监测细胞扩增的改进和与监测细胞扩增相关的改进的制作方法

1.本发明涉及用于监测细胞扩增的设备和方法，特别是用于通过分析挥发性有机化合物(voc)来估计在通常封闭的生物反应器中的细胞扩增期间的细胞密度的设备和方法。


背景技术：

2.已经报道了细胞技术中voc应用的一些发展，例如：在过程分析技术(pat)中，已知来自细胞培养物的下游voc排放可以被用于在线生物过程监测的软传感器利用。这方面的一些实例已经通过用各种技术测量细胞voc来证明。已知使用所谓的“电子鼻”，其是化学反应/结合的监测，来显示与生物反应器中的生长相关的跟踪的中国仓鼠卵巢(cho)细胞的总voc曲线1。从大肠杆菌(escherichia coli)分批培养的voc曲线预测生物质和生长速率2，并且voc用于检测动物细胞反应器培养物中由于微生物和病毒污染(包括大肠杆菌(e. coli))引起的voc变化3。然而，上述电子鼻技术的一个主要缺点是缺乏结构信息来确信地鉴定化学物类，这将是在任何分析中评估靶向voc的生物学相关性的重要步骤。此外，那些传感器随时间而漂移，并且必须不断地重新校准、重新生成或更换。
3.其它报道已经指出，顶部空间中voc含量的变化可以从哺乳动物细胞使用传统质谱法测量，并且那些变化与单基因表达水平相关4。质谱法技术提供用于化合物鉴定的另外的信息，并且已经趋向于作为在线传感器结合到反应监测中5，包括生物反应器。将质子转移反应-质谱法(ptr-ms)结合到大肠杆菌生物反应器中，并且voc曲线与培养物生长相关6。
4.1. bachinger, t.; riese, u.; eriksson, r.; mandenius, c. f., monitoring cellular state transitions in a production-scale cho-cell process using an electronic nose
‑ꢀ
j biotechnology and bioengineering 2000, 76 (1), 61-71. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10784297，公开了通过“鼻”(即化学反应或分子结合)的方式对生物培养物(cho细胞)的废气取样，以检测细胞培养物中的变化。
5.2. bachinger, t.; martensson, p.; mandenius, c. f., estimation of biomass and specific growth rate in a recombinant escherichia coli batch cultivation process using a chemical multisensor array
‑ꢀ
j biotechnology and bioengineering 1998, 60 (1-2), 55-66. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9571802，公开了用于细菌培养监测的多传感器阵列。
6.3. kreij, k.; mandenius, c. f.; clemente, j. j.; cunha, a. e.; monteiro, s. m. s.; carrondo, m. j. t.; hesse, f.; molinas, m. d. m. b.; wagner, r.; merten, o. w.; geny-katinger, c.; martensson, p.; bachinger, t.; mitrovics
‑ꢀ
on-line detection of microbial contaminations in animal cell reactor cultures using an electronic nose device. j cytotechnology 2005, 48 (1-3), 41-58. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3449723/公开了电子鼻(en)装置的使用，用于检测多种动物细胞培养系统中的微生物和病毒污染。
7.4. aksenov, a. a.; gojova, a.; zhao, w.; morgan, j. t.; sankaran, s.; sandrock, c. e.; davis, c. e., characterization of volatile organic compounds in human leukocyte antigen heterologous expression systems: a cell's "chemical odor fingerprint". chembiochem 2012, 13 (7), 1053-1059.5. ray, a.; bristow, t.; whitmore, c.; mosely, j., on-line reaction monitoring by mass spectrometry, modern approaches for the analysis of chemical reactions. mass spectrom rev 2018, 37 (4), 565-579.6. luchner, m.; gutmann, r.; bayer, k.; dunkl, j.; hansel, a.; herbig, j.; singer, w.; strobl, f.; winkler, k.; striedner, g., implementation of proton transfer reaction-mass spectrometry (ptr-ms) for advanced bioprocess monitoring. j biotechnology and bioengineering 2012, 109 (12), 3059-3069. 公开了用于将voc与培养物生长关联的ptr-ms。
8.尽管如上所述，但是在实验室细胞扩增中，在细胞产生的voc的化学物类和量方面仍然存在空白。此外，还没有解决监测voc过程中的实际问题，例如如果取样的话保持无菌。


技术实现要素：

9.发明人已经认识到上述问题，并且还认识到，使用非侵入性方法，可以将来自生物反应器的voc曲线与在相当长的细胞扩增时间段内的细胞密度相关联。他们的发现显示，例如对于cho和t细胞两者（其分别是用于生物过程工程和细胞免疫疗法工作流程的重要细胞表达模型），可以使用voc曲线估计细胞数量，特别是在随时间监测voc的情况下，并且利用估计的细胞数量来控制过程参数。随时间，估计的细胞数量还提供细胞生存力、健康和/或营养物利用的指示。
10.本文中，术语挥发性有机化合物(voc)包括溶解或悬浮在固体、液体或气体(包括悬浮在气体中的蒸汽或液滴)中的有机化合物，以及被分类为半挥发性(svoc)的有机化合物。
11.总之，本文的公开内容提供了如何从中国仓鼠卵巢(cho)细胞和t细胞生物反应器废物中测量voc的细胞排放的细节，目的是非侵入性地在代谢上描绘扩增过程的曲线。例如，使用吸附元件(在这种情况下，涂布聚二甲基硅氧烷(pdms)的磁力搅拌棒)直接从气体排放管线进行测量，其经历随后的气相色谱法-质谱法(gc-ms)分析。从仅填充有液体培养基(即没有细胞)的生物反应器观察细胞培养物的基线voc曲线，以及与8天过程内的细胞扩增相关的独特的voc曲线。建立偏最小二乘(pls)回归模型以基于cho和t细胞的voc曲线预测细胞培养密度(基于验证数据集，分别r2=0.671和r2= 0.769)。t细胞运行产生与细胞扩增相关的47种化合物，而cho细胞运行产生45种化合物；推定地鉴定每种细胞类型的20种最相关的化合物。在最后的实验日，将覆盖吸附剂的搅拌棒直接放置在接种细胞的培养基中和培养基对照中。来自含有细胞的用尽的培养基的基于液体的测量可以与仅培养基的对照区分，指示在扩增期间细胞分泌的可溶性voc。进行pls判别分析(pls-da)，并且在接种t细胞的培养基和培养基对照之间96种化合物不同，对于cho细胞为72种化合物不同。推定地鉴定了每种细胞系的20种最相关的化合物。该工作证明，基于voc的检测器可以结合在生物反应器气体和液体废物体积中，以非侵入性地监测细胞健康，并利用适当的控制系统实时优
化细胞扩增条件。例如，通过基于voc的强度监测随时间的细胞扩增，可以提供细胞生存力、健康和/或营养物利用的指示。
12.根据一个方面，本发明提供了用于监测在生物反应器中由细胞培养过程产生的细胞扩增期间的细胞密度的方法，所述方法包括以下步骤：a)根据具有细胞培养参数的细胞培养过程在生物反应器培养室中培养细胞；b)在所述过程期间，引入细胞培养流体输入并产生废料；c)测定所述废料中挥发性有机化合物(voc)及其化学物类的强度；和d)基于所述测定来估计所述生物反应器中细胞的密度或群体。
13.所述方法可以进一步包括以下步骤：e)基于所述估计步骤控制与所述细胞培养过程相关的至少一个过程参数。
14.所述方法可以进一步还包括以下步骤：f)基于随时间的细胞的估计的密度或群体提供细胞生存力、健康和/或营养物利用的指示。
15.在实施方案中，所述废料包括生物反应器顶部空间气体，和/或过滤的液体废物，并且所述voc分别包括气相和/或溶解的或悬浮的voc。
16.在实施方案中，在所述测定之前从所述生物反应器室分离或去除所述废料。
17.在实施方案中，所述分离通过分离过滤器实现，所述分离过滤器仅允许气体从所述室穿出，并且抑制污染物进入所述室中。
18.在实施方案中，在所述过程期间或之后，在所述测定之前从所述废料中收集所述voc。
19.在实施方案中，所述收集包括将所述废料暴露于收集元件，例如化学吸附或吸收元件，并且所述测定步骤包括将所述收集的化学物质置于检测器元件，例如质谱法(ms)或质子转移反应ms，以提供所述voc的强度和曲线。
20.在实施方案中，连续地、周期性地或间歇地进行所述收集和所述测定。
21.在实施方案中，所述估计包括评估所述voc浓度/曲线的变化和/或变化率。
22.在实施方案中，所述细胞是cho或t细胞，并且细胞密度的估计包括测量烷烃、烯烃、炔烃、羰基化合物、酯、醇、芳烃、酸、酰胺、胺、碳水化合物、类固醇、蛋白质、核酸和肟中的一种或多种的浓度。
23.在实施方案中，所述测量包括voc浓度增加的测量，所述voc例如二十二烷和/或其它烷烃。
24.在实施方案中，a)当所述细胞是cho细胞时，则所述测量包括voc浓度降低的测量，或b)当所述细胞是t细胞时，则所述测量包括voc浓度降低的测量，所述voc例如苯甲醛和/或其它醛。
25.在实施方案中，voc的比率(例如测量的烷烃、烯烃、炔烃、羰基化合物、酯、醇、芳烃、酸、酰胺、胺、碳水化合物、类固醇、蛋白质、核酸和肟的比率)用于测定细胞密度/浓度。
26.在实施方案中，e)控制与所述细胞培养过程相关的至少一个过程参数包括改变或增强细胞培养参数和/或细胞培养流体输入。
27.在实施方案中，e)控制与所述细胞培养过程相关的至少一个过程参数包括调节化学和生物物理参数以进一步增加扩增、告知收获决定、和通过培养基改变来控制化学环境。
28.根据进一步的方面，本发明提供了细胞培养系统，其被布置用于监测由细胞培养过程产生的细胞扩增期间的细胞密度；所述系统包含：a)生物反应器，其包括适于培养细胞的培养室；b)控制器，其用于根据细胞培养参数进行细胞培养过程；c)至少一个细胞培养流体输入和至少一个废料输出；d)存在于所述废物输出中或所述废物输出处的一个或多个voc传感器或收集器；和e)用于测定所检测或收集的voc及其化学物类的强度的装置。
29.可以进一步将所述控制器配置成基于所检测或收集的voc的测定的强度和特定化学物类的特定组合来估计所述生物反应器中细胞的密度或群体。
30.可以进一步将所述控制器配置成基于随时间的细胞的估计的密度或群体来提供细胞生存力、健康和/或营养物利用的指示。
31.所述系统可以进一步包含：e)基于细胞的估计的密度或群体控制与所述细胞培养过程相关的至少一个过程参数的装置。
32.在实施方案中，所述至少一个废料体积包括：用于顶部空间废气的生物反应器顶部空间、废气出口、室中的收集废弃流体的区域、流体废物收集管线或容器、流体循环管线和/或固体废物收集管线或容器。
33.在实施方案中，所述一个或多个voc收集器包括收集元件，例如至少部分地在所述废料体积内的吸附元件。
34.在实施方案中，所述系统进一步包括分离过滤器，所述分离过滤器仅允许气体从所述室穿出，并且抑制污染物进入所述室中，并且其中所述废料体积在所述过滤器的下游，从而将所述体积与所述室分离。
35.在实施方案中，用于测定所收集的voc及其化学物类的强度的装置是化学检测器，例如质谱法(ms)或质子转移反应ms。
36.在实施方案中，基于所述估计控制与所述细胞培养过程相关的至少一个过程参数的装置是所述控制器，所述控制器适于响应于所收集的voc及其化学物类的强度的测定和基于voc的测定的强度在所述生物反应器中细胞的估计的密度或群体来改变所述细胞培养参数。
37.在实施方案中，所述控制器适于调节化学和生物物理参数以进一步增加扩增，告知收获决定，并通过培养基改变来控制化学环境。
38.本发明延伸到本文所公开的特征的任何组合，无论这样的组合是否在本文中明确提及。此外，在两个或更多个特征被组合提及的情况下，旨在这样的特征可以被单独地要求保护而没有延伸本发明的范围。
附图说明
39.本发明可以以多种方式实施，下面参考附图描述其说明性实施方案，其中：图1a示意性地显示典型的生物反应器系统；图1b、c、d和e显示在不同时间使用的图1a的生物反应器；
图2显示voc排放的用图形表示的主成分分析(pca)结果，更详细地，来自四个生物反应器(两个cho，两个t细胞培养物)的顶部空间挥发性化合物排放的pca。通过扩增的天数(最小：第1天，最大：第8天)来估量细胞培养样品的大小。a)生物反应器袋和气体对照、培养基对照和细胞培养样品的比较，它们沿着pc 1分离。b)在八天扩增期间的细胞培养样品表现出沿着pc 1的voc曲线变化；图3以图形显示预测的和通过实验获得的细胞计数结果之间的相关性，更详细地，显示由a) cho细胞和b) t细胞的voc曲线建立的pls回归模型。将样品随机分成66%校准组和33%验证(测试)组。以每ml培养基报道了细胞计数；图4以图形显示从生物反应器获得的某些挥发性基团的含量(y轴)随天数(x轴)的变化，更详细地，该图显示与细胞培养物扩增最相关的20种voc在8天内如何变化。通过分级聚类将化合物分成4个聚类。在表1中找到每个聚类中的voc，并且将其表示为归一化为化合物内的最大强度(归一化的强度)。a) cho细胞，b) t细胞。每个点是n=8次重复(4次技术重复
×
2次生物学重复)的平均值。
40.图5以图形显示从生物反应器获得的某些挥发性基团的含量(y轴)随天数(x轴)的减少，更详细地，在细胞扩增期间减少的voc (来自聚类4，图4)，包括气体和袋(g&b)对照和培养基对照。a) cho细胞，b) t细胞。每个点是n=8次重复(4次技术重复
×
2次生物学重复)的平均值；图6显示来自培养基对照和来自接种的培养基的液体培养基中溶解的voc的用图形表示的主成分分析结果；图7显示根据常规技术测量的活细胞密度，其是在上图中说明的实验期间测量的；和图8显示在与图7的图中测量的相同的细胞培养期内测量的细胞培养代谢物。
具体实施方式
41.结合附图，通过参考以下描述，可以更好地理解本发明及其目的和优点，其中相同的附图标记表示附图中相同的元件。
42.细胞培养方法使用ficoll密度梯度从2个供体的血沉棕黄层(来源于canadian blood services)分离原代t细胞，并在t烧瓶中培养6天，然后在1l t细胞培养基中以约7
×
105个细胞/ml接种于xuri cell expansion system (ces, ge healthcare)。t细胞培养基是具有1%青霉素-链霉素(hyclone)、5%人ab血清(gemcell)和350 iu/ml的xuri il-2的xuri expansion medium (ge healthcare)。在t烧瓶中，在具有1%青霉素-链霉素和2 mm l-谷氨酰胺(hyclone)的actipro (hyclone)培养基中培养cho-m细胞(ge healthcare, uppsala, sweden的courtesy)。将cho细胞在1l中以约2
×
105个细胞/ml的量接种于xuri ces。
43.将四个具有溶解的氧(do)和ph传感器的2l的xuri cellbags (每个的工作体积为1l)连接到xuri ces。用压缩空气和5% co2将2l cellbag充气，然后用200 ml培养基放置过夜以平衡do/ph传感器。温度设定为37℃，并且平台设定为以6
°
角以10次摇动/分钟(rpm)摇动。每小时两分钟，平台以2
°
角以2 rpm摇动。使用基于乳酸盐测量以及细胞密度的组合的逐步方案来启动灌注。低于2
×
106个细胞/ml，不启动灌注。高于2
×
106个细胞/ml，对于在2
×
10
6-10
×
106个细胞/ml之间的vcd以0.5 l/天灌注培养基，对于在10
×
10
6-15
×
106个细胞/ml之间的vcd以0.75 l/天灌注培养基，以及对于大于15
×
106个细胞/ml的vcd以1 l/天灌注培养基。在乳酸盐强度超过20 mm的情况下，不考虑vcd，启动1 l/天灌注。
44.生物反应器voc废气测量图1a示意性地显示用于本发明的细胞培养生物反应器的实例。其中生物反应器100显示为矩形刚性的通常封闭的容器101，尽管也可以使用如上所述的以商标名称xuri cellbags可商购获得的柔性袋类型生物反应器和具有半渗透膜壁的容器。在大多数情况下，气体和液体入口110/120用于引入氧气、细胞和细胞营养物，并且在一些系统中，再循环已经在过滤器等中与废料分离的细胞，使用液体废物管线140从生物反应器中去除。废气可以经由气体出口130去除，以便经由入口110为新的气体让路。在下面更详细描述的实验中，使用顶部空间吸附元件(hsse)技术测量来自生物反应器的气体排放(废物)管线的细胞培养voc排放。在另一个实施方案中，已知的voc传感器132和134可以以相同的效用使用，并且然后将提供voc的实时监测，并且在检测范围受限的情况下，也提供svoc监测。另外，voc可以通过替代传感器136在废物液体出口140中测量。这样的检测还可以包括非挥发性oc。使用的生物反应器将含有液相细胞培养物104和气体顶部空间102。生物反应器将在控制器150的控制下，该控制器可以是本地的或远程的，并且可以是共享的。
45.生物反应器气体排放经由ptfe管被引导通过加盖的硼硅酸盐罐的盖。所用的每个生物反应器与单个罐连接，并且在整个实验过程中使用相同的罐。每个罐含有四个无菌且预处理的hsse搅拌棒(“twisters
®”
, part 011222-001-00, gerstel us, linthicum heights, md)，通过磁体保持在罐的侧面，提供每个样品四次技术重复。可商购获得的hsse棒长10 mm，并且含有0.5 mm厚的聚二甲基硫醚(pdms)吸附剂。让twisters
®
以24小时的增量提取细胞培养物voc。在这段时间之后，从罐去除盖，收集四个twisters
®
并用四个新的hsse棒代替，并将盖拧回到罐上。
46.液相原位voc测量使用twisters
®
在搅拌棒吸附提取(sbse)浸渍技术中进行最后的时间点测量以检查溶解在液体培养基中的voc。这直到实验结束才进行，以降低细胞培养污染的风险。在实验的最后24小时期间，经由cellbag生物反应器上的端口将四个无菌的twisters
®ꢀ
(在70%乙醇中浸泡10分钟)直接滴入到每个细胞培养物中。一旦提取完成(24小时)，将生物反应器袋切开并收集twisters
®
。此时实验结束，并破坏细胞。对于仅培养基对照，将另外的twisters
®
直接放置在20 ml每种类型的无细胞培养基中24小时，并在与培养相同的温度下孵育。
47.时间过程说明图1 b、c、d和e示意性地显示用于上述培养的生物反应器系统，在细胞培养过程期间(在这种情况下，约8天)的不同时间的使用进行了说明。在培养基平衡前一天(图1b，第-1天)，用空气流(压缩空气 5% co2)将四个空的xuri cellbags连接到xuri单元，并收集“袋和气体对照”以测量背景voc。加入培养基的那天(图1c，第0天)，两个生物反应器加入200 ml t细胞培养基，并且两个反应器加入200 ml cho培养基；收集“培养基对照
”ꢀ
(在这天期间没有培养基灌注)。在细胞接种那天(图1d，第1天)，用它们各自的细胞系接种生物反应器。在细胞扩增的8天内进行hsse voc测量。在第8天(图1e)，同时收集液体sbse测量结果和
hsse测量结果。每3-4天，将四个未使用的twisters
®
拉到旁边作为“吸附剂对照”，其用作运输和处理对照以确保未知来源的voc不损害实验。
48.每天两次，从生物反应器收集等分试样(5-10 ml)用于测量培养物属性/代谢物：活细胞密度(vcd)、%生存力、谷氨酰胺、谷氨酸盐、葡萄糖、乳酸盐、铵、钠、钾、钙、ph和po2。在nucleocounter nc-200 (chemometec, allerod, denmark)上测量vcd和生存力。在bioprofile flex 2 analyzer (nova biomedical, waltham, ma)上进行代谢物测量。
49.twister
®‑
gc-ms分析对于t细胞有2次生物学重复，并且对于cho细胞有2次技术重复，其中每个时间点各自有4次技术重复。所有的twisters
®
在使用前都根据制造商的说明预处理。
50.一旦从细胞培养反应器中提取twisters
®
，就将它们放置在2 ml硼硅酸盐小瓶中，并将第一内标的等分试样(1 μl在乙醇溶液中的1 ppm萘-d8)移液到每个小瓶中。将twisters
®
保持冷冻直至分析。就在分析前，将它们与第二内标的等分试样(1 μl在乙醇中的0.1 ml/l癸烷-d22)一起转移至热解吸管中。
51.使用热解吸单元(tdu, gerstel us)和冷却的注射系统(cis, gerstel us)对单个twisters
®
热解吸。最初将tdu设定为30℃下0.5分钟，并以60℃/分钟加热直至达到300℃并保持3分钟。氦气流将解吸的分析物导入保持在-80℃的cis中。解吸后，以12℃/s将cis加热至300℃并保持3分钟。该过程将分析物无分流地注入到gc柱的头部上。
52.在配备db-5ms柱(30 m
×
250 μm
×
0.25 μm，agilent technologies inc.)的agilent 7890a gc (agilent technologies inc., santa clara, ca)上进行色谱法。该柱最初在35℃下保持3分钟，然后以2℃/分钟加热至200℃，然后以30℃/分钟加热至300℃并保持5分钟。总运行时间为93.8分钟。gc以恒流方式(1.5 ml/min氦气)操作。将分析物洗脱到5975c单四极质谱仪(ms, agilent technologies inc.)中。ms从33至300 m/z扫描。其源和四极分别设定为230℃和150℃。
53.每约20次注射进行tdu-cis-gc-ms系统的烘烤。每30-40次gc-ms注射后，分析c8-c24烷烃的标准混合物以用作仪器的外部对照，并且还计算化合物的kovats保留指数。
54.gc-ms数据处理使用profinder (b.08.00版，agilent technologies inc.)上的递归特征提取对gc-ms数据文件进行去卷积和比对。将峰面积对第一内标进行归一化。去除具有硅氧烷基础峰(73、147、207、221和281 m/z)的特征。使用genespring (b.14.9版，agilent technologies inc.)和pls_toolbox (8.6版，eigenvector research inc., manson, wa)进行统计分析。自始至终将p《0.05的p值用于显著性。通过与nist 14质谱数据库光谱匹配并将计算的kovats保留指数比较与报道的文献值比较可以进行推定的峰鉴定。
55.为了模拟与细胞生长相关的voc曲线的变化，将来自两个cho细胞反应器的hsse数据汇集在一起，并将来自两个t细胞反应器的voc数据汇集在一起，并自动定标数据。在这两组的每组中，数据随机分开：对于校准训练组为67%，而对于验证组为33%。使用pls_toolbox软件(eigenvector research inc., manson, wa)应用偏最小二乘回归(pls)将活细胞密度(y空间)与voc曲线(x空间)关联。使用venetian blinds技术进行交叉验证，其中将校准数据分成10个随机的碎片，并且使用每个碎片一个样品来交叉验证该模型。为了将强度变化相似的化合物进行聚类，使用matlab r2017a软件(mathworks, natick, ma)中的最短距
离算法应用凝聚分级聚类。
56.将sbse数据分成两种细胞类型和它们各自的对照。对每种细胞类型进行pls-判别分析(pls-da)以分类地区分培养基对照与细胞样品。
57.结果和讨论细胞扩增在培养基接种时，每个反应器中cho细胞的浓度分别为2.2
×
105个细胞/ml和2.6
×
105个细胞/ml，并且t细胞的浓度为7.0
×
105个细胞/ml和8.0
×
105个细胞/ml (图7)。在实验结束时，大多数生物反应器将细胞密度增加到16-30倍，指示在xuri ces中在培养持续时间期间呈指数生长。在实验的最后一天，cho反应器之一(cho 2)经历无关的技术问题，并失去其大部分培养基，导致在第8天cho 2反应器的细胞密度突然增加。从随后的pls回归分析中去除这些样品(见下文)。
58.在图8中还提供在xuri ces中培养持续时间的测量的代谢物。单价和二价阳离子(例如k 、ca2 和na )在整个实验中具有相当稳定的水平。如所预期的，在最初的培养天数期间，在xuri ces中，po2、谷氨酰胺和葡萄糖浓度随着这些代谢物的消耗而下降，并且随着这些副产物的积累，乳酸盐和氨上升。类似地，在培养的早期阶段观察到相应于乳酸盐增加的ph的伴随降低。灌注启动后，几乎所有代谢物都达到稳态水平。
59.下游生物反应器排放物的voc曲线将主成分分析(pca)应用于所有hsse样品(图2上图)。两种对照类型(培养基、气体和袋)的voc曲线与含有细胞的生物反应器不同。细胞样品沿pc 1与对照分离，这解释了20.02%的变化。pca是在其分析中不考虑关于样品的元信息(例如样品处理或类型)的无监督方法。相反，pca仅绘制gc-ms样品之间的变化。沿着第一主成分使对照样品与细胞样品分开，这表明具有cho和t细胞的生物反应器排出细胞voc的水平使得它们可与仅填充有培养基的生物反应器区分开。
60.除了与对照分离之外，存在细胞类型分离的趋势(图2下图)。t细胞样品具有沿着pc 2与cho细胞样品分离的趋势，这解释了12.33%的变化，指示在细胞类型中独特的voc曲线。更有趣的是沿着pc 1发生的样品的逐渐移动，这解释了14.47%的变化。pc 1显示与实验天数的强相关。在生物反应器控制反应器的所有条件(气体流动、培养基灌注、温度等)的情况下，强烈怀疑沿着pc 1的移动与活细胞密度相关，活细胞密度随着实验天数而增加(图7)。
61.在任何统计分析(包括pca)之前，将样品相对于内标归一化。这种实践将考虑由gc-ms仪器引起的任何潜在的信号漂移。此外，内标结果的可视化没有显示出仪器漂移的发生(数据未显示)，证实voc曲线的变化必须与生物反应器的变化相关。
62.为了将细胞生长与voc曲线相关联，建立两种pls回归模型，一种用于cho细胞，并且一种用于t细胞。在每种细胞类型内，67%的数据用于训练和校准pls模型，然后将该pls模型应用于剩余的33%作为盲法验证组。模型显示活细胞密度和使用hsse-gc-ms提取技术收集的voc曲线之间的相关(图3)。基于r2值，t细胞模型相对于cho细胞具有稍微更好的线性拟合(表1)；尽管两种细胞模型在高r2值时表现非常好。作为准确性的量度，t细胞具有稍微更高的均方根误差(rmse)，即使当对细胞计数的范围(最大细胞计数减去最小值)归一化时。在验证组中，t细胞具有比cho细胞高两倍的归一化的rmse，尽管通常所有这些mrse值都
相当低。
63.表1：来自将voc曲线与活细胞密度相关的两个pls模型的线性相关(r2)、均方根误差(rmse)和归一化的rmse (nrmse，对细胞计数范围归一化) (图3)。
64.在pls分析中，为每个变量(在这种情况下，感兴趣的化学voc)产生投影变量重要性(vip)分数。vip分数大于1的变量通常被认为与回归相关。t细胞具有47种vip》1的化合物，而cho细胞具有45种化合物；在两种细胞系之间26种化合物重叠。
65.对于t细胞模型的20种具有最高vip分数的化合物和对于cho模型的20种具有最高vip分数的化合物进行推定的鉴定(表2)。27.0%的这些化合物被分类为烷烃类型，而15.4%是酯、7.7%是醇、7.7%是肟和23.0%是其它，以及19.2%未知。
66.通过使用hsse-gc-ms，我们相信我们是报道在细胞扩增期间在生物反应器中cho和t细胞释放的voc的特征的第一个团队。没有其它研究提供比较，我们将这些结果与其它细胞培养实验进行比较，并且发现在本工作中鉴定的voc的类型通常是一致的。发现2-乙基-1-己醇与人喉癌细胞的病毒感染相关。已经在人成纤维细胞(hfb)的排放中观察到16个苯甲醛。已经在人b-类淋巴母细胞的培养物中观察到17个酯。已经在上皮细胞培养物中观察到18个烷烃和醇。15个虽然已知的背景化合物不包括在统计分析中，例如来自pdms吸附剂的硅氧烷和gc柱渗出物，邻苯二甲酸酯可能是来自生物反应器系统内的塑料的人为效应。
67.表2：基于下游生物反应器voc排放。对于t细胞回归模型的20种具有最高vip分数的化合物和对于cho细胞回归模型的20种具有最高vip分数的化合物的推定鉴定(图3)合并在一个表中。ki：kovats指数，计算值(calc)和文献报道值(lit)；ms分数：与nist质谱数据库比较的所获取的质谱的分数；聚类：适用于图4中的聚类的组。
68.一些化合物随着细胞扩增而强度增加，而其它化合物随着细胞扩增而强度降低。为了通过变化模式而对化合物分组，将分级聚类应用于来自表2的前20个cho化合物和20个t细胞化合物。以这样的方式划分每个树状图以产生voc的四个聚类。将每个聚类作图以证
明在8天细胞扩增过程中化合物的强度(图4)。cho和t细胞两者都表现出在细胞扩增过程中增加的化合物(聚类1化合物)。两种化合物在两种细胞系中随时间而增加：二十二烷和未鉴定的烷烃。两种细胞类型都有一种化合物，其增长直到第3-4天，然后突然消失(cho：聚类3，未知10；t细胞：聚类2，苯甲醛)。随时间增加的化合物可能是来自细胞培养物的直接排放。这些化合物可以直接监测，并用于基于voc的pat。通过测量下游voc排放，不存在污染细胞培养物的风险，而目前的情况是从反应器中抽取5-10 ml以手动测量细胞计数。基于voc的pat可以提供相当大的成本节约，因为其具有评估细胞培养健康的非侵入性能力。
69.这些最相关的voc中的大部分在细胞扩增期间减少(聚类4化合物，图4)。图5包括具有这些减少的化合物的气体和袋对照以及培养基对照。在引入细胞之前，所有化合物都存在于生物反应器对照中。因此，在扩增期间可能培养物正代谢这些化合物。尽管正在进行培养基灌注，但该速率可能不够快，以至于补充这些化合物与细胞消耗它们一样快。这为voc开发提供了另一个机会：除了监测细胞培养物释放的voc，还可以监测培养基中发现的营养物并调节灌注速率以提供足够的生长材料用于最佳的细胞生长。
70.细胞培养物的液相voc曲线在生物反应器袋中直接进行的sbse测量比生物反应器气体排放的hsse测量从培养基对照分离出更多的细胞voc。这些液相提取的pca (图6)显示两种细胞类型和培养基对照之间的明显差异，其在pc 1和pc 2之间分开，解释了总共57.24%的变化。
71.进行两次pls-da分析，将液体培养基对照与各自的细胞系区分。类似于pls回归，对每个变量(在这种情况下，化学voc化合物)指定vip分数。cho细胞具有72种vip分数》1的化合物，而t细胞具有96种化合物，其中在细胞系之间有43种重叠。在下游voc排放测量(hsse)和接种细胞的液体测量(sbse)两者中，t细胞具有16种vip分数》1的化合物；对于cho细胞有9种这样的化合物。
72.推定地鉴定了每种细胞类型的20种具有最高vip分数的化合物(表3)。并非所有这些化合物都存在于液体培养基对照中。与hsse相比，sbse提取了更多的更高分子量的化合物。许多含有芳环(甲苯、酚、苯甲酸、苯甲醛、苯乙酮等)。一种化合物(未知10)出现在表2和表3两者中，在hsse和sbse测量两者中仅在cho细胞中具有重要性。
73.一些化合物似乎与甲羟戊酸途径有关。胆固醇对细胞膜功能和类固醇合成重要，在cho和t细胞生物反应器两者中推定地鉴定了胆固醇。在cho细胞中发现香茅醇的衍生物，它可以是香叶醇的氢化产物，香叶醇是涉及胆固醇合成途径的化合物。19个对苯醌可归因于暴露于苯衍生物或作为泛醌的分解产物。萘酚(例如1-氨基-2-萘酚)可以衍生自与暴露于多环芳烃(例如增塑剂)相关的生物标志物。20个杂环化合物(例如喹唑啉、喹啉酮和吡唑)可以由其它类固醇得到。
74.表3：基于直接在接种细胞的培养基中进行的测量。对于t细胞pls-da的20种具有最高vip分数的化合物和对于cho pls-da的20种具有最高vip分数的化合物的推定的鉴定合并在一个表中。ki：kovats指数，计算值(calc)和文献报道值(lit)；ms分数：与nist质谱数据库比较的所获取的质谱的分数。
75.类似于气体排放，可以将化学传感器连接到生物反应器的培养基废物管线，以监测与细胞健康相关的目标化合物，或进行非目标分析以在废物流已偏离“正常”状态时警告用户。这可以通过监测生物反应器内的废物和营养物强度来帮助优化培养基灌注速率。
76.结论我们观察到随着细胞培养物在8天过程中扩增，生物反应器气体排放的特定voc曲线的移动。这些曲线用于建立可以预测细胞培养密度的pls回归模型。推定地鉴定和讨论了与cho和t细胞的细胞培养扩增最相关的挥发性化合物。另外，在实验的最后一天期间，直接在接种细胞的培养基中进行voc的测量。接种细胞的培养基样品富含液体培养基对照(不存在细胞)中不存在的voc。pls-da分析揭示与细胞培养物最相关的挥发性化合物，并且推定地鉴定和讨论。因此，已经证明，可以对生物反应器的气体或液体废物管线使用基于voc的检测方法来监测细胞健康。
77.此外，通过基于voc的检测测定细胞群体大小和/或密度，可以控制与细胞培养过程相关的至少一个过程参数。例如，与生物反应器系统连接的控制器可以适于响应于所收集的voc及其化学物类的强度的测定以及基于测定的voc的强度的生物反应器中细胞的估计的密度或群体来改变细胞培养参数。
78.因此，控制器可以调节化学和生物物理参数以进一步增加扩增、告知收获决定并通过培养基改变来控制化学环境。
79.虽然已经描述和说明了细胞培养系统的一个实施方案，但对于技术人员显而易见的是，在不背离本发明要求保护的范围的情况下，可以对这些实施方案进行添加、省略和修改。例如，本发明已经用cho细胞和t细胞进行了证明，然而，对技术人员显而易见的是，本发明可以用来评估其它细胞的群体带来同样的效果，例如，但不是排他地，用于治疗应用：其它淋巴细胞，例如所谓的自然杀伤细胞(nk细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(til细胞)；t细胞的不同亚群，例如调节性t细胞(treg细胞)；抗原呈递细胞，例如树突状细胞(d细胞)；修饰的细胞，例如嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t细胞)、γ-δ t细胞(γδ t细胞)；和用于研究，其它细胞(例如vero细胞)的细胞群体。