塞来昔布促进细胞分化的研究及其在尿失禁中的新应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药的技术领域，特别是一种塞来昔布促进细胞分化的研究及其在尿失禁中的新应用。


背景技术：

2.女性压力性尿失禁(stress urinary incontinence；sui)是女性盆底功能障碍的常见表现，并且随着年龄的推移，发病率呈上升趋势。压力性尿失禁虽然不具备致死性，但是对患者的生活质量有极大的影响同时给社会增添巨大的负担。目前临床上未有针对sui的特效药物，轻度sui患者首选盆底功能训练等行为治疗，中度、重度患者一般会选择手术治疗，但手术治疗常常会产生各类并发症，因此手术一般仅作为终末疗法。所以目前临床急需一种针对压力性尿失禁的特效药物，减轻患者的痛苦及负担。
3.塞来昔布(celecoxib)是一种昔布类的非甾体抗炎药(nonsteroidal antiinflammatory drugs，nsaids)，化学名为4-[5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1氢-1-吡唑-1-基]苯磺酰胺，分子量大小为381.38。非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,nsaids)是一类能抑制环氧合酶(cycloxygenase,cox)酶的非甾体抗炎药，分为非选择性(传统的非甾体抗炎药)和选择性cox-2抑制剂。塞来昔布具有特定结构模式，即二芳基杂环支架和确定的形状(蝴蝶状)是它们对cox-1选择性的主要原因，因为它们很好地适应于cox-2酶的v型催化位点，即通过高选择性的抑制cox-2阻碍前列腺素产生，而对cox-1没有抑制作用。
[0004]
临床常用于缓解骨关节炎的症状和体征；用于缓解成人类风湿关节炎的症状和体征；用于治疗成人急性疼痛。


技术实现要素：

[0005]
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种经过试验研究证明塞来昔布刺进细胞分化的作用及对尿失禁具有可观疗效的塞来昔布促进细胞分化的研究及其在尿失禁中的新应用。
[0006]
为实现上述目的，本发明的技术方案：
[0007]
塞来昔布促进细胞分化的研究，具体的实验步骤如下：
[0008]
(1)细胞的选择及培养：选用中国科学院细胞库的大鼠l6成肌细胞，90％dmem培养基，10％优质胎牛血清，1％青-链霉素，胰酶，气相控制：95％空气、5％二氧化碳，温度37℃，以上条件下进行培养；
[0009]
(2)cck8细胞增殖：大鼠l6成肌细胞以初始密度2
×
103个/孔接种到96孔板中，每个浓度5个复孔，边缘孔用pbs覆盖，分别在24h、48h、72h后用不同浓度的塞来昔布(0、6.25、12.5、25、50nmol/l)培养细胞24h，每孔加入10μl cck8溶液后继续孵育1h，酶标仪检测450nm处的吸光度(od)值，测量前振摇10s，观察结果；
[0010]
(3)免疫荧光法检测塞来昔布促进细胞分化水平：取对数生长期的大鼠l6成肌细
胞接种于六孔板，24h后加入含有25μmol/l塞来昔布的分化培养基，48h后将在培养板中将已爬好细胞的爬片用pbs浸洗3次，每次3min；用预冷的4％的多聚甲醛固定爬片室温30min，用pbs漂洗3次，每次5min；用0.2％triton x-100(pbs配制)室温通透20min，结束后用pbs漂洗3次，每次5min；5％正常羊血清室温封闭1h后甩去多余的封闭液，加合适浓度的一抗，4℃孵育过夜；第二天用pbst漂洗4次，每次5min；用荧光二抗，避光、室温孵育2h；用pbst避光漂洗4次，每次5min；吸取多余的水滴，每张细胞爬片上滴加50ul的抗淬灭封片剂(含dapi)封片，荧光显微镜下观察并采集图片；细胞分化水平明显上升以成肌细胞融合形成的肌管数目衡量肌肉细胞的再生能力，利用肌管内细胞核数目(新生肌管细胞核数＜3、成熟肌管细胞核≥3)比较分化能力；
[0011]
(4)实时荧光定量pcr：收集不同浓度处理48h的5组大鼠l6成肌细胞，提取大鼠l6成肌细胞总rna，逆转录为cdna，用荧光定量扩增试剂为上机(lightcycle 96)扩增做准备；首先激活酶活性(95℃，10min)，然后按照变性(95℃，15s)、退火和延伸(60℃，30s)程序，共40个循环；用2
‑△△
ct法计算myod、desmin、actn2 mrna的相对表达量；
[0012]
(5)蛋白印迹法(westernblot)比较不同浓度塞来昔布对大鼠l6成肌细胞促分化程度：使用10％或12％sds聚丙烯酰凝胶、pvdf膜、封闭液：5％脱脂奶粉，溶于tbst中；一抗为myod(抗体稀释比1:1000)、desmin(抗体稀释比1:1000)、ea-53(抗体稀释比1:1000)、β-actin(抗体稀释比1:1000)，溶于1％的bsa中；二抗为兔二抗、鼠二抗(抗体稀释比1:1000)；不同浓度的塞来昔布作用48h后，检测蛋白水平结果。
[0013]
作为优选，所述的步骤(4)中荧光定量扩增试剂包括：β-actin上游引物(北京擎科生物科技有限公司昆明分公司)：5
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tatggaatcctgtggcatc-3’，下游引物：5
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[0014]
塞来昔布在尿失禁中的新应用，包括塞来昔布，所述的塞来昔布分别给予轻度、中度与重度尿失禁患者进行服用，患者服用塞来昔布胶囊(西乐葆)200mg，2次/天，对照组服用安慰剂(医用淀粉)1粒/次，2次/天，2组均辅以行为治疗、盆底功能锻炼，治疗3月后随访，以尿垫实验及生活质量量表评估疗效。
[0015]
作为优选，所述的尿失禁患者按照临床症状分类，分为三度：轻度：一般活动及夜间无尿失禁，腹压增加时偶发尿失禁，不需佩戴尿垫；中度：腹压增加及起立活动时，有频繁的尿失禁，需要佩戴尿垫生活；重度：起立活动或卧位体位变化时即有尿失禁，严重地影响患者的生活及社交活动。
[0016]
本发明的有益条件在于：
[0017]
1、cck8进行大鼠l6成肌细胞进行增殖，证明25μmol/l及以下浓度的塞来昔布组在不同时间段与对照组相比没有明显差异，这说明25μmol/l及以下浓度的塞来昔布组对大鼠l6成肌细胞没有明显的毒性作用；
[0018]
2、通过免疫荧光法，得出25μmol/l的塞来昔布作用大鼠l6成肌细胞48h后可以促进其分化；
[0019]
3、通过实施荧光定量pcr，得出mrna水平上来看一定浓度的塞来昔布可以促进了
l6细胞的分化；
[0020]
4、通过蛋白印迹法，得出一定浓度的塞来昔布可以促进了l6细胞的分化；
[0021]
5、经过临床疗效观察，塞来昔布常见的并发症如心血管意外及胃肠道反应，均未出现明显的药物副作用，具有耐受性及安全性，同时通过心理及生理评价，服用塞来昔布的实验组得分均高于对照组，尿失禁治疗是有效的。
附图说明
[0022]
图1为本发明通过连续3个月服用塞来昔布后通过生活质量量表进行疗效评价结果。
[0023]
图2为本发明不同浓度塞来昔布溶液对大鼠l6成肌细胞增殖的影响结果。
[0024]
图3为本发明免疫荧光法检测塞来昔布对大鼠l6成肌细胞分化的结果。
[0025]
图4为本发明实时荧光定量pcr分析塞来昔布对大鼠l6成肌细胞分化的结果。
[0026]
图5为本发明蛋白印迹法检测塞来昔布对大鼠l6成肌细胞分化的结果。
具体实施方式
[0027]
如图1、2、3、4、5所示，塞来昔布促进细胞分化的研究，具体的实验步骤如下：(1)细胞的选择及培养：选用中国科学院细胞库的大鼠l6成肌细胞，90％dmem培养基，10％优质胎牛血清，1％青-链霉素，胰酶，气相控制：95％空气、5％二氧化碳，温度37℃，以上条件下进行培养；(2)cck8细胞增殖：大鼠l6成肌细胞以初始密度2
×
103个/孔接种到96孔板中，每个浓度5个复孔，边缘孔用pbs覆盖，分别在24h、48h、72h后用不同浓度的塞来昔布(0、6.25、12.5、25、50nmol/l)培养细胞24h，每孔加入10μl cck8溶液后继续孵育1h，酶标仪检测450nm处的吸光度(od)值，测量前振摇10s，观察结果；(3)免疫荧光法检测塞来昔布促进细胞分化水平：取对数生长期的大鼠l6成肌细胞接种于六孔板，24h后加入含有25μmol/l塞来昔布的分化培养基，48h后将在培养板中将已爬好细胞的爬片用pbs浸洗3次，每次3min；用预冷的4％的多聚甲醛固定爬片室温30min，用pbs漂洗3次，每次5min；用0.2％triton x-100(pbs配制)室温通透20min，结束后用pbs漂洗3次，每次5min；5％正常羊血清室温封闭1h后甩去多余的封闭液，加合适浓度的一抗，4℃孵育过夜；第二天用pbst漂洗4次，每次5min；用荧光二抗，避光、室温孵育2h；用pbst避光漂洗4次，每次5min；吸取多余的水滴，每张细胞爬片上滴加50ul的抗淬灭封片剂(含dapi)封片，荧光显微镜下观察并采集图片；细胞分化水平明显上升以成肌细胞融合形成的肌管数目衡量肌肉细胞的再生能力，利用肌管内细胞核数目(新生肌管细胞核数＜3、成熟肌管细胞核≥3)比较分化能力；(4)实时荧光定量pcr：收集不同浓度处理48h的5组大鼠l6成肌细胞，提取大鼠l6成肌细胞总rna，逆转录为cdna，用荧光定量扩增试剂为上机(lightcycle 96)扩增做准备；首先激活酶活性(95℃，10min)，然后按照变性(95℃，15s)、退火和延伸(60℃，30s)程序，共40个循环；用2
‑△△
ct法计算myod、desmin、actn2mrna的相对表达量；(5)蛋白印迹法(westernblot)比较不同浓度塞来昔布对大鼠l6成肌细胞促分化程度：使用10％或12％sds聚丙烯酰凝胶、pvdf膜、封闭液：5％脱脂奶粉，溶于tbst中；一抗为myod(抗体稀释比1:1000)、desmin(抗体稀释比1:1000)、ea-53(抗体稀释比1:1000)、β-actin(抗体稀释比1:1000)，溶于1％的bsa中；二抗为兔二抗、鼠二抗(抗体稀释比1:1000)；不同浓度的塞来昔布作用48h后，检测蛋白水平结果。所述
的步骤(4)中荧光定量扩增试剂包括：β-actin上游引物(北京擎科生物科技有限公司昆明分公司)：5
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gtgttggcatagaggtctt-3’；myod上游引物：5
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aacacggatcatcatagaag-3’；desmin上游引物：5
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acatctctgaggctgaag-3’，下游引物：5
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cgcatcgttgttcttattg-3’；desmin上游引物：5
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gatggcaatgtgaagatg-3’，下游引物：5
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[0028]
塞来昔布在尿失禁中的新应用，包括塞来昔布，所述的塞来昔布分别给予轻度、中度与重度尿失禁患者进行服用，患者服用塞来昔布胶囊(西乐葆)200mg，2次/天，对照组服用安慰剂(医用淀粉)1粒/次，2次/天，2组均辅以行为治疗、盆底功能锻炼，治疗3月后随访，以尿垫实验及生活质量量表评估疗效。所述的尿失禁患者按照临床症状分类，分为三度：轻度：一般活动及夜间无尿失禁，腹压增加时偶发尿失禁，不需佩戴尿垫；中度：腹压增加及起立活动时，有频繁的尿失禁，需要佩戴尿垫生活；重度：起立活动或卧位体位变化时即有尿失禁，严重地影响患者的生活及社交活动。
[0029]
本发明的患者通过服用塞来昔布胶囊(西乐葆)200mg，2次/天，对照组服用安慰剂(医用淀粉)1粒/次，2次/天，2组均辅以行为治疗、盆底功能锻炼，治疗3月后随访，以尿垫实验及生活质量量表评估疗效。
[0030]
如图1所示，结果显示患者长时间服用一定剂量的塞来昔布可以有效改善sui患者漏尿症状，经生活质量量表评价，不管是心理还是生理维度的得分，实验组均高于对照组，而且塞来昔布常见的并发症如心血管意外及胃肠道反应，均未出现明显的药物副作用，因此塞来昔布具有良好的耐受性及安全性，本发明应用塞来昔布进行压力性尿失禁的治疗有明显的疗效，可以大大提高患者的生活质量，同时填补了压力性尿失禁药物治疗的空白。
[0031]
如图2所示，经过cck8细胞增殖实验，结果显示：25μmol/l及以下浓度的塞来昔布组在不同时间段与对照组相比没有明显差异，这说明25μmol/l及以下浓度的塞来昔布组对l6细胞没有明显的毒性作用，与对照组相比各个时间段的50μmol/l塞来昔布组的od值明显下降，p《0.05差异具有统计学意义，这说明高浓度的塞来昔布对细胞有明显的毒性作用。
[0032]
如图3所示，经过免疫荧光法检测结果显示，与对照组相比25μmol/l的塞来昔布作用48h后，对大鼠l6成肌细胞分化阶段呈现出绿色荧光显著增高的现象，这提示desmin、myod受体阳性的特征，其中dapi让细胞核在荧光显微镜下呈现圆形，图中可以明显看出，药物作用后48h后可以见到许多两个细胞核及以上的串珠样肌管出现(箭头处)，说明部分大鼠l6成肌细胞进入分化期，以上现象提示，25μmol/l的塞来昔布作用大鼠l6成肌细胞48h后可以促进其分化。
[0033]
如图4所示，实时荧光定量pcr结果显示，不同浓度的塞来昔布作用48h后，我们在mrna水平分别检测了几个分化指标(myod、desmin、actn2)的表达水平，与对照组相比，myod、desmin、actn2的表达量均升高(p《0.05)，这些结果表明，mrna水平上来看一定浓度的塞来昔布可以促进了l6细胞的分化。
[0034]
如图5所示，蛋白印迹法结果显示，不同浓度的塞来昔布作用48h后，我们在蛋白水平分别检测了几个分化指标(myod、desmin、actn2)的表达水平，与对照组相比，myod、desmin、ea-53(actn2)的表达量均升高，且p值均小于0.05，提示差异有统计学上的意义，这些结果表明，一定浓度的塞来昔布可以促进了大鼠l6成肌细胞的分化。
[0035]
以上几种方式的结果均得出，塞来昔布可以促进大鼠l6成肌细胞的分化，即通过
检测结蛋白(desmin)、生肌调节因子(myogenic differentiation 1，myod)、肌动蛋白α2(actinin alpha 2，actn2)作为塞来昔布促进成肌细胞分化的标志，可证明对尿失禁回复具有有效的作用。
[0036]
本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。