一种干细胞的保存运输方法与流程

1.本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种干细胞的保存运输方法。


背景技术：

2.干细胞是一类具有自我更新能力的细胞，是机体在发育过程中保留的未分化的原始细胞，能够产生某种特定组织类型的的子代细胞。干细胞在生命科学的细胞修复、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景，现已成为组织器官修复、研究基因功能、研究胚胎发育、基因治疗、筛选药物和制造疾病动物模型的强有力工具之一。
3.干细胞的保存是干细胞治疗技术的关键，因来源于哺乳类的细胞需在37℃的恒温以及适宜的湿度、氧气和二氧化碳浓度的条件下保存，长时间暴露在不适宜的培养条件中，细胞会逐渐失去活性，所以目前干细胞的保存方法还存在细胞活性易降低乃至死亡、培养基用量大和需在24小时内运输至使用单位等问题，如中国专利cn105543167a公开了一种骨髓干细胞的保存及运输方法，严重限制了干细胞治疗技术的应用。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提出一种干细胞的保存运输方法。
5.本发明所述一种干细胞的保存运输方法，包括以下步骤：
6.s1.从组织中分离出干细胞，用pbs缓冲液洗涤后，调整细胞密度至0.1～5
×
107个/ml，接入暂养培养基中培养3～6h，离心，弃上清，用基础培养基重悬细胞，调整细胞密度至0.1～5
×
105个/ml，得细胞悬液；
7.s2.将细胞悬液转移至保存容器中，加入保存液，吹打至混合均匀，排空空气，静置10～20min，进行冷冻处理，密封，将保存容器放入保温运输箱中进行运输；
8.s3.在运输结束后，在0～4℃的环境中，从细胞保温运输箱中取出保存容器，解封，加入复苏液，水平缓慢摇动保存容器，并升温至36～37℃，待保存容器中的物质完全融化后，离心，弃上清，加入暂养培养基，调整细胞密度至0.1～5
×
106个/ml。
9.进一步的，所述干细胞包括胚胎干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、骨髓干细胞和外周血干细胞中的任一种。
10.进一步的，所述暂养培养基，以dmem
‑
f12培养基为基础，包括：12～16g/l白蛋白、80～120mg/l谷氨酰胺、10～12mg/l卵磷脂、24～35μg/l bfgf、150～185mg/l丙酮酸钠、8.3～10.5g/l透明质酸、100～200u/ml青霉素和100～200μg/ml链霉素。
11.进一步的，所述离心为在1500～2000r/min离心3～6min。
12.进一步的，所述培养的温度为37℃，湿度为饱和湿度，二氧化碳浓度为5％。
13.进一步的，所述基础培养基为dmem培养基、mef培养基和es培养基中的任一种。
14.进一步的，所述保存液，包括：20～30g/l甘露醇、5～6g/l白蛋白、25～35ng/ml白细胞介素
‑
2、60～150ml/l二甲基亚砜、15～28mg/l磷脂酰丝氨酸、24.3～71.5mg/l棕榈酰辅酶a、1.1～1.5g/l海藻酸钠和0.37～0.59mg/l硝酸纤维素。
15.进一步的，所述保存液的用量为细胞悬液体积的0.7～1倍。
16.进一步的，所述冷冻处理的冷冻温程序为以0.5～1℃/min的速率降温至11～20℃，处理15～30min，再以1～2℃/min的速率降温至5～10℃，处理0.5～1h，最后以0.5～1℃/min的速率降温至0～4℃，处理5～10h。
17.进一步的，所述复苏液，包括：12～20μg/l bfgf、6～8u/ml异淀粉酶、160～180mg/l肝素钠和13～15ng/ml三碘甲状腺原氨酸。
18.进一步的，所述升温为以14～19℃/min的速率快速升温至36～37℃。
19.进一步的，所述运输的时间≦3d。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21.本发明提供的干细胞的保存运输方法，包括重悬干细胞、冷冻处理、运输和复苏四个部分，将干细胞接入暂养培养基中进行短时培养，再重悬细胞，使细胞均匀分布，再加入保存液进行冷冻处理后密封，可用保温运输箱进行运输，在运输至目的地后，加入复苏液后升温处理，使恢复细胞活性。
22.本发明先使用暂养培养基培养分离出的干细胞，再加入配制的保存液进行冷冻处理，能在0～4℃的条件下保存干细胞，再使用复苏液进行细胞复苏，恢复细胞活性，经过本发明方法处理后的细胞在保存后细胞活性高，复苏后的贴壁细胞比例高，细菌内毒素少，且无需进行超低温冻存处理，操作简单方便，对保存运输设备的要求低，在0～4℃的条件下可保存运输3天，可采用常规的长途运输。
具体实施方式
23.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
24.实施例1
25.一种干细胞的保存运输方法，包括以下步骤：
26.s1.从组织中分离出胚胎干细胞，用pbs缓冲液洗涤后，调整细胞密度至2.8
×
107个/ml，接入暂养培养基中，在37℃，饱和湿度，二氧化碳浓度为5％的条件下培养5h后，在2000r/min离心5min，弃上清，用dmem培养基重悬细胞，调整细胞密度至2.8
×
105个/ml，得细胞悬液；
27.所述暂养培养基，以dmem
‑
f12培养基为基础，包括：14g/l白蛋白、90mg/l谷氨酰胺、10mg/l卵磷脂、28μg/l bfgf、175mg/l丙酮酸钠、9.1g/l透明质酸、160u/ml青霉素和180μg/ml链霉素；
28.s2.将细胞悬液转移至保存容器中，加入细胞悬液体积0.8倍的保存液，吹打至混合均匀，排空空气，静置15min，以0.5℃/min的速率降温至20℃，处理30min，再以2℃/min的速率降温至6℃，处理1h，最后以1℃/min的速率降温至0～4℃，处理8h，密封，将保存容器放入保温运输箱中进行运输；
29.所述保存液，包括：28g/l甘露醇、5g/l白蛋白、32ng/ml白细胞介素
‑
2、100ml/l二甲基亚砜、22mg/l磷脂酰丝氨酸、32.5mg/l棕榈酰辅酶a、1.4g/l海藻酸钠和0.42mg/l硝酸纤维素；
30.s3.在运输结束后，在0～4℃的环境中，从细胞保温运输箱中取出保存容器，解封，加入复苏液，水平缓慢摇动保存容器，并以17℃/min的速率快速升温至37℃，待保存容器中
的物质完全融化后，2000r/min离心5min，弃上清，加入暂养培养基，调整细胞密度至2
×
106个/ml，检测细胞活性；
31.所述复苏液，包括：16μg/l bfgf、7u/ml异淀粉酶、165mg/l肝素钠和14ng/ml三碘甲状腺原氨酸。
32.实施例2
33.一种干细胞的保存运输方法，包括以下步骤：
34.s1.从组织中分离出干细胞，用pbs缓冲液洗涤后，调整细胞密度至0.1
×
107个/ml，接入暂养培养基中，在温度为37℃，湿度为饱和湿度，二氧化碳浓度为5％的条件下培养3h后，在1500r/min离心6min，弃上清，用dmem培养基重悬细胞，调整细胞密度至0.1
×
105个/ml，得细胞悬液；
35.所述暂养培养基，以dmem
‑
f12培养基为基础，包括：16g/l白蛋白、120mg/l谷氨酰胺、12mg/l卵磷脂、35μg/l bfgf、185mg/l丙酮酸钠、10.5g/l透明质酸、200u/ml青霉素和200μg/ml链霉素；
36.s2.将细胞悬液转移至保存容器中，加入细胞悬液体积1倍的保存液，吹打至混合均匀，排空空气，静置10min，以1℃/min的速率降温至11℃，处理15min，再以1℃/min的速率降温至10℃，处理0.5h，最后以1℃/min的速率降温至0～4℃，处理5h，密封，将保存容器放入保温运输箱中进行运输；
37.所述保存液，包括：20g/l甘露醇、6g/l白蛋白、25ng/ml白细胞介素
‑
2、60ml/l二甲基亚砜、15mg/l磷脂酰丝氨酸、24.3mg/l棕榈酰辅酶a、1.1g/l海藻酸钠和0.37mg/l硝酸纤维素；
38.s3.在运输结束后，在0～4℃的环境中，从细胞保温运输箱中取出保存容器，解封，加入复苏液，水平缓慢摇动保存容器，并以14℃/min的速率快速升温至36℃，待保存容器中的物质完全融化后，1500～2000r/min离心3～6min，弃上清，加入暂养培养基，调整细胞密度至0.1～5
×
106个/ml，检测细胞活性；
39.所述复苏液，包括：12μg/l bfgf、6u/ml异淀粉酶、160mg/l肝素钠和13ng/ml三碘甲状腺原氨酸。
40.实施例3
41.一种干细胞的保存运输方法，包括以下步骤：
42.s1.从组织中分离出间充质干细胞，用pbs缓冲液洗涤后，调整细胞密度至5
×
107个/ml，接入暂养培养基中，在温度为37℃，湿度为饱和湿度，二氧化碳浓度为5％的条件下培养6h后，在2000r/min离心5min，弃上清，用es培养基重悬细胞，调整细胞密度至5
×
105个/ml，得细胞悬液；
43.所述暂养培养基，以dmem
‑
f12培养基为基础，包括：12g/l白蛋白、80mg/l谷氨酰胺、10mg/l卵磷脂、24μg/l bfgf、150mg/l丙酮酸钠、8.3g/l透明质酸、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素；
44.s2.将细胞悬液转移至保存容器中，加入细胞悬液体积0.8倍的保存液，吹打至混合均匀，排空空气，静置20min，以0.5℃/min的速率降温至15℃，处理30min，再以2℃/min的速率降温至5℃，处理1h，最后以1℃/min的速率降温至0～4℃，处理10h，密封，将保存容器放入保温运输箱中进行运输；
45.所述保存液，包括：30g/l甘露醇、6g/l白蛋白、35ng/ml白细胞介素
‑
2、150ml/l二甲基亚砜、28mg/l磷脂酰丝氨酸、71.5mg/l棕榈酰辅酶a、1.5g/l海藻酸钠和0.59mg/l硝酸纤维素；
46.s3.在运输结束后，在0～4℃的环境中，从细胞保温运输箱中取出保存容器，解封，加入复苏液，水平缓慢摇动保存容器，并以19℃/min的速率快速升温至37℃，待保存容器中的物质完全融化后，2000r/min离心5min，弃上清，加入暂养培养基，调整细胞密度至5
×
106个/ml，检测细胞活性；
47.所述复苏液，包括：20μg/l bfgf、8u/ml异淀粉酶、180mg/l肝素钠和15ng/ml三碘甲状腺原氨酸。
48.实施例4
49.一种干细胞的保存运输方法，包括以下步骤：
50.s1.从组织中分离出胚胎干细胞，用pbs缓冲液洗涤后，调整细胞密度至2.8
×
107个/ml，接入暂养培养基中，在37℃，饱和湿度，二氧化碳浓度为5％的条件下培养5h后，在2000r/min离心5min，弃上清，用dmem培养基重悬细胞，调整细胞密度至2.8
×
105个/ml，得细胞悬液；
51.所述暂养培养基，以dmem
‑
f12培养基为基础，包括：14g/l白蛋白、90mg/l谷氨酰胺、10mg/l卵磷脂、28μg/l bfgf、175mg/l丙酮酸钠、9.1g/l透明质酸、160u/ml青霉素和180μg/ml链霉素；
52.s2.将细胞悬液转移至保存容器中，加入细胞悬液体积0.8倍的保存液，吹打至混合均匀，排空空气，静置15min，以0.5℃/min的速率降温至20℃，处理30min，再以2℃/min的速率降温至6℃，处理1h，最后以1℃/min的速率降温至0～4℃，处理8h，密封，将保存容器放入保温运输箱中进行运输；
53.所述保存液，按体积百分比计，包括：20％二甲基亚砜和80％tce；
54.s3.在运输结束后，在0～4℃的环境中，从细胞保温运输箱中取出保存容器，解封，加入复苏液，水平缓慢摇动保存容器，并以17℃/min的速率快速升温至37℃，待保存容器中的物质完全融化后，2000r/min离心5min，弃上清，加入暂养培养基，调整细胞密度至2
×
106个/ml，检测细胞活性；
55.所述复苏液，包括：16μg/l bfgf、7u/ml异淀粉酶、165mg/l肝素钠和14ng/ml三碘甲状腺原氨酸。
56.实施例5
57.一种干细胞的保存运输方法，包括以下步骤：
58.s1.从组织中分离出胚胎干细胞，用pbs缓冲液洗涤后，调整细胞密度至2.8
×
107个/ml，接入暂养培养基中，在37℃，饱和湿度，二氧化碳浓度为5％的条件下培养5h后，在2000r/min离心5min，弃上清，用dmem培养基重悬细胞，调整细胞密度至2.8
×
105个/ml，得细胞悬液；
59.所述暂养培养基，以dmem
‑
f12培养基为基础，包括：14g/l白蛋白、90mg/l谷氨酰胺、10mg/l卵磷脂、28μg/l bfgf、175mg/l丙酮酸钠、9.1g/l透明质酸、160u/ml青霉素和180μg/ml链霉素；
60.s2.将细胞悬液转移至保存容器中，加入细胞悬液体积0.8倍的保存液，吹打至混
合均匀，排空空气，静置15min，以0.5℃/min的速率降温至20℃，处理30min，再以2℃/min的速率降温至6℃，处理1h，最后以1℃/min的速率降温至0～4℃，处理8h，密封，将保存容器放入保温运输箱中进行运输；
61.所述保存液，包括：28g/l甘露醇、5g/l白蛋白、32ng/ml白细胞介素
‑
2、100ml/l二甲基亚砜、22mg/l磷脂酰丝氨酸、32.5mg/l棕榈酰辅酶a、1.4g/l海藻酸钠和0.42mg/l硝酸纤维素；
62.s3.在运输结束后，在0～4℃的环境中，从细胞保温运输箱中取出保存容器，解封，加入dmem
‑
f12培养基，水平缓慢摇动保存容器，并以17℃/min的速率快速升温至37℃，待保存容器中的物质完全融化后，2000r/min离心5min，弃上清，加入暂养培养基，调整细胞密度至2
×
106个/ml，检测细胞活性；
63.所述复苏液，包括：16μg/l bfgf、7u/ml异淀粉酶、165mg/l肝素钠和14ng/ml三碘甲状腺原氨酸。
64.实施例6
65.一种干细胞的保存运输方法，包括以下步骤：
66.s1.从组织中分离出胚胎干细胞，用pbs缓冲液洗涤后，调整细胞密度至2.8
×
107个/ml，接入多能干细胞培养基中，在37℃，饱和湿度，二氧化碳浓度为5％的条件下培养5h后，在2000r/min离心5min，弃上清，用dmem培养基重悬细胞，调整细胞密度至2.8
×
105个/ml，得细胞悬液；
67.s2.将细胞悬液转移至保存容器中，加入细胞悬液体积0.8倍的保存液，吹打至混合均匀，排空空气，静置15min，以0.5℃/min的速率降温至20℃，处理30min，再以2℃/min的速率降温至6℃，处理1h，最后以1℃/min的速率降温至0～4℃，处理8h，密封，将保存容器放入保温运输箱中进行运输；
68.所述保存液，包括：28g/l甘露醇、5g/l白蛋白、32ng/ml白细胞介素
‑
2、100ml/l二甲基亚砜、22mg/l磷脂酰丝氨酸、32.5mg/l棕榈酰辅酶a、1.4g/l海藻酸钠和0.42mg/l硝酸纤维素；
69.s3.在运输结束后，在0～4℃的环境中，从细胞保温运输箱中取出保存容器，解封，加入复苏液，水平缓慢摇动保存容器，并以17℃/min的速率快速升温至37℃，待保存容器中的物质完全融化后，2000r/min离心5min，弃上清，加入暂养培养基，调整细胞密度至2
×
106个/ml，检测细胞活性；
70.所述复苏液，包括：16μg/l bfgf、7u/ml异淀粉酶、165mg/l肝素钠和14ng/ml三碘甲状腺原氨酸。
71.实施例7
72.一种干细胞的保存运输方法，包括以下步骤：
73.s1.从组织中分离出胚胎干细胞，用pbs缓冲液洗涤后，调整细胞密度至2.8
×
107个/ml，接入暂养培养基中，在37℃，饱和湿度，二氧化碳浓度为5％的条件下培养5h后，在2000r/min离心5min，弃上清，用dmem培养基重悬细胞，调整细胞密度至2.8
×
105个/ml，得细胞悬液；
74.所述暂养培养基，以dmem
‑
f12培养基为基础，包括：14g/l白蛋白、90mg/l谷氨酰胺、10mg/l卵磷脂、28μg/l bfgf、175mg/l丙酮酸钠、9.1g/l透明质酸、160u/ml青霉素和180
μg/ml链霉素；
75.s2.将细胞悬液转移至保存容器中，加入细胞悬液体积0.8倍的保存液，吹打至混合均匀，排空空气，静置15min，以0.5℃/min的速率降温至20℃，处理30min，再以2℃/min的速率降温至6℃，处理1h，最后以1℃/min的速率降温至0～4℃，处理8h，密封，将保存容器放入保温运输箱中进行运输；
76.所述保存液，包括：28g/l甘露醇、5g/l白蛋白、32ng/ml白细胞介素
‑
2、100ml/l二甲基亚砜、22mg/l磷脂酰丝氨酸、32.5mg/l棕榈酰辅酶a、1.4g/l海藻酸钠和0.42mg/l硝酸纤维素；
77.s3.在运输结束后，在0～4℃的环境中，从细胞保温运输箱中取出保存容器，解封，水平缓慢摇动保存容器，并以17℃/min的速率快速升温至37℃，待保存容器中的物质完全融化后，2000r/min离心5min，弃上清，加入暂养培养基，调整细胞密度至2
×
106个/ml，检测细胞活性。
78.实施例8
79.一种干细胞的保存运输方法，包括以下步骤：
80.s1.从组织中分离出胚胎干细胞，用pbs缓冲液洗涤后，调整细胞密度至2.8
×
107个/ml，接入暂养培养基中，在37℃，饱和湿度，二氧化碳浓度为5％的条件下培养5h后，在2000r/min离心5min，弃上清，用dmem培养基重悬细胞，调整细胞密度至2.8
×
105个/ml，得细胞悬液；
81.所述暂养培养基，以dmem
‑
f12培养基为基础，包括：14g/l白蛋白、90mg/l谷氨酰胺、10mg/l卵磷脂、28μg/l bfgf、175mg/l丙酮酸钠、9.1g/l透明质酸、160u/ml青霉素和180μg/ml链霉素；
82.s2.将细胞悬液转移至保存容器中，加入细胞悬液体积0.8倍的保存液，吹打至混合均匀，排空空气，静置15min，以1℃/min的速率降温至10℃，处理1h，再以2℃/min的速率降温至
‑
10℃，处理10h，最后以1℃/min的速率降温至
‑
80℃，处理8h后，密封，投入液氮中保存，将保存容器放入冻存细胞运输箱中进行运输；
83.所述保存液，包括：28g/l甘露醇、5g/l白蛋白、32ng/ml白细胞介素
‑
2、100ml/l二甲基亚砜、22mg/l磷脂酰丝氨酸、32.5mg/l棕榈酰辅酶a、1.4g/l海藻酸钠和0.42mg/l硝酸纤维素；
84.s3.在运输结束后，在0～4℃的环境中，从细胞保温运输箱中取出保存容器，解封，加入复苏液，水平缓慢摇动保存容器，并以17℃/min的速率快速升温至37℃，待保存容器中的物质完全融化后，2000r/min离心5min，弃上清，加入暂养培养基，调整细胞密度至2
×
106个/ml，检测细胞活性；
85.所述复苏液，包括：16μg/l bfgf、7u/ml异淀粉酶、165mg/l肝素钠和14ng/ml三碘甲状腺原氨酸。
86.分别在保存第24h、48h和72h测定实施例1～8的细胞活性，结果见表1；
87.细胞活性采用台盼蓝染色法计数测定；
[0088][0089]
表1
[0090][0091][0092]
由表1可知，采用本发明的方法保存干细胞后，在运输24h、48h和72h后细胞活性的变化不明显，实施例1～3的细胞活性均大于98％，实施例4～8的细胞活性均大于95％，说明本发明的方法可以较好的保存细胞活性。
[0093]
实施例4～6与实施例1相比，表明本发明的暂养培养基、保存液和复苏液配合使用，保存细胞的效果好。
[0094]
实施例7～8与实施例1相比，表明本发明的复苏方法和冷冻处理方法，处理后的细胞活性较高。
[0095]
在保存72h后，计算实施例1～3的细胞贴壁率，并检测细菌内毒素，结果见表2；
[0096]
细胞贴壁率的测定方法：将复苏后的干细胞接种于dmem培养基中，在37℃、5％co2、饱和湿度的条件下进行传代培养，培养三代后，用结晶紫染色计数；
[0097]
细菌内毒素的测定方法：将复苏后的干细胞接种于dmem培养基中，在37℃、5％co2、饱和湿度的条件下进行培养12h后，2000r/min离心5min，取上清，以2λ浓度的内毒素标准溶液为阳性对照，按《中国药典四部》(2020版)1143细菌内毒素检查法中的“凝胶法”进行；
[0098][0099]
表2
[0100][0101][0102]
由表2可知，本发明保存运输的干细胞在复苏后的细胞贴壁率高，细菌内毒素呈阴性，说明按照本发明的保存运输方法处理的干细胞，细胞的活性好，安全性高。
[0103]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。