Tris-BNP纳米颗粒的制备及其在皮肤疾病治疗中的应用的制作方法

tris-bnp纳米颗粒的制备及其在皮肤疾病治疗中的应用
技术领域
1.本发明属于药物载体材料技术领域，具体涉及tris-bnp纳米颗粒的制备及其在皮肤疾病治疗中的应用。


背景技术：

2.在皮肤疾病发病过程中，不仅常常会伴随着疼痛、瘙痒等症状，而且会影响到美观度，既影响患者的身体健康，又会给患者带来沉重的心理负担，例如银屑病。
3.银屑病，是一种常见易复发的慢性，顽固性皮肤病，临床表现为严重程度不同的慢性无传染性的皮肤损害，较重的银屑病患者可累及20％-80％的全身皮肤，受累皮肤范围广泛，某些范围局限的银屑病(比如仅累及掌跖皮肤)因为造成功能障碍也属严重类型，不管皮肤损害的范围有多大，银屑病均能在生理和心理方面对患者造成损害。银屑病治疗的首要目的是在一定时间内清除皮肤损害，尤其是对于严重的银屑病患者，治疗目的是缓解银屑病患者的临床症状，如皮肤炎症、红肿、剥脱、瘙痒，疼痛等症状，防止复发，从而逐渐达到痊愈的目的。
4.目前用于治疗银屑病的传统递药系统主要分为全身递送和局部递送两种。其中，全身递送一般指内用药物系统，通过口服的方式用药，但通过口服全身用药常常会由于首过效应、清除快、皮肤沉积差而出现生物利用度差的问题，同时药物的不良反应和相互作用使其应用受到限制和挑战，需要谨慎监测。局部递送则指外用药物系统，是治疗银屑病的主要方式，但局部疗法同样存在许多问题，例如由于较大的颗粒尺寸使药物难以穿透角质层，从而无法以使药物到达病灶部位；或者由于药物无法在病灶部位滞留较长时间，需要多次给药；或者由于药物没有组织选择性，在外用时容易对健康皮肤组织造成损伤；或者由于药物质地，不防水且容易造成病灶部位不透气等，导致通过局部递药的方式(即药物直接涂于皮肤表面经皮给药)治疗银屑病总是效果不佳。
5.因此，有必要开发一种能够克服皮肤渗透屏障，且能在特定部位长时间输送特定量药物，从而提高疗效、减少副作用的递药系统。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种tris-bnp纳米颗粒的制备方法，所制得的tris-bnp纳米颗粒可以透过皮肤，并渗入皮肤，并且能够在深处滞留，缓控释释放药物，延长药物剂量，达到更好的治疗效果，可以应用于皮肤疾病的治疗中。
7.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
8.本发明提供了一种tris-bnp纳米颗粒的制备方法，该方法包括以下步骤：
9.s1、pla-hpg合成：将pla溶解在dcm中，并将hpg溶解在dmf中，合并两溶液，干燥后再加入n,n'-二异丙基碳二酰亚胺和4-二甲氨基吡啶，在室温下搅拌反应4-6天；反应后经沉淀制得；
10.s2、用ea分别配制pla-hpg溶液和药物溶液，然后将pla-hpg溶液、药物溶液、ea以
及dmso混合均匀后转移至一定量水中，经三次超声后得到小体积纳米乳，再次将小体积纳米乳转移至处于搅拌状态下的水中，并蒸发至无气泡产生，即得药物/nnps粗品，粗品经超滤管纯化后得到药物/nnps；
11.s3、将高碘酸钠溶液加至药物/nnps中反应2-30min；再加入亚硫酸钠溶液终止反应，最后经超滤管纯化制得治疗皮肤疾病的生物粘附性纳米粒药物/bnps；
12.s4、使用tris-hcl对步骤s4的药物/bnps进行适当稀释后制备得到tris-bnps纳米颗粒。
13.优选地，tris-hcl的浓度为5mm。
14.优选地，使用tris-hcl将药物/bnps稀释至1.0-2.0mg/ml的浓度。具体地，使用tris-hcl将药物/bnps稀释至1.5mg/ml的浓度。
15.基于pla-hpg制备的纳米粒子(bnps)具有很好的生物相容性和生物粘附性。但由于bnps表面有丰富的醛基，通过与组织的氨基反应而使得纳米颗粒稳定滞留在组织上，而基于pla-hpg的生物粘附性纳米粒开发的tris-bnps在皮肤角质层疾病状态下(例如：银屑病)变得松散时，可以很好的透过皮肤，并渗入深处(但无法透过健康皮肤完整的角质层)，因为tris的氨基能够与bnps的醛基反应从而暂时阻断bnps的生物粘附性，同时体内体外实验也证明了tris会随着bnps渗入组织而逐渐离开，最终使bnps又恢复成生物粘性纳米粒子，从而能够在皮肤深处滞留，缓控释放药物，延长药物剂量和药物的作用时间，进而达到更好的治疗效果，可以通过包载各种皮肤疾病药物的方式应用于各种皮肤疾病的治疗中。
16.优选地，pla-hpg溶液的浓度为100mg/ml，药物溶液的浓度为50mg/ml。
17.优选地，pla-hpg溶液、药物溶液、ea以及dmso的体积比为0.225：0.050：0.225：0.350。
18.优选地，步骤s3中，pla-hpg溶液、药物溶液、ea以及dmso的混合溶液与第一次转移时的用水量、第二次转移时的用水量的体积比为0.85：2：10。
19.优选地，所述高碘酸钠溶液的浓度为0.1mol/l，所述高碘酸钠溶液与药物/nnps的体积比为1-3:1。
20.优选地，步骤s3和s4中的超滤管纯化均为离心一次，水洗两次，总共重复超滤三次，每次离心的温度为4℃，转速为4500rpm，时间为15min。
21.优选地，hpg的制备方法为：在惰性气体氛围下将1,1,1-三羟甲基丙烷置于90-100℃油浴下直至完全溶解，再加入甲醇钾，并抽真空，10-30分钟后再充惰性气体，然后在12个半小时内添加25ml缩水甘油，得到粗hpg，粗hpg经过纯化后得到hpg。
22.本发明还提供了采用上述的一种tris-bnp纳米颗粒的制备方法制备得到的tris-bnp纳米颗粒。
23.本发明还提供了上述的tris-bnp纳米颗粒在制备治疗皮肤疾病药物中的应用，所述tris-bnp纳米颗粒中包载的药物(即药物/bnps中的药物)为用于治疗皮肤疾病的药物。
24.优选地，所述皮肤疾病为银屑病。
25.优选地，所述用于治疗皮肤疾病的药物为用于治疗皮肤疾病的外用药物。
26.进一步地，所述用于治疗皮肤疾病的药物包括但不限于二丙酸倍他米松。其他用于治疗皮肤类疾病的药物同样适用于本发明。
27.此外，其他能包载在本发明所述tris-bnp纳米颗粒中的药物，甚至是染料(比如
cy5)，同样也适用于本发明，不管这些药物是用于治疗皮肤病，还是其他靠渗透类药物治疗的疾病。
28.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
29.本发明提供了一种基于pla-hpg生物粘附性纳米粒制备tris-bnp纳米颗粒的方法，将pla、hpg制备成nnps，nnps再经高碘酸钠氧化还原后得到具有生物粘附性的纳米粒子bnps，最后将bnps分散于tris-hcl中中和其生物粘性，制备得到tris-bnps纳米颗粒。所制得的tris-bnps无法透过健康皮肤完整的角质层，但当皮肤角质层在疾病状态下(例如：银屑病)变得松散时，所制得的tris-bnps可以很好的透过皮肤的角质层，并渗入皮肤深处，而且tris-bnps上的tris会随着tris-bnps渗入组织而逐渐扩散，最终变为bnps恢复生物粘性，从而使其能与皮肤深处的蛋白粘合，能够在皮肤深处滞留。所制得的tris-bnps作为载体可以负载药物，应用于皮肤疾病的治疗中，能够发挥更好的治疗效果。
附图说明
30.图1为通过不同纳米颗粒(nnps，bnps，tris-bnps)处理后银屑病小鼠背部皮肤纵切上的荧光分布图；
31.图2为通过不同纳米颗粒(nnps，bnps，tris-bnps)处理后银屑病小鼠背部皮肤纵切上的荧光定量图；
32.图3为通过不同纳米颗粒(nnps，bnps，tris-bnps)处理后银屑病小鼠背部皮肤在不同时间点的荧光分布图；
33.图4为通过不同纳米颗粒(nnps，bnps，tris-bnps)处理后银屑病小鼠背部皮肤在不同时间点的荧光定量图；
34.图5为通过不同纳米颗粒(nnps，bnps，tris-bnps)处理及涂抹bd ointment后小鼠背部皮肤的变化情况；
35.图6为通过不同纳米颗粒(nnps，bnps，tris-bnps)处理及涂抹bd ointment后小鼠背部皮肤的pasi分数统计情况；
36.图7为通过不同纳米颗粒(nnps，bnps，tris-bnps)处理及涂抹bd ointment后小鼠体重的变化情况。
具体实施方式
37.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
38.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
39.实施例1tris-bnps纳米颗粒(包载染料cy5)的制备
40.采用乳液法制备包载染料的bnps：
41.(1)hpg(超支化聚缩水甘油醚)的合成：
42.在氩气保护下将4.67mmol 1,1,1-三羟甲基丙烷(tmp)加入到95℃油浴的烧瓶中，完全溶解后，添加1.4mmol koch3(甲醇钾)，将烧瓶连接至真空泵，并将烧瓶抽至真空状态，
10分钟后再充氩气，并一直充满整个烧瓶，然后通过微量注射器泵在12个半小时内添加25ml缩水甘油，得到粗hpg。将粗hpg溶解在甲醇中，并用丙酮沉淀，重复此过程两次或三次来纯化hpg；然后通过透析袋(500-1000d)在超纯水中透析hpg，以去除一些小分子量的hpg，每5小时更换两次水；最后，加丙酮再次沉淀hpg，并将hpg置于真空下在85℃下干燥8-10h即得。
43.(2)pla-hpg合成：
44.将5g pla(聚乳酸)溶解在dcm(二氯甲烷，用量为能够溶解pla的最小体积)中，并将2.3g hpg溶解在23mldmf(n,n-二甲基甲酰胺)中，合并两溶液，然后加入3a分子筛(经高温活化后使用)使其干燥；干燥后转移至反应瓶中，并往反应瓶中加入0.08mln,n'-二异丙基碳二酰亚胺(dic)和13.5mg 4-二甲氨基吡啶(dmap)，在室温下搅拌反应5天；反应后往反应瓶中加入冷乙醚进行沉淀，并通过离心收集沉淀物，所得沉淀重新溶解在dcm中，并用冷乙醚再次沉淀，最后在真空下干燥了2天即得。
45.(3)pla-cy5合成：
46.将1.95g pla溶解在dcm(用量为能够溶解pla的最小体积)中，再加入15mg cy5和0.02mldic，在室温下搅拌反应一天，然后加入冷乙醚进行沉淀，并通过离心收集沉淀物，所得沉淀在真空下干燥2天即得。
47.(4)用ea(乙酸乙酯)分别配制浓度为100mg/ml的pla-hpg溶液和浓度为50mg/ml的pla-cy5溶液；然后加入0.225ml的pla-hpg溶液、0.050ml的pla-cy5溶液、0.225ml的ea以及0.350ml的dmso，涡旋混合均匀后将总计0.85ml的混合溶液转移至2ml超纯水中，随后边涡旋边转移至超声破碎仪中，超声三次(设置功率为65w，每次超声时间10s，每次超声完毕应立即置于冰上冷却)后得到小体积纳米乳。然后将小体积纳米乳转移至10ml处于搅拌状态下的超纯水中，搅拌三分钟；搅拌后将全部溶液转移至圆底烧瓶内，室温下旋蒸至无气泡产生，得到包载染料的nnps粗品。
48.(6)将粗产品转移至15ml、100kd的超滤管中，置于离心机中进行离心(4℃，4500rpm，15min)，离心一次，水洗两次，总共重复超滤三次。加超纯水润洗，尽可能将超滤管内膜、内壁的nnps洗出，即得包载染料的非粘附性纳米粒nnps(简称nnps，即nonadhesive nps，非粘附性nps)。
49.(7)采用氧化还原法制备包载染料的bnps(bnp，即bioadhesive nanoparticle，生物粘附纳米颗粒)：将一体积的高碘酸钠溶液(0.1mol/l)加至一体积包载染料的nnps中，上下颠倒振摇，反应2-30min；再加入1体积的亚硫酸钠溶液(0.2mol/l)终止反应；分别转移至超滤管中进行离心(4℃，4500rpm，15min)，离心一次，水洗两次，总共重复超滤三次；加超纯水润洗，尽可能将超滤膜、内壁的包载染料的bnps洗出，即得包载染料的生物粘附性纳米粒bnps(简称bnps)。
50.(8)使用浓度为5mm的tris-hcl将上述的bnps稀释至1.5mg/ml的浓度(即稀释8倍)，即制备得到tris-bnps纳米颗粒。
51.实施例2tris-bnps纳米颗粒(包载药物bd)的制备
52.制备方法同实施例1，不同点在于：将pla-cy5替换为bd(二丙酸倍他米松)，简称bd/tris-bnps。制备过程中的nnps则为bd/nnps，bnps为bd/bnps。
53.实验例1tris-bnps对皮肤的渗透效果
54.对balb/c小鼠(购自北京斯贝福生物技术有限公司，饲养6-8周至20-25g大小)每天涂抹咪喹莫特(imiquimod,imq)建立银屑病小鼠模型，经过5天涂抹后，将0.3ml实施例1制备的载有pla-cy5的nnps，bnps，tris-bnps溶液直接淋到造模成功的银屑病小鼠的背部皮肤，然后用水冲洗约1分钟，取下背部皮肤，冰冻切片，冷冻组织被分割成10μm切片，安装在玻璃载玻片上，并使用evos荧光显微镜成像，并用image j对图片进行荧光定量分析。
55.从图1中银屑病小鼠的背部皮肤纵切上的荧光照片来看，与bnps相比，tris-bnp能透过角质层，到达皮肤深部，说明tris-bnp在应用于银屑病皮肤时能够深入表皮，并能够在皮肤深处滞留。同时，通过图2中银屑病小鼠背部皮肤纵切上的荧光定量也可以看出，tris-bnps组的荧光没有显著的变化，说明tris-bnp在应用于银屑病皮肤时能够深入表皮，并能够在皮肤深处滞留，说明tris-bnp有望成为治疗银屑病的理想透皮工具。
56.实验例2tris-bnps在皮肤内的滞留情况
57.对balb/c小鼠(购自北京斯贝福生物技术有限公司，饲养6-8周至20-25g大小)每天涂抹咪喹莫特(imiquimod,imq)建立银屑病小鼠模型，经过5天涂抹后，将0.3ml实施例1制备的载有pla-cy5的nnps，bnps，tris-bnps溶液直接淋到造模成功的银屑病小鼠的背部皮肤，然后用水冲洗约1分钟。为了更好地了解各种纳米粒在皮肤内的滞留和渗透情况，用小动物活体成像仪(perkin elmer小动物活体成像系统，型号为lumina xr seriesⅲ)观察银屑病小鼠的背部皮肤在不同时间点(5min,1day,2day,3day,)的荧光分布情况。同时，针对各个时间点在小动物活体成像仪下拍照，并根据荧光区域对应的roi数值对其进行荧光定量分析。此外，还通过小动物活体成像处理软件(成像仪配套软件)也对不同时间点下荧光强度进行定量。
58.从图3和图4可以看出，nnps和bnps在1天内显著降低(分别为-85％和-50％)，并在2天内完全消失，nnps可能会随着皮肤细胞的更新而减少，因为它对表皮没有生物粘附性。bnps从银屑病皮肤消失的同时，与imq诱导银屑病小鼠白皮掉落的时间一致，说明其不能渗透到银屑病皮肤的深处。而tris-bnps在4天后才从皮肤上消失，这与银屑角膜细胞通过表皮的增殖期(4-5天)相符，说明了tris-bnp相比其他纳米粒来说滞留效果更好。
59.实验例3tris-bnps对银屑病小鼠的治疗效果
60.对balb/c小鼠每天涂抹imq建立银屑病小鼠模型，经过6天涂抹后，将造模成功的银屑病小鼠随机分为5组【bd/nnps，bd/bnps，bd/tris-bnps，bd ointment(bd软膏)组以及不治疗组和健康组】，在第六天分别对各组小鼠的背部皮肤进行淋药(bd/nnps，bd/bnps，bd/tris bnps)处理(0.3ml)，bd ointment则采用涂抹的方式施药(患处涂抹均匀即可)，然后观察各组小鼠背部皮肤的变化情况，并每天使用银屑病区域严重性指数(psoriasis area and severity index，pasi)评估疾病的严重程度。此外，每天记录小鼠体重，观察小鼠体重的变化情况。
61.在第九天观察各组小鼠背部皮肤的变化情况，由图5可以看到，bd/tris-bnps组是最接近健康组小鼠皮肤的，和其他组相比具备更好的治疗效果。
62.同时，由图6可以看出，连续6天对小鼠背部皮肤反复使用imq霜会诱发红斑、缩放和皮肤厚度增强等皮肤病变。如果不进行治疗，根据模型小鼠的临床症状和银屑病症状的严重程度，其累计pasi分数到第9天将逐渐增加11。与未经任何治疗的银屑病小鼠相比，或与通过使用bd/nnps和bd/bnps治疗的小鼠相比，bd/tris-bnps的应用能大大改善了疾病的
严重程度。表明bd/tris-bnps可穿透表皮，在皮肤中保留至少3天。同时，通过pasi分数也可以看出，与bd/tris-bnps相比，单独使用bd(二丙酸倍他米松)这种传统局部疗法的治疗效果反而不是很好，而bd/tris-bnps的治疗表现出更好的抗炎效果，且3天内只有一剂(即3天内只需涂药一次)。证明tris会随着bnps渗入组织而逐渐离开，由于bnps表面含有丰富的醛基，可以与组织发生氨基反应而使得纳米颗粒稳定滞留在组织上，从而使其能够在皮肤深处滞留，缓控释放药物，延长药物剂量和药物作用时间，进而提高治疗效果。
63.此外，从图7的银屑病小鼠造模到用药处理期间小鼠体重的变化情况可以看出，bd/nnps、bd/bnps以及bd软膏处理组的小鼠体重均有下降，而用bd/tris-bnps治疗的小鼠体重逐渐回升，说明用bd/tris-bnps治疗银屑病小鼠具有更好的治疗效果，从而导致小鼠体重有所回升。
64.综合实验例1和2可见，在pla-hpg生物粘附性纳米粒的基础上开发的tris-bnps可以很好的透过银屑病皮肤的角质层，并渗入皮肤深处，同时体内体外实验也证明了tris会随着bnps渗入组织而逐渐离开，最终使bnps又恢复成生物粘性纳米粒子，从而使其能够在皮肤深处滞留，缓控释放药物，延长药物剂量，达到更好的治疗效果。
65.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。