例来说明本发明的某些实施方案。然而，本发明可以用很多不同方式实施，而不应理解为其受限于本文示出的实施方案；相反，提供这些实施方案是为了使得本公开充分而完整，并向本领域技术人员充分传递本发明的范围。
80.实施例
81.提供以下实施例仅是对本技术的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的。
82.下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
83.实施例1：脂肪间充质干细胞的获取和培养
84.脂肪间充质干细胞的获取和培养的方法包括以下步骤：
85.1)在无菌条件下，采用抽脂方式或者手术方式获取脂肪，采集量10ml以上，离心，将沉淀物用含青霉素和链霉素的pbs反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪绞碎为0.5-l mm3的脂肪微块；
86.2)向步骤1)的所得物中加入脂肪温和消化酶(每克脂肪组织使用0.5-2ml i型胶原酶消化)，在37℃消化20-40min，加入和i型胶原酶相同体积的培养基终止反应；
87.3)将步骤2)中的所得物以1000rpm离心10min，弃去上清液，获得间充质干细胞；
88.4)将步骤3)中获得的间充质干细胞以约8000个/cm2的密度接种于含有无血清培养基的细胞培养瓶中，然后置于37℃和5％co2的饱和湿度细胞培养箱中进行培养，隔天更换培养基，培养至约80-90％的融合度时，进行传代。
89.实施例2：富血小板血浆的制备
90.用于制备富血小板血浆方法包括以下步骤：
91.1)预先用50ml注射器吸取4ml枸橼酸钠注射液。取预用本产品的使用者的静脉全血36ml，轻柔混匀抗凝；
92.2)将步骤1)中的混合物分装到15ml离心管中，每管5ml；
93.3)将步骤2)中的离心管以200g离心10min；
94.4)吸取每支离心管上层血浆及血小板层约2ml，尽量不要吸取到红细胞层，吸取之后转移至另一个新的15ml离心管中，两支合并到一支内，约4ml；
95.5)将步骤4)中的离心管以800g离心6min；以及
96.6)吸取步骤5)中约3/4上清液弃掉，混合剩余液体，即为富含血小板的血浆。
97.实施例3：凝胶组合物的制备
98.用于制备凝胶组合物的方法包括：将1ml实施例2中制备的prp、1
×
106个实施例1中制备的第四代间充质干细胞和10u牛凝血酶混合，然后置于6孔板中，向6孔板中加入无血清培养基(ultraculture serum-free medium)，培养3天，收集间充质干细胞和prp的混合物。
99.实施例4：本技术的凝胶组合物对创伤修复的作用
100.将体重为约280-300g的雌性sprague dawley大鼠(购自上海凯学生物科技有限公司)用5％水合氯醛对大鼠进行全身麻醉后，切除大鼠背部中间2.5
×
2.5cm2的皮肤(包括肉膜)。在去除肉络层和部分真皮厚度使移植物变薄后，用3/0缝合线将移植物重新连接到原位下肌筋膜上，以模拟临床中的全层皮肤移植物。
101.将造模动物随机分为4组，每组10只。然后，将4组大鼠分别进行以下处理：第1组，在移植皮肤下注射1ml生理盐水；第2组，将1
×
106个实施例1中制备的间充质干细胞重悬于0.5ml生理盐水中，然后将此混合物注射至移植皮肤下；第3组，在移植皮肤下注射1ml prp凝胶(其是通过将1ml实施例2中制备的prp和10u牛凝血酶混合制得的)；第4组：在移植皮肤下注射1ml实施例3制备的间充质干细胞与prp的凝胶组合物。
102.结果如图4所示：大鼠皮肤收缩能力(图4a)、张力(图4b)、h&e染色(图4c)、masson染色(图4d)以及表皮层的厚度(图4e)的数据都表明，prp和adsc凝胶组合物与单独的adsc、单独的prp以及生理盐水相比，能够更显著地提高创伤修复能力。
103.可以理解，尽管本技术以某种形式被说明，但本技术并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本技术的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本技术要求保护的范围内。