一种双功能表达载体及嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞的制作方法

1.本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种双功能表达载体、嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞及其在制备抗肿瘤产品中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.胰腺癌(paad)是一种高转移性胃肠道肿瘤，被认为是最致命的人类恶性肿瘤之一。paad对大多数化疗药物反应不良，手术切除是目前唯一可能治愈的治疗手段。但不幸的是，由于缺乏早期敏感性和特异性抗原，临床确诊的胰腺癌患者中约80％已属中晚期，不可切除治疗。虽然目前已经出现多种paad免疫治疗策略，但一些临床试验结果显示，即使是最有希望的免疫检查点抑制剂治疗效果也并未达到预期。胰腺癌肿瘤微环境中缺乏肿瘤浸润淋巴细胞，且致密的肿瘤相关细胞外基质(ecm)和纤维组织阻止cd8
t细胞、nk细胞等免疫效应细胞在肿瘤组织中的浸润。这就导致即使是在血液恶性肿瘤治疗中已取得良好进展的car-t技术，在paad中的治疗效果却差强人意。
4.以促进或修改免疫细胞攻击癌细胞为目标的免疫疗法在癌症治疗中发挥着重要作用。近年来，以树突状细胞、t细胞、nk细胞等为基础的过继细胞治疗肿瘤取得了较好的效果，但其在实体肿瘤方面的治疗效果却并不理想。在肿瘤形成的外部环境中，巨噬细胞是先天免疫系统的中枢效应器和调节器，具有吞噬作用、细胞毒性、分泌促炎因子和向t细胞呈递抗原的能力。此外，越来越多的研究表明，在各种类型的癌症中自噬大量上调也能促进细胞死亡。因此发展car-巨噬细胞(car-ms)用于肿瘤免疫治疗，以特定cars修饰人巨噬细胞提高其对肿瘤的吞噬活性和抗原提呈，为治疗实体肿瘤开辟了新的可能性。
5.嵌合抗原受体(cars)是一种合成的跨膜受体，主要由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域三个功能域构成。胞外结构域基本构成为负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scfv)及一段起连接作用的铰链区(hinge)，胞内结构域主要由共刺激结构域和信号转导结构域构成，跨膜结构域常由cd3、cd8、cd28构建。car可将某种特异性移植到免疫效应细胞(如t细胞、nk细胞)上，并增强其功能，以发挥抗肿瘤疗效。经过不断地研发更新，car也在一代至四代的发展中不断完善着。
6.巨噬细胞是人体免疫系统的重要组成部分，在实体肿瘤微环境中占免疫细胞的30-50％，因此常被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,tam)。巨噬细胞作为专业的抗原呈递细胞(antigen-presenting cells,apc)，是靶向抗体为基础的实体肿瘤免疫治疗的关键调控细胞和效应细胞，激活的巨噬细胞在促进适应性抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用。相比于其他免疫细胞，如t细胞，易被物理排斥或失活，巨噬细胞具有穿透实体肿瘤的独特能力，可充分浸润肿瘤，促进侵袭和血管生成、转移，增强免疫抑制。这表明，使用cars对巨噬细胞进行编程，改变巨噬细胞激活和吞噬平衡是一种有前途的治疗途
径。
7.粘蛋白1(muc1)是一种单通道i型跨膜蛋白，具有高度糖基化的胞外结构域。在癌细胞中，muc1过表达参与细胞内信号转导通路，并在转录和转录后水平调控其靶基因的表达，促进癌细胞的迁移和侵袭性。由于muc1在肿瘤组织中的异常表达，且糖基化不足导致肽链暴露，nci已将其评为高效的肿瘤疫苗设计靶标抗原。新的muc1特异性抗体pam4和tab004也被开发用于肿瘤诊断和治疗。因此作为一种重要肿瘤生物学标志物及治疗靶点，muc1对肿瘤的免疫治疗具有重要意义。
8.klf4是kr
ü
ppel样因子(klf)中的一员，也是一种锌指转录因子，调节细胞生长、增殖和分化等细胞过程，也可通过多种途径参与巨噬细胞表型分化。在m2型巨噬细胞中klf4表达被强有力地诱导，而m1型巨噬细胞中klf4的表达则被强烈地抑制。研究发现，klf4与stat6协同诱导m2遗传程序，并通过隔离nf-kb激活所需的共激活因子抑制m1靶点。m1型巨噬细胞能释放多种促炎因子、免疫激活因子和趋化因子，通过急性促炎反应、免疫活化反应以及细胞吞噬功能，发挥抗肿瘤的作用，主要包括以下3个方面：1)对肿瘤细胞的直接杀伤作用：m1型巨噬细胞通过细胞表型识别出不同于正常组织的肿瘤细胞，释放出no、ros等，直接消灭肿瘤细胞；2)抗体依赖的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，adcc)：m1型巨噬细胞在结合于肿瘤细胞表面抗体的引导下，将肿瘤细胞杀死；3)诱导特异性免疫应答：m1型巨噬细胞通过向t细胞提呈抗原，激活特异性免疫应答，有效地清除肿瘤细胞。然而m2型巨噬细胞可通过促进肿瘤新生血管的生成、促进肿瘤细胞生长、参与肿瘤细胞的浸润与转移、抑制免疫功能、介导多药耐药性等方式促进肿瘤的发生与发展。因此通过沉默klf4来诱导巨噬细胞由m2型向m1型极化将有助于抑制肿瘤细胞的生长。


技术实现要素：

9.本发明设计了一种靶向muc1的嵌合抗原受体，并将含klf4的发夹状rna引入重组质粒载体中，制备双功能质粒，编辑靶向胰腺癌muc1的嵌合抗原受体巨噬细胞并诱导其m1型极化在体内重新编辑，增强靶向吞噬作用，促进t淋巴细胞的激活，并促进长期记忆t细胞的分化，抑制肿瘤增殖、延长总生存期。
10.基于上述技术目的，本发明提供以下技术方案：
11.本发明第一方面，提供seq id no:1所示序列的sirna。
12.经验证，本发明提供的sirna能够高效沉默巨噬细胞中klf4的表达，诱导巨噬细胞发生m1型极化，从而实现对肿瘤细胞的抑制作用。针对上述sirna在巨噬细胞中的递送，本发明提供的一种实施方式中，通过表达载体递送并转录shklf4的方式将上述sirna递送至巨噬细胞，所述sirna为shklf4的产物，shklf4转录后在细胞内被dicer酶切割而形成sirna，从而启动rnai，介导基因沉默。
13.本发明第二方面，提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的单链可变片段包含muc1的单链抗体。
14.适用于本发明的抗muc1单链抗体可衍生自本领域周知的各种抗muc1单克隆抗体。经本发明验证可行的一种实施方式中，所述muc1的抗体为特异性抗胰腺癌细胞muc1单克隆抗体pam4。
15.根据本领域的一般理解，所述嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
16.其中，所述胞外结构域包括单克隆抗体的单链可变片段(scfv)及一段起连接作用的铰链区(hinge)；本发明优选的方案中，所述单链可变片段为muc1的单链抗体，包括轻链可变区(pam4 vl)及重链可变区(pam4 vh)，通过接头序列连接；所述铰链区选自ighg1。
17.优选的，所述跨膜结构域来源于cd4，cd8，cd28或cd3ζ中的一种；进一步的，所述跨膜结构选自cd8。
18.优选的，所述胞内结构域为信号转导域，进一步的，所述信号传导域为fcrγ1胞内区、pi3k的p85亚基胞内区。
19.优选的，所述胞内结构域还包括共刺激域，所述共刺激域来自cd28受体家族(cd28，icos)或肿瘤坏死因子受体家族(4-1bb、ox40、cd27)。
20.上述优选技术方案的一种实施方式中，所述嵌合抗原受体为依次连接的cd8信号肽、抗muc1单链抗体、myc-tag标记基因、ighg1铰链区、cd8跨膜区、fcrγ1胞内区、pi3k的p85亚基胞内区、p2a和egfp的融合蛋白。
21.上述实施方式中，所述融合蛋白的上述各部分，如cd8信号肽、抗muc1单链抗体的轻链可变区和重链可变区、myc-tag标记基因、ighg1铰链区、cd8跨膜区、fcrγ1胞内区、pi3k的p85亚基胞内区、p2a和egfp等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含g和s的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是gggs、ggggs、ssssg、gsgsa和ggsgg。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(a)、亮氨酸(l)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)、苯丙氨酸(f)、精氨酸(r)、谷氨酰胺(q)等。在某些实施方案中，本发明抗muc1单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间由(ggggs)n连接，其中n为1～5的整数。
22.还应当理解的是，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必会在所表达的氨基酸序列末端引入一个或多个不相干的残基，但不影响目的序列的活性。另外，为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的n-末端、c-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。基于上述设计，本发明的融合蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。所述的标签可以是flag，ha，ha1，c-myc，poly-his，poly-arg，strep-tag ii，au1，ee，t7，4a6，ε，b，g e以及ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
23.具体的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no:2所示，其中：
24.所述cd8信号肽的氨基酸序列如seq id no:2第1-27位氨基酸所示；
25.所述抗muc1单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:2第28-135位氨基酸所示；
26.所述抗muc1单链抗体的重链可变区的氨基酸序列可如seq id no:2第152-270位
氨基酸所示；
27.所述抗myc-tag的氨基酸序列可如seq id no:2第271-280位氨基酸所示；
28.所述ighg1铰链区的氨基酸序列如seq id no:2第281-293位氨基酸所示；
29.所述cd8跨膜区的氨基酸序列如seq id no:2第294-316位氨基酸所示；
30.所述fcrγ1胞内区的氨基酸序列如seq id no:2第317-356位氨基酸所示；
31.所述pi3k的p85亚基胞内区的氨基酸序列如seq id no:2第357-749位氨基酸所示；
32.所述p2a的氨基酸序列如seq id no:2第750-771位氨基酸所示；
33.所述egpf的氨基酸序列如seq id no:2第772-1011位氨基酸所示。
34.本发明还包括seq id no:2第28-1011位氨基酸序列所示的氨基酸序列、seq id no:2第1-1011位所示氨基酸序列的突变体；所述突变体包括：与该car具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相似性并保留该嵌合抗原受体的生物学活性的氨基酸序列。所述突变体序列的相似性可通过如ncbi的blastp进行计算。
35.上述突变体还包括：在seq id no:2第28-1011位所示的氨基酸序列，或seq id no:2所示的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该car的生物学活性的氨基酸序列；所述数个突变通常指1～10个以内，如1～8个、1～5个或1～3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性。取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
36.现有研究表明，muc1在胰腺癌的发生及发展过程中具有重要的作用，本发明第二方面提供的嵌合抗原受体加入muc1单链抗体可以有效加强免疫细胞对肿瘤的抑制效果，特别是增强对胰腺癌的靶向效果。结合本发明提供的sirna对klf4的沉默作用，本发明设计提供一种双功能的重组载体，同时实现在巨噬细胞膜表面表达muc1的单链抗体，同时诱导巨噬细胞m1型极化，从而增强抗肿瘤效果。进一步的，本发明提供了一种双功能的表达载体，同时实现上述对muc1的靶向及klf4的沉默作用，基于该技术方案，本发明提供以下技术方案：
37.本发明第三方面，提供一种表达框，所述表达框包括第二方面所述嵌合抗原受体的编码序列及shklf4。
38.优选的，所述表达框具有如seq id no:3所示的多核苷酸序列。
39.第三方面所述的多核苷酸序列通常可以用pcr扩增法获得。具体而言，根据本发明提供的多核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常
壳寡糖得到所述甘露糖-壳寡糖-精氨酸材料。
48.本发明第六方面，提供一种嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞，所述巨噬细胞膜表面具有第二方面所述嵌合抗原受体修饰，并且所述巨噬细胞中klf4表达被抑制。
49.优选的，所述巨噬细胞中klf4表达被抑制的方式具体为，通过seq id no：1所示sirna进行抑制。
50.本发明提供的一种实施方式中，所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞的制备方式如下：通过将第三方面所述表达框、第四方面所述表达载体或第五方面所述纳米复合物转入巨噬细胞进行表达。
51.本发明第七方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括第六方面所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞。
52.本发明的嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物包括上述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂。由于本发明中所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞作为活性物质，为了维持这种巨噬细胞的活性，所述组合物中还可能包括缓冲液(诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等)、碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇)、蛋白质、多肽或氨基酸(诸如甘氨酸)、抗氧化剂、螯合剂(诸如edta或谷胱甘肽)、佐剂(例如，氢氧化铝)或防腐剂中的一种或多种。
53.本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植；进一步的，所述组合物可通过皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。所述药物组合物中活性成分的剂量可通过本领域常规研究手段进行确定。所述药物组合物施用的数量和频率将由以下因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。
54.本发明第七方面，提供第三方面所述表达框、第四方面表达载体、第五方面所述纳米复合物、第六方面所述嵌合抗原受体修饰的免疫细胞和/或第七方面所述药物组合物在制备抗肿瘤产品中的应用。
55.所述抗肿瘤产品包括但不限于药物或模型药物。
56.本发明第八方面，提供一种肿瘤的免疫细胞治疗方法，所述治疗方法包括向有治疗需求的患者回输第六方面所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞。
57.优选的，所述肿瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、神经系统癌症、白血病或宫颈癌中的一种；在本发明较为优选的实施方式中，所述嵌合抗体受体修饰的免疫细胞用于胰腺癌的治疗。
58.优选的，所述治疗方法还包括获取患者的巨噬细胞，向所述巨噬细胞中转入第三方面所述表达框、第四方面所述表达载体或第五方面所述纳米复合物。
59.本发明还包括一类细胞疗法，其中巨噬细胞在体内被基因修饰以表达本发明第二方面所述嵌合抗原受体及siklf4。不同于抗体疗法，第六方面所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞能够直接吞噬肿瘤细胞，并且能够体内稳定复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
60.在本发明的一些实施方案中，本发明所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞或其组合
物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗muc1介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。
附图说明
61.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
62.图1为实施例1中所述shklf4-muc1-car piggybac转座子表达载体(ppb-shklf4-muc1-car)示意图；
63.其中，sp：信号肽；vl：轻链可变区；linker：接头；vh：重链可变区；hinge：铰链区；tm：跨膜区；wpre：土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
64.图2为实施例1中所述流式细胞检测显示nano-porter转染巨噬细胞后的muc1-car-ms表达效率。
65.图3为实施例1中所述western blot实验测示klf4蛋白沉默效果。
66.图4为巨噬细胞对肿瘤细胞的靶向吞噬作用；
67.其中，绿色为巨噬细胞和肿瘤细胞的细胞核(sytox染色)，蓝色为肿瘤系细胞(hoechst染色)，紫色为肿瘤细胞膜(did染色)，红色为巨噬细胞膜(dil染色)。白色箭头所指为肿瘤细胞核，黄色箭头所指为巨噬细胞核。标尺：5μm。
68.图5为不同治疗组下小鼠胰腺癌肿瘤生长情况。
69.图6为不同治疗组下小鼠生存期考察。
70.图7为流式细胞术测定小鼠肿瘤组织中cd4

和cd8
t细胞激活情况。
71.图8为流式细胞术测定小鼠肿瘤组织中cd4
t细胞所分化的中央记忆t细胞(t
cm
)和效应记忆t细胞(t
em
)的表达情况。
72.图9为流式细胞术测定小鼠肿瘤组织中cd8
t细胞所分化的中央记忆t细胞(t
cm
)和效应记忆t细胞(t
em
)的表达情况。
具体实施方式
73.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
74.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
75.术语解释：
76.本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。
77.正如背景技术所介绍的，本领域目前尚缺乏治疗胰腺癌的有效药物，并且胰腺肿瘤微环境中缺乏免疫细胞的浸润，导致car-t技术在胰腺癌的治疗中难以开展。为了解决如上的技术问题，本发明提供了一种双功能的表达载体以及嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞。
78.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
79.实施例1
80.1、u6-shklf4-ttttt基因序列的确定
81.从https://www.vectorbuilder.cn/learning-center/vector-component/protein-tag.html网站获得u6启动子基因序列。从ncbi网站数据库搜索到鼠klf4基因序列信息，在网站https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do上进行shrna设计，loop环序列采用ttcaagaga。终止子采用ttttt序列。这些序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合鼠源细胞表达。
82.2、muc1-car基因序列的确定
83.从ncbi网站数据库搜索到鼠cd68启动子、cd8信号肽、ighg1铰链区、cd8跨膜区、fcrγ1胞内区、pi3κ的p85亚基胞内区基因序列信息，抗muc1单链抗体克隆号为hpam4，从https://www.vectorbuilder.cn/learning-center/vector-component/protein-tag.html网站获得p2a、egfp基因序列。这些序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合鼠源细胞表达。
84.3、包含shklf4和muc1-car核酸序列的piggybac载体的构建
85.本载体由云舟生物科技(广州)有限公司载体家合成并进行测序。
86.本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。
87.4、mca的制备
88.将100mg壳寡糖溶于1ml蒸馏水(溶液
①
)，12.5mg甘露吡喃酰基苯异硫氰酸酯(mpitc)溶于1ml dmso(溶液
②
)。将溶液
①
和
②
在室温下混合搅拌24h，得到溶液
③
。随后，在溶液
③
中加入20ml的异丙醇沉淀聚合物。然后以10000rpm离心20min，用异丙醇洗涤沉淀，在相同条件下离心纯化4次。最后真空干燥得到甘露糖-壳寡糖(mc)。
89.将l-精氨酸在edc/nhs溶液(200mm)中预活化2h(溶液
④
)，加入1mltemed/hcl溶液(ph 4.8)和50mg已合成的mc(溶液
⑤
)，室温搅拌24h。获得的mca(溶液
⑤
)经透析纯化(mwco 500da)，冷冻干燥后于4℃保存备用。
90.5、nano-porter的制备
91.通过离子凝胶法将含有本文核酸序列的piggybac载体和含有转座酶序列的载体(简称为pdna，比例为5:1)装载到mca中。具体地说，按照1:10:10的重量比在磁力搅拌下将pdna的depc水溶液(1mg/ml)和三聚磷酸钠的depc水溶液(0.1mg/ml)共同注入到mca的depc水溶液(0.1mg/ml)中，涡旋10分钟，然后在37℃下孵育30分钟，得到nano-porter。
92.6、nano-porter转染巨噬细胞
93.将小鼠骨髓来源巨噬细胞bmdm接种于6孔板孵育24小时。然后将含有nano-porter的dmem培养基经0.22μm滤膜过滤，与bmdm共孵育4小时，随后用新鲜培养基代替nano-porter，继续孵育24小时。
94.7、流式细胞仪检测感染后巨噬细胞car融合蛋白的表达
95.分别离心收集感染后muc1-car-ms细胞和未转染的巨噬细胞(对照组)，用流式细胞仪以egfp为指标检测转染效果。
96.图2显示，使用步骤4制备得到的nano-porter感染巨噬细胞后，muc1-car-m阳性的表达效率达46.3％。
97.8、western blot验证siklf4沉默klf4蛋白表达
98.按照步骤5中的转染bmdm并设置(1)阴性对照组(pbs)(2)游离siklf4组(3)游离乱序组(4)1μg/ml nano-porter组，(5)5μg/ml nano-porter组和(6)10μg/ml nano-porter组。得到muc1-car-ms，分别离心收集各组细胞，细胞裂解后离心取上清液，经4％浓缩胶和10％分离胶的sds-page凝胶电泳进行分离后转膜，用5％脱脂牛奶(v/v in tbs-t)封闭1h，并与小鼠klf4抗体在4℃下孵育过夜，洗膜后用二抗摇床孵育1小时，再次洗膜后曝光获得数据。
99.图3显示klf4蛋白沉默效果。
100.9、muc1-car-ms对肿瘤细胞的靶向吞噬实验
101.hmuc1-panc02细胞的细胞核预先用hoechst 33342染色，细胞膜预先用血清did染色。如步骤6所述，使用nano-porter转染巨噬细胞获得muc1-car-ms，然后用dil对muc1-car-ms的细胞膜进行染色。双染色的hmuc1-panc02细胞与dil染色的muc1-car-ms按1:5的比例共培养2h。然后用4％pfa固定细胞，用sytox复染30min。pbs冲洗3次后，使用激光扫描共聚焦显微镜观察吞噬情况。
102.图4显示muc1-car-ms靶向吞噬肿瘤细胞的效果。
103.10、小鼠胰腺癌原位肿瘤模型的建立与治疗
104.本实施例所用小鼠为表达人源muc1的c57bl/6j转基因小鼠(hmuc1-tg小鼠)，由北京唯尚立德生物科技有限公司构建与培育。
105.将0.3％戊巴比妥钠通过腹腔注射对hmuc1-tg小鼠进行麻醉并使用70％乙醇消毒手术部位。将hmuc1-tg小鼠置于右侧卧位，在脾脏部位切口0.5cm左右，暴露胰腺，使用微量注射器将5
×
105hmuc1-panc02细胞的注入胰腺尾部。然后使用5-0可吸收缝合线缝合筋膜层和皮肤用。
106.种瘤当日为day 0，将小鼠随机分为7组，每组8只，其中3只用于抗肿瘤实验研究，5只用于生存期观察。7组分别给药(1)生理盐水(2)游离siklf4(3)游离muc1-car质粒(4)游离shklf4-muc1-car重组质粒(5)mca包载的siklf4(6)mca包载的muc1-car质粒(7)nano-porter。给药时间为day4、8、12、16、20、24。给药剂量为pdna 1.2mg/kg。day 28处死小鼠，取肿瘤进行抗肿瘤效果评估。生存期考察至60天。
107.图5为不同治疗组下小鼠胰腺癌肿瘤生长情况。其中，nano-porter组收集的肿瘤体积最小，表明nano-porter组抗肿瘤效果最好，单独使用mca包载的siklf4或mca包载的muc1-car重组质粒均有一定的抗肿瘤效果，但是效果不如nano-porter组。游离siklf4组/游离muc1-car质粒组/游离shklf4-muc1-car重组质粒治疗效果不明显，推测是核酸药物缺乏mca的保护而在循环过程中降解所导致。
108.图6为不同治疗组下小鼠生存期考察。其中，nano-porter组小鼠整体生存率更高，截止60天时生存率达60％；单独使用mca包载的muc1-car重组质粒截止60天时生存率可达40％；而其他组截止60天时生存率为0％，说明仅调控巨噬细胞的表型远远不够，muc1-car-m所激活的后续适应性免疫是促进肿瘤缓解的关键因素。
109.11、流式细胞术检测t淋巴细胞激活和记忆细胞分化情况
110.从hmuc1-tg荷瘤小鼠采集肿瘤组织，切成小块，添加dna酶、胶原酶、透明质酸酶在37℃的细胞培养液中消化2h，经过70mm细胞滤器过滤后制备单细胞悬液。采用anti-mcd3-fitc、anti-mcd4-pe/dazzle 594、anti-mcd8α-brilliant violet 650、anti-mcd44-percp-cy5.5和anti-mcd62l-apc-cy7检测t淋巴细胞的活化和分化情况。
111.图7为流式细胞术测定小鼠肿瘤组织中cd4

和cd8
t细胞激活情况。
112.图8为流式细胞术测定小鼠肿瘤组织中cd4
t细胞所分化的中央记忆t细胞(t
cm
)和效应记忆t细胞(t
em
)的表达情况。
113.图9为流式细胞术测定小鼠肿瘤组织中cd8
t细胞所分化的中央记忆t细胞(t
cm
)和效应记忆t细胞(t
em
)的表达情况。
114.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。