预测马体重减轻倾向的方法与流程

1.本发明属于预测马的潜在体重减轻的方法的领域。


背景技术：

2.存在于所有物种的胃肠道中的细菌在宿主的健康和全身代谢中发挥着基本作用，由此，能量平衡的破坏——如在肥胖症和相关代谢疾病中观察到的——与肠道微生物群的失调有关
1-4
。已经在人类
5,6
、狗7和(最近在)矮种马8中确定了肥胖症与肠道微生物组组成之间的关联。
3.马和矮种马已经适应了食用高纤维饮食，由此它们的中后肠内膳食纤维的微生物发酵产生挥发性脂肪酸(vfa)，包括乙酸、丙酸和丁酸，共同贡献了个体动物每日能量需求的很大一部分9。营养密集型能量供应的增加和缺乏运动，共同导致工业化国家休闲类马和矮种马肥胖症的高发，并且这是一个主要的福利问题
10-12
。已经确定，特定品种和类型的马和矮种马(包括本地和威尔士品种)比其他品种和类型患肥胖症的风险更高，这表明了该物种中肥胖症发展的重要遗传组分。和对于人一样，并非所有马和矮种马在被置于限制能量的饮食(例如以体质量(body mass，bm)的1.25％作为每日干物质(dry matter，dm))时体重都会以相同的速度减轻，并且有些需要进一步的限制(例如以1.0％bm作为每日dm)以引起预期的bm降低
13
。
4.迄今为止，评估马肠道微生物组的研究通常集中在饮食的影响上
14
–
16
。此外，已对粪便微生物组和慢性蹄叶炎(chronic laminitis)
17
及马代谢综合征(equine metabolic syndrome，ems)
18
之间的关联进行了评估。尽管尚未有研究描述矮种马体重减轻后粪便微生物组组成中的变化，但有两项研究评估了随着时间推移多组马和矮种马中粪便微生物组的稳定性。在体重减轻试验结束后的6周期间内，已经确定一组马中65％的粪便细菌群落在不同的时间点之间保持不变
19
，而且最近，在牧场饲养的一小群马中评估了马粪便微生物组在52周期间内的稳定性。因此，我们有一些证据表明，马肠道微生物组受饮食和不同疾病状态的影响。此外，最近，对年龄和肥胖症对马粪便微生物组的影响作了为期2年的评估，发现了主要与肥胖状态相关的变化8。
5.因此，有证据表明，马肠道微生物组受饮食和不同疾病/代谢状态的影响8。然而，本领域仍然需要能够预测马体重减轻倾向的方法，从而允许马主人进行适当的卡路里限制。


技术实现要素：

6.本发明的发明人已开发出能够预测马属(equus)动物体重减轻倾向的方法。这是通过对从动物获得的样本(例如粪便、血液或尿液样本)中的各种标记物进行评估来实现的。这些包括，例如，发酵产物和/或其代谢物，如挥发性脂肪酸(vfa)，以及细菌种群多样性指标，和/或特定细菌分类群的丰度(和/或相对丰度)。本发明的方法能够预测可能的体重减轻，如实施例中所示，并且在某些实施方式中，本发明的方法能够用于对经过卡路里限制
期后的初始体质量减轻进行定量预测。
7.因此，一方面，本发明提供了预测马属(equus)动物体重减轻的方法，包括测量从动物获得的样本中的一种或多种发酵产物和/或其代谢物(如一种或多种vfa)的浓度；其中一种或多种发酵产物和/或其代谢物(如一种或多种vfa)的浓度与预测的动物体重减轻呈正相关。例如，发明人发现，在卡路里限制期之前的乙酸、丁酸、丙酸和支链vfa的浓度在随后体重减轻更多的动物中更高(参见实施例1；图9)。例如，发现至少12mm的乙酸浓度是良好体重减轻倾向的准确预测指标。例如，发明人已经发现，此类动物在为期7周的卡路里限制期后能够减轻至少8％的初始体质量(参见图10)。因此，这些标记物提供了预测马体重减轻倾向的手段。
8.另一方面，本发明提供了预测马属(equus)动物体重减轻的方法，包括对从动物获得的样本中的多个细菌分类群进行检测和/或定量，并计算样本中存在的细菌种群的多样性度量；其中，该多样性度量与预测的动物体重减轻呈负相关。发明人发现，在卡路里限制期之前的细菌种群的特定多样性度量(逆-辛普森(inverse-simpson)、香农-韦纳(shannon-weiner)和观察到的物种数量)在随后体重减轻更少的动物中更高(参见实施例1；图8)。因此，这些标记物提供了预测马体重减轻倾向的进一步手段。
9.另一方面，本发明提供了预测马属(equus)动物体重减轻的方法，包括量化从动物获得的标本中的(i)鳞球菌属(sphaerochaeta)细菌，和/或(ii)密螺旋体属(treponema)细菌，和/或(iii)厌氧菌属(anaerovorax)细菌和/或(iv)mobilitalea属细菌，和/或(v)放线菌门(actinobacteria)细菌，和/或(vi)螺旋体门(spirochaetes)细菌，和/或(vii)纤维发酵细菌(如纤维杆菌属(fibrobacter)细菌)的丰度和相对丰度；其中，所述细菌的丰度和/或相对丰度与预测的动物体重减轻呈负相关。发明人发现，在卡路里限制期之前，此类细菌的丰度/相对丰度在随后体重减轻更少的动物中更高(参见实施例1和2；图12-14)。因此，这些进一步的标记物提供了预测马体重减轻倾向的进一步方法。
10.在本发明的上述方面中使用的标记物可以单独或组合使用，作为体重减轻预测指标。这些不同标记物的组合可以提高本发明方法的预测能力。
附图说明
11.图1多层柱状图示出了在饮食限制之前(规定饮食前)和饮食限制7周后(规定饮食后；n＝15)的优势细菌门(含量》0.05％)的相对丰度。
12.图2多层柱状图示出了在饮食限制之前(规定饮食前)和饮食限制7周后(规定饮食后；n＝15)的优势细菌属(含量》0.05％)的相对丰度。
13.图3基于距离的冗余分析示出了可归于体重减轻组(n＝15)的初始细菌群落的结构。
14.图4得到的边际均值图显示了预测的在本研究(n＝15)的7周规定饮食限制期间的体质量变化。阴影区域＝95％置信区间。
15.图5预测的个体动物在本研究的7周规定饮食限制期间(调整到第0周；n＝15)的累积的成比例的体重减轻。
16.图6描绘动物内的粪便细菌微生物组聚集的系谱树(phylogenetic tree)(n＝15)。
17.图7稀疏曲线。
18.图8边际均值图示出了预测的与以下初始多样性指数成比例的体重减轻的变化：(a)观察到的物种，(b)香农-韦纳，(c)逆辛普森。阴影区域对应于95％ci。n＝15。
19.图9边际均值图示出了预测的与以下初始vfa的浓度成比例的体重减轻的变化：(a)乙酸(acetate)，(b)丙酸(propionate)，(c)丁酸(butyrate)，(d)支链挥发性脂肪酸(branched chained volatile fatty acid，bcvfa)。阴影区域对应于95％ci。n＝15。
20.图10初始乙酸浓度的受试者工作特征(roc)曲线作为体重减轻≥8％的动物的预测指标。在12mm乙酸的最佳截止值(optimal cut-off)下，灵敏性为88.9％，而特异性为100％。
21.图11根据ancom分析，在初始乙酸浓度划分的四分位组中的鳞球菌属(spharerochaeta)的初始丰度(1＝低浓度；4＝高浓度)。n＝15。
22.图12根据ancom分析，体重减轻组之间的放线菌门(actinobacteria)的初始丰度(1＝低浓度；4＝高浓度)。n＝15。
23.图13根据ancom分析，体重减轻组之间的mobilitalea菌属的初始丰度。n＝15。
24.图14基于距离的冗余分析示出了低-体重减轻组、中-体重减轻组和高-体重减轻组中个体动物的初始细菌群落的结构与初始粪便vfa浓度之间的关联。n＝15。
25.发明公开
26.马
27.本发明的方法能够用于预测马属(equus)动物的体重减轻。
28.该属是马科(equidae)的一部分，其中包括许多现存和灭绝的物种。马属(equus)物种包括马(equus caballus)、骡(equus mulus)、驴骡、野马(equus ferus)、山斑马(equus zebra)、非洲野驴(equus africanus)、家驴(equus africanus asinus)、细纹斑马(equus grevyi)、亚洲野驴(equus hemionus)、西藏野驴(equus kiang)和平原斑马(equus quagga)。优选地，该动物为马(equus caballus)物种，包括马和矮种马，并且更优选地，该动物为矮种马。马(equus caballus)物种的动物可以处于任何年龄、性别或阉割状态，并且因此本发明可用于评估(但不限于)马驹(foal)、断奶驹(weanling)、一岁崽(yearling)、小马(colt)、小母马(fillie)、母马(mare)、种马(stallion)、骟马(gelding)或安装索具的马(rig)。马属(equus)的任何和所有品种的动物，优选的为马(equus caballus)物种，可以使用本发明的方法对其进行评估。
29.优选地，对来自马属(equus)动物的样本执行本发明的方法，该动物在开始进行卡路里限制期之前至少超重。马的体重状况最好通过体况评分(body condition scoring，bcs)进行评估
20
，这是一种广泛使用的估计马和矮种马身体肥胖度的方法，其结合了多个身体部位(如颈部、马肩隆、腰部、尾基部、肋骨、肩部)的肉眼评定与皮下体脂触诊，通常以1-9分别对每个部位进行评分，然后计算总平均值。如本文中所用，“超重”优选地定义为bcs评分大于6/9(9分中的6分)的动物，“肥胖”优选地定义为大于7/9(9分中的7分)的动物。尽管bcs评分是评估体重状态/身体肥胖度的优选方法，但也可以使用技术人员可用的其他技术例如氧化氘稀释和生物电阻抗分析。
30.体重减轻
31.如本领域公知的，“体重减轻(weight loss)”指体质量的减少。在本发明的背景
下，体重减轻指马属(equus)动物的体质量减少(例如响应于诸如卡路里限制等饮食变化和/或增加运动)。优选地，本发明的方法用于预测响应于卡路里限制的体重减轻(无论是否增加运动)。
32.体重减轻的速度将取决于许多因素，包括但不限于动物的初始体脂含量、卡路里限制的程度、应用卡路里限制的时间和季节。作为指导，被置于1.25％体质量的干物质(dm)的低卡路里饲料的饮食限制之后，从第二周起，良好的体重减轻速度应为≥0.4％体质量/周。在1％dm的低卡路里饲料的饮食限制下，从被置于饮食限制后的第二周起，良好的体重减轻速度可以是≥0.7％体质量/周。
33.在更冷的温度或在不利天气(雨/风)期间，由于动物消耗更多卡路里来维持体温，能够预计体重会减轻更多。因此，在更冷的温度期间(例如在冬季)，在1％dm的低卡路里饲料的饮食限制下，从被置于饮食限制后的第二周起，良好的体重减轻率应为≥0.9％体质量/周。
34.优选地，在低卡路里饮食开始后的第二周和第十周之间检测这种体重减轻。这是为了将由于肠道填充(gut fill)的潜在减少而导致的初始体重大幅减轻纳入考虑范围。此外，发明人已经发现，在进行喂食限制的10-12周左右，体重减轻速度趋于降低，在该时间点，如需实现进一步的体重减轻，可能需要增加运动量(如可能)和/或(考虑到动物的生理和行为要求)如果可能的话，进一步减少卡路里摄入量。
35.卡路里限制通常指与动物可以任意自由进食时相比，动物的卡路里摄入量的减少。如本文中所用的，用于体重管理目的的卡路里限制可被定义为马属(equus)动物平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.50％、1.25％、1.20％、1.15％、1.10％、1.05％或1.00％。优选地，卡路里限制被定义为马属(equus)动物平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.50％、1.25％或1.10％，更优选地低于1.25％或1.10％，例如约1％。优选地，如本文中所指，“干物质”包含纤维材料(并且更优选地基本上由其组成，或由其组成)，例如制存草料(preserved grass)，如干草或干草替代品(优选地，出于营养目的，添加低卡路里维生素/矿物质和蛋白质平衡剂)。在这些实施例中，卡路里限制是通过每天饲喂约1.0％体质量的干物质(如干草)并添加平衡剂来实现的(参见“材料和方法”)。根据实施例，在卡路里限制期间，应该不限制水的供应。在卡路里限制期内还建议进行基础水平的运动，可能是有组织的(例如骑乘、手牵着马行走或用驯马索训练(lunging)等)和非组织的(例如进入大型谷仓/饲养场/室内或室外学校或牧场，并适当佩戴口套以防止或限制摄食)，包括每天放牧，优选地，根据实施例进行至少30分钟的自由运动(参见“材料和方法”)。由于兽医或行为原因，某些动物可能无法在执行卡路里限制方案的全部或部分时间内进行有组织的或非组织的运动。
36.为确保充分的体重减轻，卡路里限制期可能需要维持至少4、6、8、10、12、14或16周。优选地，卡路里限制期将维持至少6或7周，并且更优选地，至少7周(根据实施例)。也可以循环进行多个卡路里限制期，例如通过在限定的周数内限制卡路里摄入，监测由此引起的体重减轻，并且然后在适当时再次进行限制。时间段可以指连续的或合计的时间段，但优选地指连续的时间段。
37.通过本发明的方法获得有关马属(equus)动物体重减轻的预测后，则马主人可以在给定时间段内根据所需减轻的体重，调整马属(equus)动物的饮食和/或运动水平(特别
是饮食)。例如，可以将预测的体重减轻减少的动物置于卡路里限制更高的规定饮食中(例如，每天约1％体质量的干物质)，或比原计划持续更长的时间，以确保达到所需的体重减轻。相反，可以将预测的体重减轻过多的动物置于卡路里限制更低的饮食中或比原计划持续更短的时间(例如，每天约1.5％体质量的干物质，或约1％但持续时间相对较短，例如《10周)。这有利于避免不必要的健康和行为风险，如高脂血症(对驴和妊娠母马进行任何卡路里限制时，需要特别小心)以及觅食替代行为，如咬槽咽气癖/非咬物咽气癖。因此，本发明在以下方面很有用：考虑到个体之间存在的体重减轻倾向的差异，确保马属(equus)动物被置于尽可能合适的规定饮食方案中以达到所需的体重减轻水平
13
。
38.发酵产物和/或其代谢物作为体重减轻预测指标
39.根据本发明的一方面，从马属动物获得的样本中的一种或多种发酵产物和/或其代谢物的浓度被用作体重减轻预测指标，优选地指响应于卡路里限制的体重减轻。如实施例中所示，多种发酵产物(特别是vfa)和/或其代谢物的初始浓度与随后的体重减轻呈正相关。“正相关”是指所述浓度与随后的体重减轻之间存在正相关性(参见图9为例)，或者换言之，样本中的发酵产物和/或其代谢物的浓度更高，预示着随后的的体重减轻更多(相比于更低的浓度)，且反之亦然。通常可以预期，在同等饮食的情况下，与具有更低浓度的一种或多种发酵产物和/或其代谢物的动物相比，样本中显示的一种或多种发酵产物和/或其代谢物浓度更高的动物体重减轻得更快。此外或备选地，可以预期，在同等饮食的情况下，与具有更低浓度的一种或多种发酵产物和/或其代谢物的动物相比，具有更高浓度的一种或多种发酵产物和/或其代谢物的动物在相同的时间跨度内体重减轻得更多。
[0040]“发酵产物”指所有摄入的饲料在动物胃肠道中由共生菌发酵的分解产物。此类饲料包括碳水化合物(carbohydrate)，例如纤维素、半纤维素和果胶(pectin)，但也包括淀粉和可溶于水的碳水化合物。“其代谢物”指此类发酵产物的代谢产物，例如在动物的胃肠道或肝脏中产生的。可根据本发明的方法测量的发酵产物和/或其代谢物包括但不限于：挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，vfa)，例如乙酸(acetate)、丁酸(butyrate)、丙酸(propionate)或支链vfa(包括，例如，异丁酸(isobutyrate)、异戊酸(isovalerate)或2-甲基丁酸(2-methybutyrate))；细菌发酵中的vfa的前体，例如乳酰辅酶a(lactyl coa)、丙烯酰辅酶a(acrylyl coa)、丙酰辅酶a(propionyl coa)、丙酮酸(pyruvate)、乙酰辅酶a(acetyl coa)、乙酰磷酸(acetyl phosphate)、丁酰辅酶a(butyryl coa)、巴豆酰辅酶a(crotonyl coa)、β-oh丁酰辅酶a；和vfa的代谢产物，例如乙酰乙酸(acetoacetate)、β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate)、巴豆酰辅酶a，l-β-羟基丁酸酰辅酶a(l-β-hydroxybutyryl coa)和d-β-羟基丁酸酰辅酶a(d-β-hydroxybutyryl coa)、乳酸(lactate)、丙酰辅酶a(propionyl coa)、乙酰辅酶a和丙二酰辅酶a(malonyl coa)。
[0041]
具有更低的体重减轻倾向的马属(equus)动物具有更多样化的初始肠道微生物组组成(如以下详述并在实施例中所证明的)。在不希望受理论束缚的情况下，此类动物可能具有更高的代谢效率，具有更强的发酵能力，并且因此在从胃肠道进入循环时对发酵产物(如vfa)和/或其代谢物的吸收更多(从而提高了它们在来自胃肠道的血液中的浓度)。因此，或此外，或可替代地，当饲喂限制纤维的规定饮食时，它们可能能够更好地增加纤维消化率，从而(与那些体重减轻更多的动物相比)在负向能量平衡的状态下提高代谢效率。这可能会在负向能量平衡期间限制甘油三酯储备的分解(从而限制体重减轻)。因此，在评估
血液或尿液样本的实施方式中，根据本发明评估的一种或多种发酵产物和/或其代谢物的浓度(如一种或多种vfa)可能与预测的动物体重减轻呈负相关。
[0042]
可以通过本领域已知的任何合适的方式对从动物获得的样本中的发酵产物和/或其代谢物的浓度进行测量，例如，在实施例中实施的气液色谱法。优选地，样本为粪便、血液或尿液样本(更优选地为粪便样本)，并且在实施例中提供了用于从粪便样本中提取发酵产物(如vfa)和/或其代谢物的示例性方案。确定每个样本的多于一种不同发酵产物和/或其代谢物(如多于一种不同的vfa)的浓度，例如至少2、3、4或5种，可以提高本发明方法的预测能力。
[0043]
优选地，如实施例中所分析的，在本发明的方法中评估的一种或多种发酵产物和/或其代谢物是一种或多种碳水化合物发酵产物，并且更优选地为一种或多种vfa。更优选地，一种或多种vfa选自由乙酸、丁酸、丙酸和/或支链vfa所组成的组。如实施例中所示，这些vfa的初始浓度与体重减轻呈现高度正相关(参见图9)。更优选地，vfa是乙酸，在实施例中分析的所有vfa中，其初始浓度与体重减轻表现出最强的正相关(positive correlation)。
[0044]
在一个特别优选的实施方式中，从动物获得的样本(优选地为粪便样本)中的乙酸浓度用于预测体重减轻。至少10mm的乙酸浓度表明动物具有可接受的体重减轻倾向。优选地，至少12mm的乙酸浓度预示良好的体重减轻倾向，例如，在12mm和20mm之间，或在12mm和15mm之间。高于20mm的乙酸浓度预示着非常好的体重减轻倾向。例如，本发明人已经表明，至少12mm的乙酸浓度预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8％的初始体质量，优选地，其中动物在至少7周内平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.10％。此乙酸浓度提供了88.9％的测试灵敏性和100％的特异性，用于预测如上定义的良好体重减轻倾向。在另一个特别优选的实施方式中，至少12mm的乙酸浓度预示着在卡路里限制期内每周至少减轻1.14％的初始体质量，优选地，其中动物平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.10％。
[0045]
在另一个优选的实施方式中，至少20mm的乙酸浓度(例如在20mm和25mm之间的乙酸)预示着快速的体重减轻，例如，经过卡路里限制期后，至少减轻8.5％的初始体质量；优选地，其中动物在至少7周内平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.10％。
[0046]
在其他优选的实施方式中，从动物获得的样本(优选地为粪便样本)中的丙酸浓度用于预测体重减轻。例如，至少4.0mm(例如在4.0mm和6.0mm之间)的丙酸浓度表明动物具有良好的体重减轻倾向。在此类实施方式中，(i)至少4.0mm(例如在4.0mm和6.0mm之间)的丙酸预示着经过卡路里限制期后，至少减轻7.5％的初始体质量，和/或(ii)至少5.0mm(例如在5.0mm和6.0mm之间)的丙酸预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8.0％的初始体质量。在其他优选的实施方式中，从动物获得的样本(优选地为粪便样本)中的丁酸浓度用于预测体重减轻。例如，至少1.5mm(例如在1.5mm和3.0mm之间)的丁酸浓度表明动物具有良好的体重减轻倾向。在此类实施方式中，(i)至少1.5mm(例如在1.5mm和3.0mm之间)的丁酸浓度预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8.0％的初始体质量，和/或(ii)至少2.0mm(例如在2.0mm和3.0mm之间)的丁酸浓度预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8.5％的初始体质量，和/或(iii)至少2.5mm(例如在2.5mm和3.0mm之间)的丁酸浓度预示着，经过卡路里限制期后，至少减轻9.0％的初始体质量。在其他优选实施方式中，从动物获得的样本(优选地为粪便样本)中的支链vfa浓度用于预测体重减轻。例如，至少为1.0mm(例如在1.0mm和2.0mm
之间)的支链vfa浓度表明动物具有良好的体重减轻倾向。在此类实施方式中，(i)至少1.0mm(例如在1.0mm和2.0mm之间)的支链vfa可能预示着经过卡路里限制期后，至少减轻7.5％初始体质量，和/或(ii)至少1.5mm(例如在1.5mm和2.0mm之间)的支链vfa预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8.0％初始体质量。在上述实施方式中，所述卡路里限制期优选地为至少7周，其中，动物平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.10％。
[0047]
在其他实施方式中，样本(优选地为粪便样本)中不同vfa的浓度比率可被用作体重减轻预测指标。例如，在另一个优选的实施方式中，样本中乙酸加丁酸的浓度总和与丙酸浓度的比率高于3.75:1，并且优选地在3.79:1-4.95:1的范围内，预示着动物具有良好的体重减轻倾向，例如，经过卡路里限制期后，至少减轻8.0％或至少减轻8.7％的初始体质量，优选地，其中动物在至少7周内平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.10％。在另一个优选的实施方式中，样本中乙酸加丁酸的浓度总和与丙酸浓度的比率高于3.75:1，且优选地在3.79:1-4.95:1的范围内，预示着在卡路里限制期内每周至少减轻1.25％的初始体质量，优选地，其中动物平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.10％。
[0048]
本领域技术人员将理解，在较长时间段内进行较低程度的卡路里限制预期可以产生相似水平的体重减轻。因此，在上述实施方式中(其中评估了乙酸、丁酸、丙酸或支链vfa的浓度或其比率)，所述卡路里限制期可替代地定义为至少8周、10周、12周、14周或16周或更多，其中，在所述限制期内，动物平均每天摄入的干物质分别少于其体质量的1.15％、1.20％、1.30％、1.40％或1.50％。
[0049]
发酵产物和/或其代谢物的浓度可以如上文详述单独地进行评估，或如下文详述与其他体重减轻预测指标(细菌种群多样性(bacterial population diversity)、细菌分类群(bacterial taxa)的丰度/相对丰度)组合进行评估。
[0050]
细菌种群多样性作为体重减轻预测指标
[0051]
根据本发明的另一方面，从马属(equus)动物获得的样本中的细菌种群的多样性度量被用作体重减轻预测指标，优选地指响应于卡路里限制体重减轻。如实施例中所示(参见实施例1)，多种多样性度量与随后的体重减轻呈负相关。“负相关”是指在所述多样性度量与随后的体重减轻之间存在负相关性(参见图8为例)，或者换言之，样本中细菌种群的多样性度量更低，预示着随后的体重减轻更多(相比于更高的多样性度量)，且反之亦然。通常可以预期，在同等饮食的情况下，与具有更低多样性度量(当评估相同度量时)的动物相比，在样本中显示出更高多样性度量的动物体重减轻更慢。此外或替代地，可以预期，在同等饮食的情况下，与具有更低多样性度量(当评估相同度量时)的动物相比，具有更高多样性度量的动物在相同的时间跨度内体重减轻得更少。
[0052]
细菌种群多样性度量可以通过以下方法进行计算，包括dna测序、rna测序、蛋白质序列同源性或使用指示细菌物种的其他生物标记物。优选地，使用dna测序，更优选地为16s rdna测序，如实施例中所执行的。例如，可以从样本中提取基因组dna，并使用16s rdna特异性引物通过定量pcr(qpcr)进行扩增，以创建dna文库，然后可以对其进行测序，如实施例中所执行的。从文库中获得的序列数据可用于计算多样性度量。示例性16s rdna特异性引物(如实施例中所用的)列示如下：
[0053]
正向引物：agagtttgatcctggctcag(seq id no:1)
[0054]
反向引物：acgagtgcgtctgctgcctyccgta(seq id no:2)
[0055]
在优选的实施方式中，计算的样本(优选地为粪便样本)中细菌种群的多样性度量是逆辛普森多样性、香农-韦纳多样性或样本中不同细菌物种的数量(又称为观察到的物种数量，或s.obs)。如实施例中所示，这些多样性度量与随后的体重减轻呈负相关(见图8)。不同多样性度量(优选地为以上所列度量)的组合也可用于提高预测的准确性。例如，以下指标均说明动物具有良好的体重减轻倾向：逆辛普森多样性小于70，优选地小于45(例如在10和70之间，优选地在10和45之间)，香农-韦纳多样性小于6.0，优选地小于5.3(例如在4.0和6.0之间，优选地在4.0和5.3之间)，以及观察到的物种数量少于1900，优选地少于1700(例如在1000和1900之间，优选地在1000和1700之间)。对每个样本计算一种以上不同的多样性度量，例如两种或三种此类度量，可以提高本发明方法的预测能力。
[0056]
根据公式(i)计算逆辛普森多样性：
[0057]
(i)1/∑pi2，其中，pi是属于物种i的个体的比例
[0058]
在优选实施方式中，计算所得的逆辛普森多样性小于(优选度从低到高)75、70、65、60、55、50、45、40、35或30(例如在10和70之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8％的初始体质量(或在卡路里限制期内每周至少减轻1.14％的体质量)；优选地，小于45、40、35或30(例如在10和45之间)，更优选地小于30(例如在10和30之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8.7％的初始体质量(或在卡路里限制期内每周至少减少1.25％的体质量)。
[0059]
根据公式(ii)计算香农-韦纳多样性：
[0060]
(ii)-∑pi ln(pi)，其中，pi是属于物种i的个体的比例
[0061]
在另一个优选实施方式中，计算所得的香农-韦纳多样性小于(优选度从低到高)6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1或5.0(例如在4.0和6.0之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8％的初始体质量(或在卡路里限制期内每周至少减轻1.14％的体质量)；优选地，小于5.3、5.2、5.1或5.0(例如在4.0和5.3之间)，更优选地，小于5.0(例如在4.0和5.0之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8.7％的初始体质量(或在卡路里限制期内每周至少减轻1.25％的体质量)。
[0062]
在另一个优选实施方式中，可以计算出样本中存在的不同细菌物种的数量，并且存在少于(优选度从低到高)1900、1850、1800、1750、1700、1650、1600、1550(例如在1000和1900之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8％的初始体质量(或在卡路里限制期内每周至少减轻1.14％的体质量)；优选地，少于1700、1600、1550或1500(例如在1000和1700之间)，更优选地，少于1500(例如在1000和1500之间)的不同细菌物种预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8.7％的初始体质量(或在卡路里限制期内每周至少减轻1.25％的体质量)。
[0063]
在上述实施方式中，卡路里限制期优选地为至少7周，其中，动物平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.10％。
[0064]
在其他优选实施方式中，计算的逆辛普森多样性(i)小于100(例如在10和100之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻7.5％的初始体质量，和/或(ii)小于50(例如在10和50之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8.0％的初始体质量。在其他优选实施方式中，计算的香农-韦纳多样性(i)小于6.0(例如在4.0和6.0之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻7.0％的初始体质量，和/或(ii)小于5.5(例如在4.0和5.5之间)预示着经
过卡路里限制期后，至少减轻8.0％的初始体质，和/或(iii)小于5.0(例如在4.0和5.0之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻9.5％的初始体质量。在其他优选的实施方式中，计算的不同细菌物种的数量(i)小于1800(例如在1000-1800之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8.0％的初始体质量，和/或(ii)小于1600(例如在1000-1600之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻8.5％的初始体质量，和/或(iii)小于1400(例如在1000-1400之间)预示着经过卡路里限制期后，至少减轻9.0％的初始体质量。在上述实施方式中，所述卡路里限制期优选地为至少7周，其中，动物平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.10％。
[0065]
在上述实施方式中(其中评估了逆辛普森多样性、香农-韦纳多样性或观察到的物种的数量)，所述卡路里限制期可以替代地定义为至少8周、10周、12周、14周或16周或更长时间，其中，在所述期间，动物平均每天摄入的干物质分别少于其体质量的1.10％、1.20％、1.30％、1.40％或1.50％。
[0066]
细菌种群多样性度量可以如上文详述单独地使用，或如下文详述与其他体重减轻预测指标(发酵产物或其代谢物的浓度和/或细菌分类群的丰度/相对丰度)组合使用。
[0067]
细菌的丰度/相对丰度作为体重减轻预测指标
[0068]
根据本发明的另一个方面，以下细菌的丰度/相对丰度被用作体重减轻(优选地为响应于卡路里限制的体重减轻)的预测指标：(i)鳞球菌属(sphaerochaeta)细菌，和/或(ii)密螺旋体属(treponema)细菌，和/或(iii)厌氧菌属(anaerovorax)细菌，和/或(iv)mobilitalea属细菌，和/或(v)放线菌门(actinobacteria)细菌，和/或(vi)螺旋体门(spirochaete)细菌，和/或(vi)纤维发酵细菌(例如纤维杆菌属(fibrobacter)细菌)。如实施例中所示，此类细菌的丰度/相对丰度与随后的体重减轻呈负相关。“负相关”按上述与细菌种群多样性有关的定义来使用。细菌丰度和/或相对丰度可以通过上文详述的与细菌种群多样性度量相关的方法计算。计算每个样本和/或动物的一种以上的上述细菌(如上文(i)至(vii)定义)的丰度和/或相对丰度，例如2、3、4、5、6或7种此类细菌，可以提高本发明方法的预测能力。优选地，以下细菌的丰度和/或相对丰度被用作体重减轻预测指标：鳞球菌属(sphaerochaeta)细菌，和/或(ii)密螺旋体属(treponema)细菌，和/或(iii)厌氧菌属(anaerovorax)细菌和/或(iv)mobilitalea属细菌，和/或(v)放线菌门(actinobacteria)细菌，和/或(vi)螺旋体门(spirochaete)细菌。
[0069]
在一个优选的实施方式中，样本中的鳞球菌属(sphaerochaeta)细菌的丰度小于log
10 2.5计数(例如在log
10 1.0和log
10 2.5计数之间)，和/或其相对丰度小于0.05％，预示着动物具有良好的体重减轻倾向；例如，经过卡路里限制期后，至少减轻8％的初始体质量。
[0070]
在另一个优选的实施方式中，样本中的mobilitalea属细菌的丰度小于log
10 2.5计数，优选地小于log
10 1.6计数(例如在log
10 0.5和log
10 2.5计数之间，优选地在log
10 0.5和log
10 1.6计数之间)，和/或其相对丰度小于0.03％，预示着动物具有良好的体重减轻倾向；例如，经过卡路里限制期后，至少减轻8.0％(优选地为至少8.7％)的初始体质量；或在卡路里限制期内每周至少减轻1.14％(优选地为至少1.25％)的体质量。
[0071]
在另一个优选的实施方式中，样本中的密螺旋体属(treponema)细菌的相对丰度小于1.7％，预示着动物具有良好的体重减轻倾向；例如，经过卡路里限制期后，至少减轻
8％的初始体质量。
[0072]
在另一个优选的实施方式中，样本中的厌氧菌属(anaerovorax)细菌的相对丰度小于0.11％，预示着动物具有良好的体重减轻倾向；例如，经过卡路里限制期后，至少减轻8％的初始体质量。
[0073]
在另一个优选的实施方式中，样本中的放线菌门(actinobacteria)细菌的丰度小于log
10 3.7计数，优选地小于log
10 2.5计数(例如在log
10 2.0和log
10 3.7计数之间，优选地在log
10 2.5和log
10 3.7计数之间)，预示着动物具有良好的体重减轻倾向；例如，经过卡路里限制期后，至少减轻8.0％，优选地为至少8.7％的初始体质量；或在卡路里限制期内每周至少减轻1.14％，优选地为至少1.25％的体质量。
[0074]
在另一个优选的实施方式中，样本中的螺旋体门(spirochaetes)细菌的相对丰度小于2.3％，预示着动物具有良好的体重减轻倾向；例如，经过卡路里限制期后，至少减轻8％的体质量。
[0075]
在一些实施方式中，计算纤维发酵细菌(除上述细菌分类群之外)的丰度可以进一步提高本发明方法的预测能力。或者，在一些实施方式中，纤维发酵细菌丰度的计算(就其本身而言)被用作体重减轻预测指标。在对纤维发酵细菌的丰度和/或相对丰度进行评估的实施方式中，可对样本中的纤维杆菌属(fibrobacter)细菌的丰度进行计算，其中，所述纤维发酵细菌的丰度与预测的体重减轻呈负相关。
[0076]
在上述实施方式中(其中，对鳞球菌属(sphaerochaeta)、mobilitalea属、密螺旋体属(treponema)、厌氧菌属(anaerovorax)、放线菌门(actinobacteria)、螺旋体门(spirochaetes)和纤维发酵细菌的丰度和/或相对丰度进行了评估)，所述卡路里限制期优选地为至少7周，其中，动物平均每天摄入的干物质少于其体质量的1.10％。所述卡路里限制期可以替代地定义为至少8周、10周、12周、14周或16周，其中，在所述期间内，动物平均每天摄入的干物质分别少于其体质量的1.10％、1.20％、1.30％、1.40％或1.50％。
[0077]
上述细菌的丰度和/或相对丰度可单独使用，如上文详述，或与其他体重减轻预测指标(发酵产物浓度和/或细菌种群多样性度量)组合使用，如上文详述。
[0078]
样本
[0079]
本发明的方法使用粪便样本、血液样本、尿液样本或来自马属(equus)动物胃肠管腔的样本。粪便和尿液样本是方便的，其收集是非侵入性的，并且在一段时间内易于对个体重复取样，并且是本发明方法中使用的优选样本。如实施例中所分析的，粪便样本是本发明方法中使用的特别优选的样本。本发明还可用于其他样本，例如回肠、空肠、十二指肠样本和结肠样本。在一些实施方式中，本发明方法中使用的样本不是血液或尿液样本。
[0080]
样本可以是新鲜样本。样本在用于本发明的方法之前，还可以通过其他方式进行冷冻或稳定，例如将样本加入保存缓冲液中或通过使用冷冻干燥等方法脱水。
[0081]
在用于本发明的方法之前(发酵产物和/或其代谢物的浓度评估除外)，通常会对样本进行处理以提取dna。分离dna的方法是本领域众所周知的，例如，如参考文献
21
中所述。合适的方法包括例如凯杰强力粪便dna提取试剂盒(qiaamp power faecal dna kit(qiagen))。
[0082]
在本发明的方法中，可以就单个样本评估体重减轻预测指标，或者为了更高的准确性，可以评估来自多个样本(例如来自同一动物的2、3、4或5个或更多个样本)的平均值，
作为体重减轻预测指标。
[0083]
一般说明
[0084]
除非另有说明，本发明的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。这些技术在文献中有详尽的解释
22-29
。
[0085]
术语“包含”涵盖“包括”以及“由
……
组成”，例如“包含”x的组合物可以仅由x组成或可以包括额外的组成部分，例如x y。
[0086]
与数值x相关的术语“约”是可选的并且意味着例如x 10％。
[0087]“基本上”一词不排除“完全”，例如“基本上不含”y的组合物可以完全不含y。必要时，本发明的定义中可以省略“基本上”一词。
[0088]
提及两个核苷酸序列之间的百分比序列同一性意味着，当比对时，在比较这两个序列时该百分比的核苷酸是相同的。这种比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如参考文献30的第7.7.18节中所描述的。使用blast(基本局部比对搜索工具)算法或史密斯-沃特曼(smith-waterman)同源性搜索算法确定优选对齐
31
，上述算法使用仿射空位搜索，空位开放罚分为12，并且空位扩展罚分为2，blosum矩阵为62。参考文献31中公开了史密斯-沃特曼同源搜索算法。可以在整个参考序列上进行比对，即可以在本文公开的序列的100％长度上进行比对。
[0089]
除非特别说明，包括多个步骤的过程或方法可以包括该方法开始或结束时的附加步骤，或者可以包括额外的中间步骤。此外，在适当情况下，步骤可以组合、省略或按照替代顺序执行。
[0090]
本文中描述了本发明的各种实施方式。应当理解，每个实施方式中详细说明的特征可以与其他详细说明的特征组合以提供进一步的实施方式。特别地，本文中强调的合适的、典型的或优选的实施方式可以彼此组合(除非它们是相互排斥的)。
[0091]
本发明的实施方法
[0092]
材料和方法
[0093]
动物与畜牧业
[0094]
在为期11周的期间内(12月至2月；表s2)，对16只肥胖的(bcs》7/9)威尔士山(a部分)雌性矮种马(n＝8第1年；n＝8第2年)进行了研究。这些动物由利物浦大学内斯希斯(ness heath)农场方圆30英里内的当地矮种马饲养者出借给本研究。所有动物在招募时都进行了临床检查，没有明显疾病的迹象并且被认为整体健康状况良好。在整个研究过程中保持常规足部护理和疫苗接种方案。动物被单独圈养在同一个谷仓内的单厩间(3m x 5m)里，睡在木刨花上，并且可以随时自由饮用淡水。在可能的情况下，矮种马每天可以进入牧场30分钟，以进行基础锻炼和社交接触。为确保对马厩内供给营养的完全控制，运动时使用关闭的口套(shires牌)以防止牧草摄入。
[0095]
所有程序均按照英国内政部要求进行，并得到利物浦大学动物福利委员会的批准。已获得所有马主人的书面知情同意。
[0096]
研究设计
[0097]
这项为期11周的研究旨在评估在7周饮食限制期内体重减轻响应与胃肠微生物组变化之间的任何关联。这些动物自始至终保持干草饮食(两个年份的相同批次)。
[0098]
在负向能量平衡开始之前，动物首先经历了对本研究的规定饮食和饲养条件的为
期4周的适应期。在这4周的“规定饮食前”期间，每天向个体动物提供其初始bm的2％的干草作为每日dm，这一营养水平预计在可消化能(de)和粗蛋白(cp)含量方面近似维持。为了模仿标准的饲养实践，每只动物的每日干草定量供应均分为每日两餐提供(08.30时和16.30时)。为确保维生素和矿物质的充分摄入，每天喂食湿润的营养平衡产品(斯佩尔斯莱特(spillers lite))(8.30时，0.1％bm作为dm)。主要营养素的平均组成是：干草；总能量(gross energy，ge)18.9mj/kg dm、灰分4.0％，粗蛋白(cp)8.1％、酸性洗涤纤维(adf)41.2％、中性洗涤纤维(ndf)64.7％、淀粉0.6％、可溶于水的碳水化合物(wsc)15.6％。维生素/矿物质平衡剂；ge 16.35mj/kg dm、de 9.5mj/kg dm、灰分14.0％、cp 21.1％、adf 14.3％、ndf 31.7％、淀粉10.5、wsc 12.5％。在这两年中为期4周的规定饮食前阶段之前，对干草和平衡剂的样本进行了分析，并且年度之间主要营养素的组成没有差异。在研究的剩余七周中，干草摄入量被限制为1％bm作为每日dm，0.1％bm作为营养平衡餐。预计这种程度的负向能量平衡会导致平均每周达到1％bm的体重减轻。如前所述提供膳食。在此期间，每周重新计算个体饲料供应量以解释体质量(bm)的变化。
[0099]
物理测量
[0100]
每周，在08.30时到09.00时之间记录bm(精确到500克)(定期校准的地磅：轻量级中等程度；称马)。在整个研究期间，由同一个人使用由亨内基(henneke)等人(1983年)制定、由肯克(kohnke)(1992年)修改的系统记录每只动物的bcs。
[0101]
粪便收集
[0102]
在整个11周的研究期间，每周在每只动物自发排泄(09:00后第一次自发排便)后的5分钟内收集粪便样本。此外，还在2％干草喂养的最后的连续3天、“规定饮食前”期间以及饮食限制最后的连续三天收集粪便样本。用戴手套的手从垫料(bedding)/地板区域收集新鲜粪便样本，放入干净的钢碗中，以尽量减少环境污染，将其手工混合并等分至四个5ml无菌小瓶中(科学实验室设备(scientific laboratory supplies)，英国)。在进行dna提取之前，将小瓶在液氮中速冻并储存在-80℃温度下。
[0103]
总体身体组成的估计
[0104]
对每只动物计算两次身体总水分(tbw)和身体总脂肪量；使用氧化氘(d2o)稀释方法在“规定饮食前”阶段的最后一周和饮食限制阶段的最后一周分别计算一次，该方法如前所述并在矮种马的临床使用中得到验证
32
。商业实验室(iso-analytical，英国柴郡)通过气体同位素比值质谱仪分析血浆样本中的氘富集(一式两份地)。
[0105]
联合葡萄糖-胰岛素耐量试验(cgit)
[0106]
对每只动物进行两次动态cgit测试；一次在“规定饮食前”阶段的最后一周，一次在饮食限制的最后一周
13
。将血样立即转移到肝素锂管(bd真空采血管)中，混合，并置于冰上直至进行离心(2000克，10分钟)。进行分析前，将血浆等分成两份并储存在-20℃温度下。使用己糖激酶法分析血浆葡萄糖样本。使用化学发光测定法(西门子immulite 1000r，化学发光测定法)测量血浆胰岛素浓度。
[0107]
表观消化率
[0108]
通过连续3天(72小时)的总粪便收集对个体矮种马进行两次消化率试验，一次是在“规定饮食前”阶段的最后一周，一次是在饮食限制的最后一周。在每24小时期间结束时记录任何被拒绝的饲料。对每日收集的总粪便进行称重、充分混合并收集一式两份样本进
行分析。通过将一式两份样本(～250g)干燥(70℃)至恒定质量来确定粪便的干物质(dm)含量。在550℃燃烧(carbolite oaf:1；carbolite熔炉)一式两份的dm样本后记录灰分含量。将在72小时内收集的三份干燥粪便样本研磨、汇集和均质，用于在商业实验室(sciantec，英国)通过弹式量热法评估ge含量(mj/kgdm)。此外，在商业实验室(dairy one，美国伊萨卡)通过湿化学法测量干燥后的粪便样本的纤维含量(adf和ndf)。
[0109]
dna提取和定量pcr
[0110]
从冷冻干燥的粪便样本(25mg dm)中提取基因组dna，将其在4％sds裂解缓冲液中珠磨45秒。使用ctab/氯仿方法(改编自参考文献33)提取dna。通过分光光度法(nanodrop nd-100，赛默科技，美国)评估基因组dna的浓度和质量。通过qpcr及其各自标准的连续稀释来确定来自总细菌、原生动物和真菌的dna绝对浓度(101到105)，如前所述
34,35
。使用lightcycler480系统(罗氏，德国曼海姆)进行一式三份定量聚合酶链反应(qpcr)。
[0111]
ion torrent下一代测序
[0112]
使用下一代测序(ngs)
36
研究细菌群落。对于细菌分析，先使用细菌引物(27f和357r)随后使用ion torrent接头(adaptor)对16s rrna的v1-v2高变区进行扩增。正向引物带有10个核苷酸条形码以允许进行样本识别。在含有dna模板(1μl)、0.2μl反向引物、1μl正向引物、5μl缓冲液(pcr生物系统有限公司(pcr biosystems ltd.)，英国伦敦)、0.25μl bio hifi聚合酶(pcr生物系统)和17.6μl分子级水的25μl反应容器中进行pcr。细菌和产甲烷菌的扩增条件为95℃1min，然后进行22个周期的95℃15秒、55℃15秒和72℃30秒。在1％琼脂糖凝胶上观察所得扩增子以评估扩增的质量。然后使用agencourt ampure xp磁珠(贝克曼库尔特(beckman coulter)公司，美国富勒顿)纯化pcr产物，并使用配备take 3micro-volume板(伯腾(biotek)，英国波顿)的epoch微孔板分光光度计测定dna浓度以等摩尔汇集具有唯一条形码的样本。
[0113]
使用含有2％琼脂糖凝胶的egel系统(生命科技有限公司(life technologies ltd.)，英国佩斯利)进一步纯化文库。在配备高灵敏性dna芯片的agilent 2100生物分析仪(安捷伦科技有限公司(agilent technologies ltd.)，英国斯托克波特)上对纯化的文库进行质量评估和定量。使用ion chef系统(生命科技英国有限公司(life technologies uk ltd))和ion pgm hiq chef试剂盒进行文库制备以用于ngs测序，并使用ion torrent个人基因组机器(pgm)系统在离子磷酸葡萄糖变位酶测序316芯片v2 bc(ion pgm sequencing 316chips v2 bc)上进行测序。
[0114]
测序后，按照先前所述对数据进行处理
36
。简言之，使用mothur软件环境将样本识别号分配给多重读取。通过去除低质量序列、测序错误和嵌合体对数据进行去噪(质量参数：最大10个均聚物，qaverage 13，qwindow 25，对于古细菌，qwindow设置为30，而erate＝1；嵌合体检查，使用uchime驱动从头测序(de novo)以及数据库。使用uparse管道以97％的同一性将序列聚集到otus中。通过与核糖体数据库项目-i比较获得16s rrna序列的细菌分类信息
37
。将每个样本的读取数标准化为序列数最少的样本。
[0115]
挥发性脂肪酸的测量
[0116]
将粪便样本解冻并用蒸馏水进行1:5w/v稀释(2克样本/8毫升水)制备粪便浆液，并记录ph值，然后添加20％正磷酸(含有20mm 2-乙基丁酸作为内标)，其比例为1:5(1ml酸/4ml粪便浆液)以使样本脱蛋白。对于vfa分析，将浆液放置24小时以让沉积物沉淀，然后通
过玻璃纤维预过滤器(0.7μm孔，密理博(millipore))和硝酸纤维素膜(0.45μm孔；密理博)注射器过滤，注入玻璃小瓶中并封顶。如参考文献38中所述，使用丁酸乙酯作为内标，通过气液色谱法测定vfa。
[0117]
统计分析
[0118]
表型数据
[0119]
所有数据都输入到excel中并导出到stata 13.1(statacorp,德克萨斯州)中进行统计分析。通过以体质量(kg)作为结果变量拟合混合效应回归模型，对本研究体重减轻阶段的体重变化模式进行了研究。包括了初始体质量(第0周)，以解释个体动物之间初始bm的差异。时间(周)被添加为解释变量，如果多项式项改进了模型拟合，如似然比检验所判断的那样，则对其进行拟合。矮种马身份被列为随机截距，时间作为随机斜率。对于随机效应，采用非结构化协方差矩阵。根据模型预测体质量，并使用该模型计算成比例的体重减轻(调整到第0周)，并且被用于根据体重减轻对动物进行排名。然后将其分为三分位组(高(8.77％、9.17％、11.32％和11.59％的初始体质量减轻)、中(7.97％、8.15％、8.42％、8.45％和8.62％的初始体质量减轻)和低(7.11％、7.22％、7.53％、7.94％和7.94％的初始体质量减轻)体重减轻)，以便进一步查询数据。威尔科克森(wilcoxon)符号秩检验用于评估规定饮食前与规定饮食后在消化率、身体组成和葡萄糖/胰岛素动力学方面的测量值差异。
[0120]
多样性和粪便vfa分析
[0121]
使用推荐的标准化数据在所有时间点计算所有粪便样本的多样性指数(逆辛普森和香农-韦纳)、观察到的物种(s.obs)和估计的物种丰富度(s.chao1)，以减少焦磷酸测序数据集中真实多样性的过分膨胀
39
。采用“幂阶梯”方法目视评估数据的正态性。在适当的情况下进行转化。进行学生t试验(student t test)以评估规定饮食前期间和规定饮食后期间vfa浓度和多样性指数的平均变化(使用规定饮食前和规定饮食后样本的最后3天的算术平均值)。使用单因素方差分析(one-way anova)(第12版；vsn国际有限公司)评估体重减轻组(高、中、低)之间初始多样性和粪便vfa浓度的差异，使用经bonferroni校正的p值校正多重检测。如果p值《0.05，则被认为是显著的。通过单变量分析(stata 13.1,statcorp，德克萨斯)证实了该结果，其中初始多样性或粪便vfa浓度是解释变量，并且整体成比例体的重减轻(分对数转换)是结果变量。为了进一步研究初始乙酸浓度在预测动物体重减轻成功方面的能力，生成了一个二元(是/否)变量，其中体重减轻成功被定义为总体重减轻百分比≥8％。该值是根据当前研究中所收集的数据进行选择的。生成初始乙酸浓度的接受者工作特征(roc)曲线，作为体重减轻预测指标(是/否)。这允许对初始乙酸浓度的最佳截止分数进行调查并生成灵敏性和特异性参数。此外，使用r-实施版本1.1-367进行微生物组组成分析(ancom)，以评估任何个体属的初始丰度是否在(分为四分位组)的初始乙酸浓度之间存在显著差异。
[0122]
通过anova(第12版；vsn国际有限公司)对体重减轻后微生物组中的门和属水平差异进行了研究。统计分析排除了记录的丰度小于0.05％的那些。使用本杰明尼(benjamini)和霍赫贝格(hochberg)提出的方法调整多重检测的p值
40
以降低错误发现率。应用benjamini&hochberg校正方法(1995)校正时，p《0.10的结果被认为具有统计学意义。使用ancom来评估体重减轻组之间个体门/属丰度的差异。
[0123]
使用统计包r中的生物导体包deseq21评估在otu水平上的丰度差异，该方法适用
于查询高通量、测序计数数据，允许使用负二项式分布构建模型以解释来自每个otu的读取计数
41
。
[0124]
置换多元方差分析(permanova)来确定细菌群落的总体显著差异。在primer 6和permanova (分别为6.1.18和1.0.8版；引物-e，英国艾维布里奇)中进行分析。丰度百分比数据进行平方根变换，并计算布雷柯蒂斯距离(bray-curtis)离矩阵。使用具有9999无限制置换的默认设置执行permanova，并计算了蒙特卡洛(monte carlo)p值。使用上文计算的bray-curtis距离矩阵，在primer 6和permanova 中进行相似性分析(anosim)。该分析用于提供群落之间差异程度的衡量标准，如r型统计量所示。
[0125]
为了计算环境数据对细菌群落的贡献，使用基于距离的线性模型来计算哪些环境变量与群落数据具有显著相关性。在基于距离的冗余分析(dbrda)中使用了显著变量
42
，正如在primer 6和permanova 中所执行的。
[0126]
实施例1——覆盖率、多样性和挥发性脂肪酸
[0127]
16s rdna扩增子序列的质量过滤产生了16,028,420高质量序列(320bp长)，聚集在9,536个不同的otu中。构建了系谱树(primer 6与bray curtis不相似，图6)，这表明在规定饮食前和规定饮食后三个连续采样日中的每一天从动物获得的样本倾向于聚集在一起。这种观察允许将这些系列样本产生的数据汇集至每只动物。标准化后的每个时期内，汇总分析为每只动物提供了14,500个序列。稀疏曲线(图7)表明样本曲线没有达到稳定；表明尚未实现对这些环境的完整采样。
[0128]
在体重减轻后，逆辛普森、香农-韦纳和s.obs的alpha多样性度量显著降低(p《0.05)，但未观察到chao1的差异(表1)。此外，三个体重减轻组之间的初始(规定饮食前的3日平均值)多样性度量(逆辛普森、香农-韦纳和s.obs)存在显著差异(表1)。单变量回归分析证实了这一点，其中，发现初始多样性度量和随后的体重减轻之间呈现显著的负相关(表3和图8)。
[0129]
在体重减轻后，乙酸、丁酸、丙酸和支链挥发性脂肪酸的浓度显著降低，但粪便ph值保持不变(表2)。规定饮食前和规定饮食后的样本的乙酸加丁酸的和与丙酸的比率没有差异，然而，与低体重体重减轻组相比，高体重减轻组的初始比率(3个规定饮食前样本的平均值)最大(4.37
±
0.58对(vs.)3.24
±
0.50；p＝0.04)。此外，发现在初始vfa浓度和随后的体重减轻之间呈强烈的正相关(乙酸(acetate)，r2＝0.52，p《0.01；丁酸(butyrate)，r2＝0.34，p＝0.02；丙酸(propionate)，r2＝0.33，p＝0.03；表4和图9)。
[0130]
由于初始乙酸和随后的体重减轻之间存在显著关联，因此以“体重减轻》＝8％bm”的二元结果对逻辑回归模型进行了拟合。这被用于构建接受者工作特征(roc)曲线，以确定初始乙酸浓度在预测随后体重减轻成功方面的能力(使用8％初始体质量的体重减轻)，并导致曲线下区域的面积为0.91(图10)。使用当前数据实现的最佳测试性能提供了12mm乙酸的截止值，其测试灵敏性为88.9％(95％置信区间：51.8-99.7)，特异性为100％(95％置信区间：54.1-100.0)用于预测超过8％的体重减轻。然后使用ancom对任何特定属的初始丰度与(分为四分位组)的初始乙酸之间的关联进行调查。研究发现，鳞球菌属(sphaerochaeta)和密螺旋体属(treponema)(二者均属于螺旋体门(spirochaetes))、厌氧菌属(anaerovorax)和mobilitalea属(二者均属于厚壁菌门(firmicutes))与初始乙酸浓度显著相关(图11和表5)，其中，对于初始乙酸浓度处于最低四分位组的那些动物来说，个体属
的初始丰度最大。
[0131]
表1.饮食限制前(规定饮食前)和饮食限制后7周(规定饮食后；n＝15)的多样性指数(平均值
±
sd)，以及高(n＝5)、中(n＝5)和低(n＝5)体重减轻组中的初始多样性指数(规定饮食前3天的平均值
±
sd)。
[0132][0133]
表2.饮食限制前(规定饮食前)和饮食限制7周后(规定饮食后；n＝15)的ph值和挥发性脂肪酸浓度(平均值
±
sd)，以及在高(n＝5)、中(n＝5)和低(n＝5)体重减轻组中的初始ph值和挥发性脂肪酸浓度(规定饮食前的3日平均值
±
sd)。
[0134][0135]
表3：体重减轻与初始多样性度量之间的关联。使用单变量回归分析调查与作为结果变量的成比例的总体重减轻(校正至第0周；分对数转换)和作为解释变量的初始多样性度量(规定饮食前的3日平均值)之间的关联。
[0136][0137]
表4：体重减轻与初始vfa浓度之间的关联。使用单变量回归分析来调查成比例总体重减轻(校正至第0周；分对数变换)之间的关联。
[0138][0139]
表5.按初始乙酸浓度(规定饮食前的3日平均值)划分四分位的动物之间的初始细菌属的相对丰度(规定饮食前的3日平均值)。根据初始乙酸浓度将动物划分四分位组，如下：四分位组1，n＝4，9.45mm
±
0.27(平均值
±
sd)；四分位组2，n＝4，11.66mm
±
1.04，四分位组3，n＝3，16.76mm
±
1.13，四分位组4，n＝4，22.63mm
±
4.49。使用anova分析评估细菌门相对丰度的组间差异，并使用benjamini-hochberg校正针对多重检验对得到的p值进行调整。
[0140]
[0141]
[0142][0143]
实施例2——体重减轻后细菌丰度的变化以及与体重减轻的关联
[0144]
在所有样本/时间点中，拟杆菌门(bacteriodetes)是目前最丰富的门，其次是厚壁菌门(firmicutes)和纤维杆菌门(fibrobacteres)。尽管体重减轻后拟杆菌门(bacteriodetes)的相对丰度没有明显变化，体重减轻后厚壁菌门(firmicutes)和软壁菌门(tenericutes)的相对丰度显著降低(表6和图1)，体重减轻后，厚壁菌门：拟杆菌门的比率增加(规定饮食前的2.10
±
0.54相比规定饮食后的2.54
±
0.56；p＝0.01)。类似地，在体
重减轻后，纤维消化细菌的比率，纤维杆菌门：厚壁菌门(的比率)增加(0.74
±
0.58比1.31
±
0.88；p＝0.03)。使用ancom和anova分析探索体重减轻组之间门的初始丰度(规定饮食前的3日平均值)的差异。研究发现，与高体重减轻组相比，低体重减轻组中的放线菌门(actinobacteria)和螺旋体门(spirochaetes)的初始丰度明显更高(图12和表7)。
[0145]
表6.饮食限制前(规定饮食前)和饮食限制7周后(规定饮食后；n＝15)的细菌门相对丰度。
[0146][0147]
表7：三个体重减轻组(n＝5/组)之间初始细菌门的相对丰度(规定饮食前的3日平均值)。使用anova分析评估细菌门相对丰度的组间差异，并使用benjamini-hochberg校正针对多重检验对得到的p值进行调整。
[0148][0149]
在属水平上，虽然最大比例的样本在该级别未分类，纤维杆菌属(fibrobacter)是在所有样本/时间点中第二最丰富的属。在体重减轻后，许多属的丰度发生了变化：理研菌属(rikenella)和棍状厌氧菌属(anaerorhabdus)(二者都属于拟杆菌门(bacteroidetes))的相对丰度增加(表8和图2)，而普雷沃氏菌属(prevotella)和拟普雷沃菌属(alloprevotella)(属于拟杆菌门(bacteroidetes))、梭菌属xiva(clostridium xlva)、考拉杆菌属(phascolarctobacterium)和假黄杆菌属(pseudoflavonifractor)(属于厚壁菌门(firmicutes))以及厌氧原体属(anaeroplasma)(属于软壁菌门(firmicutes))丰度降低
(表8和图1b)。研究发现，进行ancom和anova后，与高体重减轻组相比，低体重减轻组中的mobilitalea属(属于属于厚壁菌门(firmicutes))的初始丰度明显更高(图13和表9)。
[0150]
表8饮食限制前(规定饮食前)和饮食限制7周后(规定饮食后；n＝15)的细菌属的相对丰度。
[0151]
[0152]
[0153][0154]
表9：三个体重减轻组(n＝5/组)之间初始细菌属的相对丰度(规定饮食前的3日平均值)。使用anova分析来评估细菌门相对丰度的组间差异，并使用benjamini-hochberg校针对多重检验对得到的p值进行调整。
[0155]
[0156]
[0157][0158]
研究发现，在体重减轻后，共有属于13个属的61个otu在丰度上存在显著差异：在体重减轻后，其中7个otu的丰度降低，剩余51个otu的丰度增加。在体重减轻组之间也发现初始otu丰度存在显著差异：在高体重减轻组和低体重减轻组之间发现了最大的差异数(属于18个属的159个otu显著不同，其中101个在高体重减轻组的初始丰度更大(与低体重减轻组相比))。研究发现，共有属于9个属的48个otu在低体重减轻组和中体重减轻组之间在初始丰度上存在显著差异，而属于6个属的28个otu在中体重减轻组和高体重减轻组之间存在显著差异。
[0159]
实施例3——微生物组结构作为体重减轻预测指标
[0160]
为了确定初始细菌群落结构是否可以预测随后的体重减轻，进行了permanova和anosim分析。初始细菌群落结构在otu水平上存在显著差异，其中发现高体重减轻组和低体重减轻组之间的差异最大(r＝0.67，p《0.01；表10)。使用基于距离的冗余分析(dbrda)以总结可归于体重减轻组的初始细菌群落结构的变化(图2)。虽然组间存在一些重叠，但低体重减轻组中的动物聚集在一起，并且明显区别于高体重减轻组中的动物，后者动物之间的初始细菌结构差异更大。进行第二次dbrda分析以评估初始vfa浓度和ph值对初始细菌群落结构的促成作用(图14)。如图14所示，体重减轻组之间初始乙酸浓度与初始细菌群落结构的差异密切相关。
[0161]
表10.体重减轻组对马粪便中的细菌群落结构的影响。突出显示了permanova的显著p值(p《0.05)。anosim r值表示样本之间的分离程度(0＝非常相似；1＝高度不同)，显著的r值(p《0.05)以粗体表示。
[0162][0163]
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