用于婴儿恶性骨硬化病的基因治疗载体的制作方法

技术特征：
1.一种转移质粒，包含表达盒，所述表达盒包含编码t细胞免疫调节因子1(tcirg1)或其功能性变体的同源异构体的编码多核苷酸和启动子，其中所述多核苷酸可操作地连接到所述启动子，并且其中所述转移质粒包含rna-out阻遏物和cmv ie启动子。2.根据权利要求1所述的转移质粒，其中所述rna-out阻遏物与seq id no:32具有至少95％的同一性或至少99％的同一性。3.根据权利要求1或权利要求2所述的转移质粒，其中所述cmv ie启动子与seq id no:33具有至少95％的同一性或至少99％的同一性。4.根据权利要求1至3中任一项所述的转移质粒，其中所述转移质粒包含pccl骨架。5.根据权利要求4所述的转移质粒，其中所述pccl骨架包含所述rna-out阻遏物。6.根据权利要求5所述的转移质粒，其中所述转移质粒与seq id no:39具有至少95％或100％的同一性。7.根据权利要求1至7中任一项所述的转移质粒，其中所述启动子是efs启动子。8.根据权利要求7所述的转移质粒，其中所述efs启动子与seq id no:2具有至少95％的同一性。9.根据权利要求8所述的转移质粒，其中所述efs启动子是seq id no:2。10.根据权利要求1至9中任一项所述的转移质粒，其中所述编码多核苷酸与seq id no:3具有至少95％的同一性。11.根据权利要求10所述的转移质粒，其中所述编码多核苷酸与seq id no:3具有至少99％的同一性。12.根据权利要求11所述的转移质粒，其中所述编码多核苷酸是seq id no:3。13.根据权利要求1至12中任一项所述的转移质粒，其中所述表达盒包含土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)。14.根据权利要求13所述的转移质粒，其中所述wpre是seq id no:4。15.根据权利要求1至14中任一项所述的转移质粒，其中所述表达盒与seq id no:1具有至少95％的同一性。16.根据权利要求1至15中任一项所述的转移质粒，其中所述表达盒的两侧是5'长末端重复序列(ltr)和3'ltr。17.根据权利要求16所述的转移质粒，其中所述5'ltr是seq id no:34和/或所述3'ltr是seq id no:28。18.根据权利要求1至17中任一项所述的转移质粒，其中所述表达盒与seq id no:1具有至少95％的同一性。19.根据权利要求1至17中任一项所述的转移质粒，其中所述表达盒是seq id no:1。20.一种慢病毒颗粒，通过用权利要求1至20中任一项所述的转移质粒转染宿主细胞而产生。21.一种表达盒，包含编码t细胞免疫调节因子1(tcirg1)或其功能性变体的同源异构体的编码多核苷酸和efs启动子，其中所述多核苷酸可操作地连接到所述efs启动子。22.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述编码多核苷酸与seq id no:3具有至少95％的同一性。23.根据权利要求2所述的表达盒，其中所述编码多核苷酸与seq id no:3具有至少
99％的同一性。24.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述编码多核苷酸是seq id no:3。25.根据权利要求1至4中任一项所述的表达盒，其中所述efs启动子与seq id no:2具有至少95％的同一性。26.根据权利要求25所述的表达盒，其中所述efs启动子是seq id no:2。27.根据权利要求21至26中任一项所述的表达盒，包含土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)。28.根据权利要求27所述的表达盒，其中所述wpre是seq id no:4。29.根据权利要求21至28中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒与seq id no:1具有至少95％的同一性。30.根据权利要求29所述的表达盒，其中所述表达盒是seq id no:1。31.一种重组慢病毒基因组，按5'到3'顺序包含：(a)慢病毒5'长末端重复序列(ltr)；(b)权利要求21至30中任一项所述的表达盒；和(c)慢病毒3’ltr，其中所述重组慢病毒基因组不能复制。32.一种转移质粒，包含权利要求31所述的重组慢病毒基因组。33.一种慢病毒颗粒，包含权利要求31所述的重组慢病毒基因组。34.一种药物组合物，包含权利要求33所述的慢病毒颗粒。35.一种经修饰的细胞，包含权利要求21至30中任一项所述的表达盒。36.一种经修饰的细胞，包含权利要求31所述的重组慢病毒基因组。37.根据权利要求36所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞缺乏内源性功能性tcirg1基因。38.根据权利要求36或37所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞源自患有或疑似患有婴儿恶性骨硬化病(imo)的受试者。39.根据权利要求36至38中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞表达tcirg1或其功能性变体，表达水平类似于在具有功能性tcirg1基因的破骨细胞中观察到的tcirg1表达水平。40.根据权利要求36至39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞表达tcirg1或其功能性变体，表达水平类似于在源自未患有或未疑似患有imo的受试者的破骨细胞中观察到的tcirg1表达水平。41.根据权利要求36至40中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞是造血干细胞(hsc)。42.根据权利要求36至41中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞是cd34 祖细胞。43.根据权利要求41或42中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞源自通过单采术从患有或疑似患有imo的受试者分离的hsc，任选在通过施用g-csf、plerifaxor，或g-csf和plerifaxor的组合动员hsc之后。44.根据权利要求35至43中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞源自
通过磁捕获富集cd34 细胞的细胞群。45.一种药物组合物，包含权利要求35至44中任一项所述的经修饰的细胞。46.一种修饰患有或疑似患有imo的受试者的一种或多种细胞的体外方法，包括：(a)通过向所述受试者施用包含g-csf、plerifaxor或g-csf和plerifaxor的组合的组合物，提供从所述受试者动员的外周血单核细胞(pbmc)；(b)通过磁分离富集cd34 细胞的所述pbmc以产生富集cd34的细胞群；和(c)将所述富集cd34的细胞与包含重组慢病毒基因组的慢病毒颗粒接触，所述重组慢病毒基因组按5'到3'顺序包含：(i)慢病毒5’长末端重复序列(ltr)；(ii)权利要求21至30中任一项所述的表达盒；和(iii)慢病毒3’ltr，其中所述重组慢病毒基因组不能复制。47.一种治疗患有或疑似患有婴儿恶性骨硬化病(imo)受试者的imo的方法，包括向所述受试者施用权利要求35至44中任一项所述的经修饰的细胞或权利要求45所述的药物组合物。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法用表达tcirg1或其功能性变体的经修饰的细胞重新填充hsc龛。49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述方法用表达tcirg1或其功能性变体的经修饰的细胞重新填充破骨细胞龛。50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述方法治疗、改善、预防、减少、抑制或缓解imo。51.根据权利要求47至50中任一项所述的方法，其中所述方法将接受治疗的受试者的平均总生存期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年。52.根据权利要求47至51中任一项所述的方法，其中所述方法防止所述受试者因imo死亡。53.根据权利要求47至52中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。54.根据权利要求47至53中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗前表现出imo的症状。55.根据权利要求47至54中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗前被鉴定为tcirg1表达降低或检测不到tcirg1表达。56.根据权利要求47至55中任一项所述的方法，其中所述受试者被鉴定为具有突变的tcirg1基因。57.根据权利要求47至56中任一项所述的方法，其中所述受试者是婴儿。58.根据权利要求47至57中任一项所述的方法，其中所述方法包括自体治疗。59.根据权利要求47至58中任一项所述的方法，其中通过静脉内输注进行施用。60.一种用于制备治疗或预防婴儿恶性骨硬化病(imo)的药物的重组慢病毒基因组，其中所述慢病毒基因组按5'至3'顺序包含：(i)慢病毒5’长末端重复序列(ltr)，(ii)权利要求21至30中任一项所述的表达盒，和
(iii)慢病毒3’ltr；和其中所述重组慢病毒基因组不能复制。61.一种用于制备治疗或预防婴儿恶性骨硬化病(imo)的药物的慢病毒颗粒，包含重组慢病毒基因组，其中所述慢病毒基因组按5'到3'的顺序包含：(i)慢病毒5’长末端重复序列(ltr)，(ii)权利要求21至50中任一项所述的表达盒，和(iii)慢病毒3’ltr；和其中所述重组慢病毒基因组不能复制。62.一种转移质粒，包含权利要求24至30任一项所述的表达盒。63.根据权利要求62所述的转移质粒，进一步包含rna-out序列。64.根据权利要求63所述的转移质粒，其中所述rna-out序列是seq id no:22。65.根据权利要求62或63所述的转移质粒，其中所述rna-out序列被配置为使得所述转移质粒能够在包装细胞系中稳定增殖。66.一种产生慢病毒颗粒的方法，包括：用权利要求1-19或权利要求62-65中任一项所述的转移质粒转化细菌细胞，使得所述转移质粒被复制；分离所复制的转移质粒；以及用所复制的转移质粒和任选的一种或多种另外的质粒转导包装细胞系，从而产生所述慢病毒颗粒。67.一种产生慢病毒颗粒的方法，包括：用权利要求1-19或权利要求62-65中任一项所述的转移质粒和任选的一种或多种另外的质粒转染包装细胞系；并培养所述包装细胞系。68.根据权利要求67所述的方法，其中所述转移质粒是稳定增殖的。69.根据权利要求68所述的方法，其中在30-37℃下使用摇瓶或发酵使所述转移质粒在细菌宿主中稳定增殖至少1、2、3、4、5、6或7天。70.一种慢病毒颗粒，根据权利要求66-69中任一项所述的方法产生。

技术总结
本公开提供了包含编码TCIRG1多肽或其功能性变体的多核苷酸序列的改进的基因治疗载体、其使用方法、药物组合物等。具体地，本公开提供用于治疗婴儿恶性骨硬化病(IMO)的慢病毒载体。载体。载体。


技术研发人员：B
受保护的技术使用者：太空飞船七有限责任公司
技术研发日：2020.05.22
技术公布日：2022/1/28