塞来昔布促进细胞分化的研究及其在尿失禁中的新应用的制作方法

技术特征：
1.塞来昔布促进细胞分化的研究，其特征在于，具体的实验步骤如下：(1)细胞的选择及培养：选用中国科学院细胞库的大鼠l6成肌细胞，90％dmem培养基，10％优质胎牛血清，1％青-链霉素，胰酶，气相控制：95％空气、5％二氧化碳，温度37℃，以上条件下进行培养；(2)cck8细胞增殖：大鼠l6成肌细胞以初始密度2
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103个/孔接种到96孔板中，每个浓度5个复孔，边缘孔用pbs覆盖，分别在24h、48h、72h后用不同浓度的塞来昔布(0、6.25、12.5、25、50nmol/l)培养细胞24h，每孔加入10μl cck8溶液后继续孵育1h，酶标仪检测450nm处的吸光度(od)值，测量前振摇10s，观察结果；(3)免疫荧光法检测塞来昔布促进细胞分化水平：取对数生长期的大鼠l6成肌细胞接种于六孔板，24h后加入含有25μmol/l塞来昔布的分化培养基，48h后将在培养板中将已爬好细胞的爬片用pbs浸洗3次，每次3min；用预冷的4％的多聚甲醛固定爬片室温30min，用pbs漂洗3次，每次5min；用0.2％triton x-100(pbs配制)室温通透20min，结束后用pbs漂洗3次，每次5min；5％正常羊血清室温封闭1h后甩去多余的封闭液，加合适浓度的一抗，4℃孵育过夜；第二天用pbst漂洗4次，每次5min；用荧光二抗，避光、室温孵育2h；用pbst避光漂洗4次，每次5min；吸取多余的水滴，每张细胞爬片上滴加50ul的抗淬灭封片剂(含dapi)封片，荧光显微镜下观察并采集图片；细胞分化水平明显上升以成肌细胞融合形成的肌管数目衡量肌肉细胞的再生能力，利用肌管内细胞核数目(新生肌管细胞核数＜3、成熟肌管细胞核≥3)比较分化能力；(4)实时荧光定量pcr：收集不同浓度处理48h的5组大鼠l6成肌细胞，提取大鼠l6成肌细胞总rna，逆转录为cdna，用荧光定量扩增试剂为上机(lightcycle 96)扩增做准备；首先激活酶活性(95℃，10min)，然后按照变性(95℃，15s)、退火和延伸(60℃，30s)程序，共40个循环；用2
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ct法计算myod、desmin、actn2 mrna的相对表达量；(5)蛋白印迹法(westernblot)比较不同浓度塞来昔布对大鼠l6成肌细胞促分化程度：使用10％或12％sds聚丙烯酰凝胶、pvdf膜、封闭液：5％脱脂奶粉，溶于tbst中；一抗为myod(抗体稀释比1:1000)、desmin(抗体稀释比1:1000)、ea-53(抗体稀释比1:1000)、β-actin(抗体稀释比1:1000)，溶于1％的bsa中；二抗为兔二抗、鼠二抗(抗体稀释比1:1000)；不同浓度的塞来昔布作用48h后，检测蛋白水平结果。2.根据权利要求1所述的塞来昔布促进细胞分化的研究，其特征在于，所述的步骤(4)中荧光定量扩增试剂包括：β-actin上游引物(北京擎科生物科技有限公司昆明分公司)：5
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tatggaatcctgtggcatc-3’，下游引物：5
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gtgttggcatagaggtctt-3’；myod上游引物：5
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aacacggatcatcatagaag-3’；desmin上游引物：5
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cgcatcgttgttcttattg-3’；desmin上游引物：5
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gatggcaatgtgaagatg-3’，下游引物：5
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cactgagatgtcctgaat-3’。3.根据权利要求1-2中任一所述的塞来昔布在尿失禁中的新应用，包括塞来昔布，其特征在于，所述的塞来昔布分别给予轻度、中度与重度尿失禁患者进行服用，患者服用塞来昔布胶囊(西乐葆)200mg，2次/天，对照组服用安慰剂(医用淀粉)1粒/次，2次/天，2组均辅以行为治疗、盆底功能锻炼，治疗3月后随访，以尿垫实验及生活质量量表评估疗效。4.根据权利要求3所述的塞来昔布在尿失禁中的新应用，其特征在于，所述的尿失禁患者按照临床症状分类，分为三度：轻度：一般活动及夜间无尿失禁，腹压增加时偶发尿失禁，
不需佩戴尿垫；中度：腹压增加及起立活动时，有频繁的尿失禁，需要佩戴尿垫生活；重度：起立活动或卧位体位变化时即有尿失禁，严重地影响患者的生活及社交活动。

技术总结
本发明公开了塞来昔布促进细胞分化的研究，具体的实验步骤如下：(1)细胞的选择及培养；(2)CCK8细胞增殖；(3)免疫荧光法检测塞来昔布促进细胞分化水平；(4)实时荧光定量PCR；(5)蛋白印迹法(westernBlot)比较不同浓度塞来昔布对大鼠L6成肌细胞促分化程度。塞来昔布在尿失禁中的新应用，包括塞来昔布，所述的塞来昔布分别给予轻度、中度与重度尿失禁患者进行服用，以尿垫实验及生活质量量表评估疗效。本发明的有益条件在于：经过试验研究证明塞来昔布刺进细胞分化的作用及对尿失禁具有可观疗效。疗效。疗效。


技术研发人员：方克伟 孙浩 翁雨亭 蒋秀秀 吴静
受保护的技术使用者：方克伟
技术研发日：2021.10.22
技术公布日：2022/1/28