枯草芽孢杆菌及其在肥料中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌及其在肥料中的应用。


背景技术：

2.化肥的产生带来了粮食的增产，但也带来环境的污染以及土地污染。特别是当今社会，环境污染和土地污染的日益严重，造成粮食的可持续发展出现危机。所以如何减少化肥的使用是当今科学家们研究的重要课题。实践证明，微生物肥料具有高效、高产以及绿色健康无污染的植物肥料。微生物肥料的使用是当今农业发展必不可少的因素。
3.微生物肥料的施放能促进土壤中有益微生物的增殖，从而使有益微生物将土壤中氮、磷、钾等更多的养分分解，促进植物的生长发育。枯草芽孢杆菌是目前农用微生物菌剂中应用最为广泛的一类微生物，枯草芽孢杆菌包括纳豆亚种(b.subtilis subsp.natto)、枯草亚种(b.subtilis subsp.subtilis)和沙漠亚种(b.subtilis subsp.inaquosorum)等亚种，研究表明枯草芽孢杆菌具有增强作物抗病、抗旱、抗寒的能力，而用于促进作物生长中的枯草亚种的研究相对较少，尤其是添加在肥料中。在微生物应用过程中，深入的机理研究对于微生物产业的发展和作物产量都具有积极意义。
4.然而针对枯草芽孢杆菌在肥料中的应用，还需要进一步改进。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种枯草芽孢杆菌、微生物菌剂、复合菌剂、微生物肥料及其在农作物处理中的应用。
6.本发明的第一方面提供了一种枯草芽孢杆菌枯草亚种bacillus subtilis subsp.subtilis，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21826。本发明所提供的菌株经16s rrna基因，gyrb保守基因，细胞革兰氏染色和菌落形态以及生理生化特征分析，被鉴定为枯草芽孢杆菌。而且所述枯草芽孢杆菌gyrb保守基因测序结果显示与bacillus subtilis subsp.subtilis 6051-hgwt以99％支持率聚成同一分支。所提供的枯草芽孢杆菌对于小麦种子具有明显的促生效果，平皿发芽试验促生效果达52.13％，且代谢产物中含有吲哚乙酸等促生物质。
7.本发明的第二方面提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括第一方面所述的枯草芽孢杆菌。
8.本发明的第三方面提供了一种微生物菌剂的制备方法，包括：对菌株进行活化培养，以便获得发酵菌液；对所述发酵菌液进行放大发酵培养，以便获得发酵产物。
9.本发明的第四方面提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为本发明第一方面所述的微生物菌剂，所述第二微生物菌剂包括选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌中的至少一
种。
10.本发明的第五方面提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料包括第一方面所述的枯草芽孢杆菌，或者第二方面所述的微生物肥料，或者第三方面所述的复合菌剂。
11.本发明的第六方面提供了一种枯草芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌剂或者微生物肥料中的用途，所述枯草芽孢杆菌为第一方面所述的枯草芽孢杆菌。
12.本发明的第七方面提供了一种农作物施肥方法，包括：对所述农作物施用有效量的枯草芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者微生物肥料，所述枯草芽孢杆菌为本发明第一方面所述的枯草芽孢杆菌，所述微生物菌剂为本发明第二方面所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为本发明第四方面所述的复合菌剂，所述微生物肥料为本发明第五方面所述的微生物肥料。
13.菌种保藏信息
14.枯草芽孢杆菌枯草亚种bacillus subtilis subsp.subtilis，保藏编号为cgmcc no.21826，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2021年02月25日。
附图说明
15.图1为根据本发明的实施例提供的编号为ly005的菌株在tsa培养基上于30摄氏度培养18小时的结果图。
16.图2为根据本发明的实施例提供的菌株ly005的16s rdna基因序列的系统发育分析结果图。
17.图3是根据本发明的实施例提供的菌株ly005的gyrb基因序列的系统发育分析结果图。
具体实施方式
18.下面结合附图详细描述本发明的实施例，需要说明的是，这些实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
19.本文中，如无特殊说明，当表述某种物质的含量时，是指的该物质的质量占总物质重量的百分比。
20.本文中，当提到对于疾病的“防治”时，“防治”不仅包括预防某种疾病的发生，还包括治疗某种疾病，从而减轻、降低、缓解疾病的症状。
21.本发明提供了一种枯草芽孢杆菌枯草亚种bacillus subtilis subsp.subtilis，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21826。所提供的菌株经筛选自春红薯根际土壤，土壤深度为0-20cm，经过分离、鉴定，为枯草芽孢杆菌。该枯草芽孢杆菌也编号为ly005。所提供的枯草芽孢杆菌革兰氏染色呈阳性，菌体杆状。在 tsa培养基上，菌落近圆形，浅黄色，边缘呈矩齿状。而且其生理生化特征(全细胞脂肪酸和api 50ch)分析结果符合芽孢杆菌属(bacillus)的生化代谢特征。
22.而且所述枯草芽孢杆菌gyrb保守基因测序结果显示与bacillus subtilis subsp.subtilis6051-hgwt以99％支持率聚成同一分支。所提供的枯草芽孢杆菌更细分可以为枯草芽孢杆菌枯草亚种bacillus subtilis subsp.subtilis。所以也提供的枯草芽孢
杆菌在表述时也可以表示为枯草芽孢杆菌枯草亚种。根据本发明的具体实施方式，所提供的枯草芽孢杆菌具有如 seq id no:1所示的16s rdna序列。16s rdna序列编码16s rrna亚基。根据本发明的具体实施例方式，所提供的枯草芽孢杆菌具有如seq id no:2所示的gyrb基因序列。
23.发芽试验结果显示，所提供的菌株对于小麦种子具有明显的促生效果，促生效果达到 52.13％，经检测所述枯草芽孢杆菌枯草亚种的代谢产物中含有吲哚乙酸等促生物质。
24.本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括上述所述的枯草芽孢杆菌枯草亚种。
25.本发明又提供了微生物菌剂的制备方法，包括：对菌株进行活化培养，以便获得发酵菌液；对所述发酵菌液进行放大发酵培养，以便获得发酵产物。
26.用于放大发酵培养的培养基包括玉米淀粉，蔗糖，豆粕，酵母粉，蛋白胨，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，碳酸钙，氯化钠，和消泡剂。在一些实施方式中，用于放大发酵培养的培养基以重量份计，包括：3.0-3.5重量份的玉米淀粉，0.8-1.0重量份的蔗糖，4.0-4.5重量份的豆粕，0.20-0.50重量份的酵母粉，0.20-0.50蛋白胨，0.2-0.3重量份的磷酸氢二钾，0.2-0.3 重量份的磷酸二氢钾，0.1-0.15重量份的碳酸钙，0.1-0.15重量份的氯化钠，和0.3-0.5重量份的消泡剂。
27.本发明还提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为上述所述的微生物菌剂，所述第二微生物菌剂包括选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌中的至少一种。
28.在至少一些实施方式中，所述复合菌剂包括30～35重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：15～20重量份的解淀粉芽孢杆菌，20～25重量份的地衣芽孢杆菌，15～20重量份的侧孢芽孢杆菌，10～15重量份的凝结芽孢杆菌。
29.在至少一些实施方式中，每克所述复合菌剂包含枯草芽孢杆菌枯草亚种的有效活菌数不低于1000亿cfu，以及包含选自下列中的至少一种：解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数至少为1000亿cfu；地衣芽孢杆菌的有效活菌数至少为1000亿cfu；侧孢芽孢杆菌的有效活菌数至少为100亿cfu；凝结芽孢杆菌的有效活菌数至少为100亿cfu。如文中所示，cfu 作本领域通常理解，为菌落形成单位。
30.上述提供的菌株，或者微生物菌剂或者复合菌剂可以单独使用，也可以添加到肥料中使用。为此，本发明还提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料包括本发明上述所述的枯草芽孢杆菌枯草亚种，或者上述所述的微生物菌剂，或者上述所述的复合菌剂。在一些实施方式中，所述微生物肥料中含有千分之一至千分之五的所述的枯草芽孢杆菌枯草亚种，千分之一至千分之五的所述微生物菌剂，或者千分之一至千分之五的所述复合菌剂。例如，包括千分之二至千分之五的枯草芽孢杆菌，千分之二至千分之五的微生物菌剂，或者千分之二至千分之五的复合菌剂。在一些实施方式中，每克所述微生物肥料中含有微生物的有效活菌数至少为0.2亿cfu。所提供的微生物肥料的制作工艺为：将制备的复合微生物菌剂在有机无机肥、复合肥包膜工段与防结粉混合均匀后按照1-5
‰
添加，待稳定生产后所得相应的肥料，即为微生物肥料。
31.所述微生物肥料还进一步包括基础肥料。基础肥料可以为有机无机肥、复合肥等
等。例如可以为有机无机肥为15-40/s(15-8-17)，复合肥为15-8-20/s。微生物肥料可以通过下述方法制备：将基础肥料包膜工段与防结粉混合均匀后，然后添加1-5
‰
含量的微生物菌剂，获得微生物肥料。所提供的微生物肥料中所含有的微生物有效活菌数至少为0.2亿cfu。
32.所提供的微生物肥料，可以用于农作物。例如，田间试验显示对于花生和红薯均具有增产增收的作用，具体效果为：应用于春花生的生物有机无机肥相比常规施肥和市场产品分别增产13.3％和5.5％；应用于红薯的生物有机无机肥相比对照组产量增加6.93％，所用微生物复合肥相比对照组产量增加5.8％。说明由该菌株制备而成的微生物肥料具有促进作物生长，提高作物产量的功能。
33.本发明还提供了上述所述的枯草芽孢杆菌枯草亚种在制备微生物菌剂、复合菌剂或者微生物肥料中的用途。
34.本发明还提供了一种农作物施肥方法，包括：对所述农作物施用有效量的枯草芽孢杆菌枯草亚种，微生物菌剂，复合菌剂或者微生物肥料，所述枯草芽孢杆菌枯草亚种为上述所述的枯草芽孢杆菌枯草亚种，所述微生物菌剂为上述所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为上述所述的复合菌剂，所述微生物肥料为上述所述的微生物肥料。通过对农作物施肥，能够明显促进农作物的生长，提高农作物的产量，效果非常显著。所提到的农作物包括但不限于马铃薯、花生、红薯、小麦等。例如，田间实验结果显示，对于春花生产量提高13.3％，红薯产量提高6.93％；添加至复合肥中红薯产量提高5.8％。
35.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
36.实施例1菌株的分离与筛选
37.从春红薯根际土中采用平板涂布法和平板划线法分离获得枯草芽孢杆菌枯草亚种。包括如下步骤：
38.(1)枯草芽孢杆菌枯草亚种的分离筛选：在河南省开封市通许县张营乡朱化岗村沙壤土中选取健康春红薯根际土进行筛选。具体步骤为：将植株根部土体土轻轻抖落，然后将根部放入装有200ml无菌水的三角瓶中，震荡10分钟，收集土壤悬液，离心收集土壤，称取1g放入100ml无菌水中，150rpm，30℃条件下振荡30min，然后进行梯度稀释，至104倍，选取3个梯度，每个梯度3个平行，在30℃培养箱中培养2d后选取不同菌落形态的菌株在lb培养基上划线，定期观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，分别编号保存，编号为ly005、a21、a100、a197。
39.(2)促生功能菌的筛选。
40.采用平皿促生试验进行筛选，制备lb培养液，将筛选出的各菌株进行摇瓶，30℃，180rpm，培养3天，收集发酵液，然后将发酵液稀释200-300倍，每个培养皿中放入20粒小麦种子，并将稀释完成的发酵液加入5ml，于25度培养箱中培养3-5天，检测芽长，以纯水作为对照，试验结果如表1所示。
41.表1不同菌株对小麦种子的促生效果
42.菌株a21a197a100ly005对照
芽长cm2.602.812.973.212.11比对照提高％23.2233.1840.7652.13/
43.(3)代谢产物鉴定
44.将编号为ly005菌株在lb培养液中培养3天，然后取10ml发酵上清液，用2倍体积的乙酸乙酯萃取，旋蒸蒸发浓缩至2ml，用少量乙腈进行复溶，转入液相瓶，备用。采用 hplc-ms对发酵上清液进行检测分析，结果显示代谢物中含有3-吲哚乙酸等促生物质。
45.实施例2菌株的鉴定
46.对实施例1编号为ly005的菌株分别进行形态特征、生理生化特性以及分子生物学分析。
47.(1)形态特征：
48.革兰氏染色呈阳性，菌体杆状。在tsa培养基上，菌落近圆形，浅黄色，边缘呈矩齿状，如图1所示。
49.(2)生理生化特性：
50.通过微生物脂肪酸快速鉴定系统(midi)检测编号为ly005的菌株的脂肪酸组成，可知该菌株的主要脂肪酸为c15:0anteiso、c15:0iso、c17:0anteiso和c17:0iso，其含量分别为42.09％，12.85％，18.71％和10.36％，符合芽孢杆菌属(bacillus)的主要细胞脂肪酸特征。
51.api 50ch检测结果：阳性反应有l-阿拉伯糖、核糖、d-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α-甲基-d-葡萄糖甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、蔗糖、海藻糖、糖原、拢牛儿糖和d-松二糖；弱阳性反应有甘油、肌醇、山梨醇、n-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、麦芽糖、菊糖、淀粉和葡萄糖酸盐；阴性反应有对照、赤藓糖、d-阿拉伯糖、l-木糖、阿东醇、β-甲基-d-木糖甙、半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫矛醇、α-甲基-d-甘露糖甙、乳糖、蜜二糖、松叁糖、棉籽糖、木糖醇、d-来苏糖、d-塔格糖、d-岩糖、l-岩糖、d-阿拉伯糖醇、l-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐和5-酮基-葡萄糖酸盐。api 50ch结果表明该菌株符合芽孢杆菌属(bacillus)的生化代谢特征。
52.(3)分子生物学特性：
53.1)16s rdna基因序列(1417bp)及系统发育分析
54.gcggctggctcctaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtg tgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcg attactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaa cagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgta gcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcc tccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagat caagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgac aaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtc agaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctc caccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactcc ccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaaca cttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctcccca cgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttc ctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcact caagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagac ttaagaaaccgcctgcgag
0.50％，磷酸氢二钾、磷酸二氢钾各0.2-0.3％，碳酸钙、氯化钠0.1-0.15％，消泡剂0.3-0.5％，ph 调节为7.0。
64.参照上述方法分别制备解淀粉芽孢杆菌菌剂，地衣芽孢杆菌菌剂，侧孢芽孢杆菌菌剂，凝结芽孢杆菌菌剂。然后按照表2给出的实例混合各菌剂，获得复合菌剂。
65.各菌剂复配实例如下：
66.表2各菌剂复配实例
[0067][0068][0069]
实施例4微生物肥料的制备及应用
[0070]
实施例4制备了微生物肥料，在制备微生物肥料的过程中，可以在有机无机肥、复合肥造粒后，在包膜工段添加，制备成肥料。具体分别将实施例3中制备的复合菌剂在有机无机肥、复合肥包膜工段与防结粉混合均匀后按照1-5
‰
添加，待稳定生产后所得相应的肥料，即为微生物肥料，经测定所制备的微生物肥料中每克有效活菌数均≧0.2亿cfu。其中所用到的有机无机肥为15-40/s(15-8-17)，所用到的复合肥为15-8-20/s。
[0071]
然后将所制备的微生物肥料进行田间效果的验证，实验在河南省开封市通许县以及河南省驻马店市正阳县开展，作物包括红薯和春花生。所用肥料为上述微生物肥料(添加量均为2
‰
，每克有效活菌数≧0.2亿cfu)：生物有机无机肥15-40/s(15-8-17)，微生物复合肥15-8-20/s。
[0072]
春花生于河南省驻马店市正阳县开展，共设置对照组1、对照组2和试验组三组处理，每组处理3小区，每个小区60m2，肥料施用量为50kg/亩。对照组1为常规施肥，对照组2 为施用市场购买的微生物菌肥15-40(每克有效活菌数≧0.2亿cfu)，试验组为施用上述制备的生物有机无机肥15-40/s(15-8-17)，根据菌剂复配实例对应设置10个试验组。其具体效果表现见表3。
[0073]
表3春花生各处理试验效果
[0074][0075]
试验结果显示试验组所用生物有机无机肥效果整体较好，产量相比对照组1增加 11.97～14.40％，比对照组2增加3.81～6.06％。
[0076]
红薯于河南省开封市通许县开展，共设置对照组1、对照组2、试验组1-20，每组处理 3小区，每个小区60m2，对照组1为常规有机无机肥，对照组2为常规复合肥，试验组1-10 为生物有机无机肥15-40/s(15-8-17)，试验组11-20为微生物复合肥15-8-20/s。对照组1 和试验组1-10肥料施用量为40kg/亩。对照组2和试验组11-20肥料施用量为50kg/亩。其具体效果表现见表4、表5。
[0077]
表4生物有机无机肥红薯试验各处理效果
[0078][0079]
表5微生物复合肥红薯试验各处理效果
[0080][0081]
试验结果显示试验组所用生物有机无机肥15-40/s(15-8-17)，产量相比对照组1增加 5.56～8.25％；所用微生物复合肥相比对照组2产量增加2.29～6.84％。
[0082]
综上所述，含有该枯草芽孢杆菌枯草亚种ly005的微生物肥料对于花生和红薯均具有增产增收的作用，说明该菌株具有促进作物生长，提高作物产量的功能，尤其与有机无机肥相结合效果更为突出。
[0083]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“实施方式”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0084]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。