用二价阳离子从发酵液中回收蛋白的方法与流程

1.本发明涉及通过加入二价阳离子和提高ph从培养液中回收感兴趣的蛋白的方法。
2.发明背景
3.在工业蛋白如酶的合成步骤，发酵步骤中，实现了高滴度。这些高蛋白浓度能引起培养液中部分相从溶解转向不溶状态。可能蛋白以晶体形式存在，沉淀和/或吸附于发酵液固体上。部分溶解和不溶性蛋白使得蛋白与培养液中固体分离变得复杂，且能导致产物损失。产物损失引起的或更复杂分离工艺引起的生产成本上升决定了产物损失是可接纳或一个相内的产物浓度通过额外工艺步骤而增加。因此，建立了方法以提高液相或固相中蛋白的百分比。
4.数项专利申请针对发酵液中酶或蛋白的溶解度增加：wo 2004/003187描述通过加入多元醇、碳水化合物或聚醚来防止结晶的方法。其他专利申请描述方法以增加不溶性酶百分比和/或影响晶体形态来简化下列固液分离：us 2002/177206提出了结晶过程以达到理想的晶体形态和大小。此方法中，起始温度选择成达到理想的晶体形态且随后引入温度变化。该温度下，晶体继续以所需方式生长，结晶速率更高，且防止进一步成核。us 2011/89344提出了不同方法以增加发酵液中的不溶性酶百分比。
5.其他专利申请描述固液分离期间发酵液条件如何变化：在us 2012/220009中，应用了2种不同液体培养基(broth)条件。首先，感兴趣的蛋白通过膜保留，在条件变化后，液体培养基透过同一膜或另一膜。第一组条件还能引起沉淀或结晶。在其他文献中，特殊设备用于分离2种固相，生物质和固相酶：us 7 118 891描述了一种方法，其中发酵液用一种或多种凝结剂和/或一种或多种絮凝剂处理以形成生物质群，而群内不纳入晶体和/或无定形代谢物。絮凝的生物质随后与晶体和/或无定形代谢物悬液分开，使用固液分离设备如二相离心机。
6.在us 6,316,240中，通过调整ph为9.5-13，酶在生物质分离前溶解。wo 2008/110498描述溶解蛋白酶晶体或沉淀于发酵液的方法，这是通过稀释液体培养基、加入二价盐和调整发酵液ph值到低于ph 5.5。wo 2017/097869提出从发酵液颗粒物中溶解和/或解吸感兴趣的蛋白的方法，这是通过应用一个或多个洗涤步骤，其中洗液的ph和导电性适应于蛋白pi。
7.然而，蛋白回收期间的碱性或酸性ph处理可导致蛋白活性丧失。因此，需要用于从发酵液中回收感兴趣的蛋白的新方法，其旨在高产品收率和保护蛋白活性。
8.发明概述
9.本发明者发现向包含感兴趣的蛋白的发酵液加入二价阳离子和将发酵液ph调整到高于ph 11可产生高回收率及高保留活性的感兴趣的蛋白。
10.因此，本发明第一方面涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
11.a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
12.b)将发酵液ph调整到高于ph 11，和
13.c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
14.在一个实施方案中，所述感兴趣的蛋白是酶。
15.酶可选自淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、普鲁兰酶、蛋白酶、金属蛋白酶、肽酶、脂酶、角质酶、酰基转移酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、木葡聚糖基转移酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、植酸酶、磷酸酶、木糖异构酶、葡糖异构酶、乳糖酶、乙酰乳酸脱羧酶、果胶酶、果胶甲酯酶、聚半乳糖醛酸苷酶、裂解酶、果胶裂解酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、半乳聚糖酶、虫漆酶、过氧物酶和天冬酰胺酶，优选其中所述酶是淀粉酶或蛋白酶。
16.在另一个实施方案中，所述二价阳离子选自ca
2
、mg
2
、ba
2
、pb
2
、fe
2
、zn
2
、ni
2
、cu
2
、mn
2
、sr
2
、co
2
和be
2
。
17.在另一个实施方案中，所述二价阳离子的盐是二价阳离子的盐酸盐、硝酸盐、甲酸盐、乙酸盐、磷酸盐或硫酸盐。
18.在一个实施方案中，所述步骤a)和步骤b)同时进行，或步骤a)在步骤b)之前进行。
19.在一个实施方案中，所述ph调整到ph 11-13，优选其中所述ph可通过加入naoh来调整。
20.在另一实施方案中，所述方法还在步骤a)和/或b)之前包括微生物发酵。
21.在另一个实施方案中，所述感兴趣的蛋白通过微生物分泌入发酵液。微生物可以是细菌。细菌可选自芽孢杆菌(bacillus)、链霉菌(streptomyces)、埃希氏杆菌(escherichia)、布丘氏菌(buttiauxella)和假单胞菌(pseudomonas)。或者，微生物可以是选自以下的真菌细胞：子囊菌门、担子菌门、壶菌门、接合菌门和卵菌门，以及所有丝分孢子真菌和类酵母亚科(saccharomycoideae)。所述真菌细胞优选选自曲霉菌(aspergillus)、青霉菌(penicillium)、假丝酵母(candida)、木霉菌(trichoderma)、thermothelomyces，尤其是thermothelomyces thermophila和毕赤酵母(pichia)。
22.在一个实施方案中，所述二价阳离子的盐加入发酵液以获得液体培养基中二价阳离子盐的0.01-5％(w/v)的终浓度。
23.在一个实施方案中，所述添加二价阳离子前的发酵液包含磷酸根(phosphate)。
24.在另一个实施方案中，所述方法还包括制备含有所述蛋白的配制物的步骤(d)。
25.第二方面，本发明涉及在发酵液或其部分中稳定感兴趣的蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
26.a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液加入二价阳离子的盐，和
27.b)将发酵液ph调整到高于ph 11。
28.附图简要说明
29.图1：通过700nm吸光度测量的蛋白溶解性取决于上清的ph。
30.图2：淀粉酶活性取决于上清的ph。
31.图3：淀粉酶活性取决于上清的ph，存在7.5g/l氯化钙。
32.定义
33.除非另有说明，本文所用术语应根据相关领域普通技术人员的常规用法理解。
34.如本说明书和所附权利要求所用，除非上下文另有明确规定，单数形式“一(a)和“一(an)”也包括各复数形式。在本发明上下文中，术语“约”和“大致”指示本领域技术人员理解仍确保所探讨的特征技术效果的准确性间隔。该术语一般指示偏离所示数值
±
20％，
优选
±
15％，更优选
±
10％，甚至更优选
±
5％。
35.应理解术语“包含(comprising)”不是限制性的。出于本发明目的，术语“由...组成”被视作术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中一个组定义为包含至少一定数目的实施方案，这意味着也涵盖优选仅由这些实施方案组成的组。
36.此外，说明书和权利要求中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等用于区分类似元素且不必定用于描述先后或时间顺序。应理解所用术语在适当情况下可互换，本文所述发明的实施方案能够以不同于本文所描述或说明的顺序操作。在术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”、“i”、“ii”等涉及方法或用途或试验步骤的情况中，步骤之间没有时间或时间间隔相同性，即步骤可同时完成或者这些步骤之间可以有数秒、分钟、小时、天、周、月或甚至年的时间间隔，除非本技术中另有说明，如上文或下文所示。
37.应理解本发明不限于本文所述特定方法、操作、试剂等，因为这些可以变化。还应理解本文所用术语仅用于描述特定实施方案目的，且不意在限制本发明范围，其仅由所附权利要求限制。除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的意义。
38.本技术中，参考了多个出版物。所有这些出版物和出版物内所引用那些参考文献的公开内容在此通过引用纳入本技术，以更充分描述本发明所属领域状态。
[0039]“发酵工艺”包括在适当发酵培养基中培养细胞。
[0040]“细胞培养”或“细胞生长”不应理解为限于指数生长期，但也能包括细胞在接种后开始生长和静止期的生理状态。
[0041]
工业相关发酵工艺涵盖某一体积规模上的发酵工艺，对于所谓发酵罐尺寸，所述体积规模是至少1m3，优选至少5m3，更优选至少10m3，甚至更优选至少25m3，最优选至少50m3。优选地，工业相关发酵工艺涵盖某一体积规模上的发酵工艺，对于所谓发酵罐尺寸，所述体积规模是1-500m3，优选5-500m3，更优选10-500m3，甚至更优选25-500m3，最优选50-500m3。换言之，工业相关发酵工艺涵盖某一体积规模上的发酵工艺，对于所谓发酵罐尺寸，所述体积规模是至少1000l，优选至少5,000l，更优选至少10,000l，甚至更优选至少25,000l且最优选至少50,000l。优选地，工业相关发酵工艺涵盖1000-500,000l体积规模上的发酵工艺，优选5,000-500,000l，更优选10,000-500,000l，甚至更优选25,000-500,000l且最优选50,000-500,000l。
[0042]
本文所用“发酵液”或“培养液”描述含有重组或非重组细胞的发酵培养基，所述细胞被培养以表达感兴趣的蛋白。在一些实施方案中，所述重组或非重组细胞可分泌感兴趣的蛋白到发酵培养基。
[0043]
术语“发酵液部分”指示仅部分发酵液。发酵液部分可通过发酵液离心获得，产生包含液体部分的上清和包含细胞及其他不溶物的旋降部分。或者，发酵液部分可通过发酵液过滤获得，产生包含液体部分的滤液或渗透液以及包含细胞和/或其他不溶物的保留物。所述部分还可包括发酵液部分，否则收获发酵罐内存在的全部发酵液以用于回收感兴趣的蛋白。
[0044]
术语“发酵培养基”指水基溶液，其含有一种或多种能支持细胞生长的化合物。
[0045]
本技术所用术语“二价阳离子”指具有 2电荷的阳离子。合适的二价阳离子包括
ca
2
、mg
2
、ba
2
、pb
2
、fe
2
、zn
2
、ni
2
、cu
2
、mn
2
、sr
2
、co
2
和be
2
。优选地，二价阳离子是ca
2
或mg
2
。二价阳离子能采用固体或溶解形式或两者。固体形式下，阳离子与阴离子发生离子键合，从而形成盐，本文称为“二价阳离子的盐”或“二价盐”。
[0046]
发酵液中的“杂质”通常包括未转化的糖、剩余的盐和副产物。
[0047]
术语“生物质”指细胞，其生成所需产物和这些细胞存在于发酵液的片段。
[0048]
本文所用术语“感兴趣的蛋白滴度”应理解为以g每体积发酵液(以升计)计的感兴趣的蛋白的量。
[0049]
术语“回收”或“纯化”可互换使用且意在指“使得更纯”。其涉及一种工艺，其中感兴趣的蛋白与发酵液内存在的其他化合物或细胞分开。
[0050]
术语“异源”(或外源或外来或重组或非天然)多肽在本文中定义为对宿主细胞而言非天然的多肽，对宿主细胞而言天然的多肽，其中结构修饰如缺失、取代和/或插入通过重组dna技术进行以改变天然多肽，或者对宿主细胞而言天然的多肽，其表达量的改变或其表达由不同于天然宿主细胞的基因组位置主导，这是通过重组dna技术操纵宿主细胞dna引起，或其表达通过重组dna技术如更强启动子操纵多核苷酸调控元件引起量的改变；或对宿主细胞而言天然、但未整合入其天然遗传环境的多核苷酸，这是由重组dna技术进行遗传操纵的结果。
[0051]
关于2种或更多多核苷酸序列或者2种或更多氨基酸序列，术语“异源”用于表征，所述2种或更多多核苷酸序列或者2种或更多氨基酸序列在彼此特定组合中天然不出现。
[0052]
出于本发明目的，对于细胞或生物体，“重组”(或转基因)意味着细胞或生物体含有通过基因技术由人引入的异源多核苷酸，而对于多核苷酸，包括通过基因技术/重组dna技术人为的所有这些构建，其中
[0053]
a)所述多核苷酸序列或其部分，或
[0054]
b)可操作连接所述多核苷酸的一种或多种遗传控制序列，包括但不限于启动子，或
[0055]
c)a)和b)
[0056]
不位于其野生型遗传环境或经修饰。
[0057]
术语“天然”(或野生型或内源)细胞或生物体和“天然”(或野生型或内源)多核苷酸或多肽指自然界中发现的细胞或生物体以及分别在细胞中发现处于其天然形式和遗传环境中发现的多核苷酸或多肽(即没有任何人工干预)
[0058]
本文所用术语“宿主细胞”包括易受用核酸构建体或表达载体转化、转染、转导、接合等影响的任何细胞类型。
[0059]
术语“引入”和其变化形式在本文中定义为dna转移入宿主细胞。向宿主细胞引入dna能通过本领域已知的任何方法完成，包括但不限于转化、转染、转导、接合等。
[0060]
详细描述
[0061]
本发明可通过参考下列本发明优选实施方案和本文所含的实施例的详细描述而更容易理解。
[0062]
发明人意外发现如果二价阳离子的盐在ph调整至ph值高于ph 11前加入发酵液，则蛋白如酶的活性能保留或基本保留。
[0063]
ph增加到高于11的值可调节感兴趣的蛋白的溶解性，所述蛋白可能以蛋白晶体、
蛋白沉淀物和/或结合细胞团块或其他不溶性材料的蛋白的形式存在(参见实施例1)。然而，高ph可导致感兴趣的蛋白如酶的蛋白活性损失。此外，高ph可导致感兴趣的蛋白如酶的不稳定性。
[0064]
不想受特定理论约束，假设当液体培养基或其部分的ph提高，发酵培养基中存在的磷酸根离子倾向于从蛋白尤其是酶中提取二价阳离子优选ca2 ，并形成不溶性盐。通过在提高ph之前或同时加入二价阳离子到发酵液，培养基中的磷酸根与这些所加入阳离子复合，而与酶结合的阳离子不会被提取。因此，酶保持稳定且可溶，其活性在高ph孵育期间损失减少。
[0065]
可加入发酵液的合适二价阳离子示例包括ha组元素(碱土金属)。尤其优选的二价阳离子是ca
2
和mg
2
。
[0066]
因此，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0067]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0068]
b)将发酵液ph调整到高于ph 11，和
[0069]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0070]
此外，本发明涉及在发酵液或其部分中稳定感兴趣的蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
[0071]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液加入二价阳离子的盐，和
[0072]
b)将发酵液ph调整到高于ph 11。
[0073]
本发明方法可应用于发酵液或发酵液部分。
[0074]
发酵液部分可经过滤(优选通过微滤)或离心(优选通过倾析式离心、盘堆离心或喷嘴分离器)获得。发酵液部分还可通过移出发酵罐内存在的部分发酵液来获得。
[0075]
在一个优选实施方案中，所述发酵液部分选自(i)通过发酵液离心获得的旋降部分，和(ii)通过发酵液离心获得的上清。优选地，所述上清用于本发明方法。
[0076]
在另一个优选实施方案中，所述发酵液部分可以是通过发酵液离心获得的滤液/保留物。过滤可以是死端或错流过滤。
[0077]
此外，一种或多种絮凝剂能加入发酵液。絮凝剂能在细胞分离前加入发酵液。絮凝剂为本领域已知且特别用于提供尤其适合离心、过滤或膜浓缩/过滤的蛋白溶液(如发酵液)。合适的絮凝剂可以是任意可溶性fe或al化合物。这类可溶性fe和/或al化合物作为絮凝剂的应用从wo 96/38469知晓。能使用任意可溶性fe或al化合物或其任何混合物，如al2(so4)3、naalo2、k2al2o4、al(no3)3、alcl3、al-乙酸盐、al-甲酸盐、fe2(so4)3、fe(iii)-甲酸盐、fe(iii)-乙酸盐、fe(ii)-甲酸盐和fe(ii)-乙酸盐。所述化合物优选是聚合物氯化羟铝(如pax-18，可获自凯米拉(kemira))或al2(so4)3。其他合适的絮凝剂包括有机聚合物如superfloc c-521和superfloc a-130(可获自凯米拉)，其分别是具有不同分子量的阳离子和阴离子有机聚合物。
[0078]
在另一个实施方案中，所述本发明方法不包括向发酵液加入三价或聚合絮凝剂。在另一个实施方案中，在本发明方法的步骤a)中加入的含有二价阳离子盐的溶液不含有絮凝剂。优选地，在本发明方法的步骤a)中加入的含有二价阳离子盐的溶液不含有絮凝剂如superfloc c-521和superfloc a-130。
[0079]
方法步骤a)添加二价阳离子的盐
[0080]
在本发明的一个实施方案中，所述二价阳离子选自ca
2
、mg
2
、ba
2
、pb
2
、fe
2
、zn
2
、ni
2
、cu
2
、mn
2
、sr
2
、co
2
、be
2
和ra
2
。本发明所述优选二价阳离子包括ha组元素(碱土金属)，即ca
2
、mg
2
、sr
2
、ba
2
、ra
2
、be
2
。尤其优选的二价阳离子是ca
2
和mg
2
，最优选的二价阳离子是ca
2
。
[0081]
在本发明的另一个实施方案中，所述二价阳离子的盐是二价阳离子的盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、甲酸盐或乙酸盐，如氯化钙、磷酸钙、硫酸钙、硝酸钙、乙酸钙、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、硫酸镁或乙酸镁。二价阳离子的盐优选是氯化钙(cacl2)或氯化镁(mgcl2)，二价阳离子的盐更优选是cacl2。在另一个实施方案中，所述二价阳离子的盐是甲酸钙或乙酸钙或者甲酸镁或乙酸镁。
[0082]
在一个实施方案中，所述二价盐加入发酵液或其部分，浓度为发酵液的(w/w)0.01-5％、0.01-4％、0.01-3％、0.01-2％或0.01-1％，尤其是发酵液(w/w)的0.01-1％。二价盐优选以发酵液(w/w)的0.1-1％的浓度加入发酵液或其部分，更优选0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％或1％的浓度。二价盐最优选以发酵液(w/w)的0.75％的浓度加入发酵液或其部分。二价盐通常在管线或搅拌槽中或通过本领域已知的任何其他方法加入。
[0083]
在一个实施方案中，所述二价盐以至少二价阳离子对于磷酸根离子的化学计算量加入发酵液或其部分。二价阳离子与磷酸根离子之间的摩尔比优选高于1，如2-10，更优选2-5。因此，二价阳离子与磷酸根离子之间的摩尔比是2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选2、3、4或5，最优选2或3。二价盐通常在管线或搅拌槽中或通过本领域已知的任何其他方法加入。
[0084]
所加入二价阳离子的最终量可取决于发酵工艺结束时存在的发酵液内磷酸根的量。如上所讨论，认为提高ph后，发酵液内剩余的磷酸根会从发酵液中存在的酶提取二价阳离子。这意味着蛋白回收前发酵液中存在的磷酸根越多，必须加入液体培养基的二价阳离子量越高。磷酸根可在发酵过程开始时加入发酵培养基，且由培养的微生物消耗。根据发酵操作方案，额外磷酸根能在培养期间加入。因此，发酵过程结束时剩余的磷酸根取决于发酵方案。
[0085]
在一个优选实施方案中，在加入二价阳离子的盐时，所述发酵液包含磷酸根。发酵液中存在的磷酸根的量能通过本领域已知的任何方式确定，如通过分析型hplc。发酵过程结束时的磷酸根浓度可以是0-5g/l、0-4g/l、0-3g/l、0-2g/l或0-1g/l。发酵过程结束时的磷酸根浓度可以是0.1-3g/l或0.2-3g/l或0.1-1g/l或0.2-1g/l。优选地，在本发明的方法中，包含感兴趣的蛋白的溶液如发酵液或其部分中的磷酸根浓度在添加二价阳离子的盐后不超过10mmol。优选地，在本发明方法中，发酵液或其部分中的磷酸根浓度在添加二价阳离子的盐后不超过10mmol。优选地，除了添加含有磷酸根的二价阳离子的盐，发酵过程完成后没有磷酸根加入发酵液或其部分。优选地，发酵过程完成后没有磷酸根加入发酵液或其部分。更优选地，添加二价阳离子前的发酵液或其部分包含浓度不超过10mmol的磷酸根，且发酵过程完成后没有磷酸根加入发酵液或其部分。
[0086]
方法步骤b)调整ph
[0087]
根据本发明，与步骤a)同时或二价阳离子的盐加入发酵液或其部分之后，将发酵液的ph调整至ph值高于11。ph优选调整到至少ph 11.1、至少ph 11.2、至少ph 11.3、至少ph 11.4或至少ph 11.5的值，优选至少ph 11.5。ph优选调整到ph 11-ph 13的值，如ph 11.2、
11.5、12.0、12.5或12.7，更优选ph 11.0-ph 12.5的值，如ph 11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3或12.4。ph优选调整到高于ph 11-最高ph 13.0的值，如ph 11.2、11.5、12.0、12.2、12.5、ph 12.7或ph 13.0，ph优选调整到高于ph 11-最高ph 12.5的值，如ph 11.2、11.5、12.0、12.2或12.5，ph优选调整到高于ph 11-最高ph 12.0的值，如ph 11.2、11.5、11.7或12.0。ph优选调整至ph 11.1-ph 13、ph 11.1-ph 12.5、ph 11.1-ph 12、ph 11.2-ph 13、ph 11.2-ph 12.5、ph 11.2-ph 12、ph 11.5-ph 13、ph 11.5-ph 12.5或ph 11.5-ph 12。在二价阳离子的盐加入发酵液后，即步骤a)在步骤b)前进行，发酵液的ph优选调整至ph值高于11.0，如ph 11.2、11.5、12、12.5或13，优选ph高于11.0-最高12.0，如ph 11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9或12.0。
[0088]
ph可用本领域技术人员已知的任意合适策略调整。任意合适的碱或碱性溶液能用于调整ph。优选的碱是氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铵。在本发明的一个优选实施方案中，所述ph通过加入naoh来调整。
[0089]
在另一个实施方案中，所述方法的步骤：
[0090]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0091]
b)将发酵液ph调整到高于ph 11
[0092]
可同时进行或步骤a)在步骤b)之前进行。
[0093]
步骤a)优选在步骤b)之前进行。步骤b)不必紧跟步骤a)。因此，在一个实施方案中，所述步骤b)在步骤a)完成后10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时或3小时进行。
[0094]
如果步骤a)和步骤b)同时进行，需要连续和迅速混合发酵液、二价阳离子的盐与加入的碱，从而蛋白不在缺乏二价阳离子情况下接触高浓度的碱。因而推荐通过混合发酵液、二价阳离子的盐与加入的碱使局部ph峰最小化以防止蛋白活性和/或稳定性下降。这还可通过管线中混合实现。
[0095]
在另一个实施方案中，能在步骤a)和步骤b)之间进行额外步骤。所述额外步骤可以是添加化合物如絮凝剂、助滤剂/添加剂、活性炭、脱色剂等。
[0096]
加入二价盐和调整ph后，发酵液在预定孵育时间中不断搅拌。孵育时间可从1分钟变化到120分钟。孵育时间可以是1分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、110分钟或120分钟。孵育时间优选是60-90分钟，孵育时间最优选是60分钟。如果ph通过管线中加入碱来调整，则孵育时间多至10分钟，优选多至5分钟，最优选多至1分钟。
[0097]
在孵育时间中，促进蛋白晶体和/或蛋白沉淀物和/或结合细胞团块/不溶性材料的蛋白的溶解性。因此，孵育时间结束时，蛋白以不溶性形式存在。
[0098]
如上所示，所述高ph孵育引起结晶或沉淀的蛋白溶解(也参见实施例1)。然而，高ph处理可能对稳定性有负面影响并因而可能对待纯化蛋白如酶的活性产生不利影响。向发酵液加入二价阳离子可稳定感兴趣的蛋白并保存其活性和稳定性(参见实施例2和3)。
[0099]
通过使用本发明方法，当发酵液或其部分的ph增加时，酶基本保留其活性。术语“基本保留其活性”意味着ph增加后的酶活性是ph增加前酶活性的至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％或至少85％，优选ph增加后的酶活性是ph增加前酶活性的至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、
至少93％或至少94％，更优选ph增加后的酶活性是ph增加前酶活性的至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。确定酶活性的方法如下面关于可用于本发明的酶上下文中所讨论。
[0100]“酶的稳定化”指酶基本保留其构象且因而也如上所述基本保留其活性。
[0101]
在一个实施方案中，所述发酵液或其部分可在实施本发明方法之前或之后稀释。包含感兴趣的蛋白的发酵液可稀释100-2000％(w/w)，优选100-1500％(w/w)，更优选100-1000％(w/w)，尤其是200-700％(w/w)。发酵液可用水稀释。
[0102]
在另一个实施方案中，所述发酵液在实施本发明方法之前不稀释。
[0103]
发酵工艺
[0104]
在一个实施方案中，所述发明方法还包括在步骤a)和b)之前，发酵宿主细胞，优选发酵微生物。
[0105]
所述发酵工艺可以是任何已知的设置，如分批工艺、补料分批工艺或连续发酵工艺。
[0106]
分批发酵是生长培养基从一开始就在发酵罐中提供的工艺，其中发酵罐接种有微生物细胞且发酵工艺一直运转直至达到预定条件，通常是耗尽生长培养基且所述耗尽导致微生物生长停止。
[0107]
补料分批发酵是部分生长培养基从发酵过程一开始就提供的工艺，其中加入接种体，且在发酵开始后的某一时间点，额外底物，进料培养基加入发酵罐，速度可预先确定或由发酵罐中的条件确定，直至达到最大体积。进料培养基的组成与初始生长培养基可相同或不同。
[0108]
连续发酵是一种工艺，其中新的生长培养基连续加入发酵罐且发酵液同时以相同速度从发酵罐中移出，从而发酵罐内的体积恒定。工业发酵过程通常如下实施：首先在发酵罐中提供生长培养基，用含微生物细胞的接种体接种发酵罐且在规定条件如ph、温度、含氧量等情况下发酵，采用预定时间或直至达到预定条件，如滴度、耗氧量等。
[0109]
在一个优选实施方案中，所述补料分批工艺在本发明方法的步骤a)和b)之前进行。
[0110]
接种体一般是用于发酵的在种菌发酵罐中制备的微生物液体培养物，种菌发酵罐的体积通常是生产用主发酵罐的5-15％。用于种菌发酵罐的生长培养基与主发酵罐所用生长培养基可以相同或不同。
[0111]
因此，接种体通常制备自含有宿主细胞生产菌株(优选微生物)的小瓶，其中小瓶内容物首先以小体积接种且宿主细胞生长到制备生产菌株的第一培养物所需的密度，其中第一培养后，生产菌株在接下来的尺寸增加的种菌发酵罐系列中接种，其中各步骤的体积增加5-20倍，直至体积足以接种生产发酵罐。这类尺寸增加的发酵罐系列也称为种菌队列(wo2017/068012a1)。
[0112]
因此，在发酵工艺中，包含感兴趣的蛋白编码核酸序列的微生物接种并培养于发酵培养基。微生物优选是重组微生物。
[0113]
可使用适合特定微生物细胞培养的任意培养基。发酵培养基可以是上述基本培养基，如wo 98/37179中，或者发酵培养基可以是含复合氮源和/或碳源的复合培养基，其中复合氮源能如wo 2004/003216所述部分水解。此外，发酵培养基可含有磷酸根和/或碳酸根源。磷酸根能以化学确定形式加入发酵培养基，这是通过加入一种或多种磷酸盐如磷酸钾、
coagulans)、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、巨大芽胞杆菌(bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)、甲基营养型芽孢杆菌(bacillus methylotrophicus)、蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)、bacillus paralicheniformis、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)细胞。在一个实施方案中，所述细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个实施方案中，所述细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个实施方案中，所述芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌的芽孢杆菌细胞。所述细胞优选是地衣芽孢杆菌细胞。
[0128]
在本发明的方法中，所述细菌细胞可以是嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、加氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricusk)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、大肠杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、醋谷棒杆菌(corynebacterium acetoglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(corynebacterium acetoacidophilum)、帚石南棒杆菌(corynebacterium callunae)、产氨棒杆菌(corynebacterium ammoniagenes)、嗜热产氨棒杆菌(corynebacterium thermoaminogenes)、栖糖蜜棒杆菌(corynebacterium melassecola)、高效棒杆菌(corynebacterium effiziens)、高效棒杆菌(corynebacterium efficiens)、沙漠棒杆菌(corynebacterium deserti)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)、brevibacterium divarecatum、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、变铅青链霉菌(streptomyces lividans)、白色链霉菌(streptomyces albus)、阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)、氧化葡糖杆菌(gluconobacter oxydans)、gluconobacter morbifer、泰国葡糖杆菌(gluconobacter thailandicus)、醋酸杆菌(acetobacter aceti)、丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)、糖丁基梭菌(clostridium saccharobutylicum)、拜氏梭菌(clostridium beijerinckii)、马链球菌(streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(streptococcus uberis)、马链球菌兽瘟亚种(streptococcus equi subsp.,zooepidemicus)或basfia succiniciproducens。
[0129]
一些其他优选细菌包括放线菌目(actinomycetales)的菌株，优选链霉菌，优选类球形链霉菌(streptomyces spheroides)(attc 23965)、热紫链霉菌(streptomyces thermoviolaceus)(ifo 12382)、变铅青链霉菌(streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(streptomyces murinus)或黄萎病链轮丝菌黄萎病亚种(streptoverticillum verticillium ssp.verticillium)。其他优选细菌包括类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、沼泽红胞藻(rhodomonas palustri)、乳酸链球菌(streptococcus lactis)。进一步优选细菌包括属于粘球菌(myxococcus)的菌株，如变绿粘球菌(m.virescens)。
[0130]
革兰氏阴性菌包括但不限于埃希氏杆菌、假单胞菌(pseudomonas)、沙门氏菌
(salmonella)、弯曲杆菌(campylobacter)、螺杆菌(helicobacter)、醋杆菌(acetobacter)、黄杆菌(flavobacterium)、梭杆菌(fusobacterium)、葡糖杆菌(gluconobacter)。在一个特定实施方案中，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞。另一革兰氏阴性菌是吡咯菌素假单胞菌(pseudomonas purrocinia)(atcc 15958)或荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)(nrrl b-11)或basfia succiniciproducens。其他革兰氏阴性菌包括布丘菌(butiauxella)，更特定是乡间布丘氏菌(butiauxella agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(butiauxella brennerae)、费拉格布丘氏菌(butiauxella ferragutiae)、伽瓦尼布丘氏菌(butiauxella gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(butiauxella izardii)、诺基亚布丘氏菌(butiauxella noackiae)和瓦姆波德布丘氏菌(butiauxella warmboldiae)。
[0131]
在一个特定实施方案中，所述微生物可以是芽孢杆菌、链霉菌、埃希氏杆菌、布丘氏菌和假单胞菌属。
[0132]
微生物细胞可以是真菌细胞。本文所用“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)和接合菌门(zygomycota)以及卵菌门(oomycota)和半知菌亚门(deuteromycotina)及所有丝分孢子真菌。子囊菌门各组包括例如脉孢菌(neurospora)、正青霉(eupenicillium)(＝青霉菌(penicillium))、裸孢壳(emericella)(＝曲霉菌(aspergillus))、散囊菌(eurotium)(＝曲霉菌)\毁丝霉(myceliophthora)c1和下面所列真酵母。担子菌门示例包括蘑菇、锈菌和黑粉菌。壶菌门各组包括例如异水霉(allomyces)、芽枝霉(blastocladiella)、雕蚀菌(coelomomyces)和水生真菌。卵菌门各组包括例如水霉水生真菌(saprolegniomycetous aquatic fungi)(水霉)如绵霉(achlya)。丝分孢子真菌示例包括曲霉菌，例如黑曲霉(aspergillus niger)、青霉菌、假丝酵母(candida)和链格孢菌(alternaria)。接合菌门各组包括例如根霉(rhizopus)和毛霉菌(mucor)。
[0133]
一些优选真菌包括属于以下的菌株：半知菌亚门(deuteromycotina)，丝状菌纲(hyphomycetes)如镰胞菌(fusarium)、腐质霉(humicola)、木霉属菌(tricoderma)、漆斑菌(myrothecium)、轮枝菌(verticillum)、arthromyces、caldariomyces、细基格孢属(ulocladium)、埃里格孢属(embellisia)、枝孢属(cladosporium)或dreschlera，尤其是尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)(dsm 2672)、特异腐质霉(humicola insolens)、瑞氏木霉(trichoderma resii)、疣孢漆斑菌(myrotheciumverrucana)(ifo 6113)、黄萎轮枝菌(verticillum alboatrum)、大丽轮枝菌(verticillum dahlie)、arthromyces ramosus(ferm p-7754)、caldariomyces fumago、纸龈枝孢(ulocladium chartarum)、embellisia alli或dreschlera halodes。
[0134]
其他优选真菌包括属于以下的菌株：担子菌亚门(basidiomycotina)，担子菌纲(basidiomycetes)如鬼伞属(coprinus)、平革菌属(phanerochaete)、革盖菌属(coriolus)或栓菌属(trametes)，尤其是微孢灰盖鬼伞(coprinuscinereusf.microsporus)(ifo 8371)、长根鬼伞(coprinus macrorhizus)、黄孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium)(例如na-12)或栓菌属(之前称为猪苓(polyporus)如变色栓菌(t.versicolor)(例如pr4 28-a)。
[0135]
其他优选真菌包括属于以下的菌株：接合菌亚门(zygomycotina)，mycoraceae如根霉(rhizopus)或毛霉菌(mucor)，尤其是冻土毛霉(mucorhiemalis)。
[0136]
微生物细胞可以是酵母细胞。本文所用“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目(endomycetales))、产担子酵母和属于半知菌类的酵母(芽孢纲(blastomycetes))。产子囊孢子酵母分成蚀精霉科(spermophthoraceae)和酵母科(saccharomycetaceae)。后者包括4个亚科(schizosaccharomycoideae)(如裂殖酵母属(schizosaccharomyces))、拿逊酵母(nadsonioideae)、油脂酵母(lipomycoideae)和类酵母亚科(saccharomycoideae)(如克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、毕赤酵母属(pichia)和酵母属(saccharomyces)。产担子酵母包括白冬孢酵母属(leucosporidim)、红冬孢酵母属(rhodosporidium)、锁掷酵母属(sporidiobolus)、黑葱花酵母属(filobasidium)和线黑粉菌属(filobasidiella)。属于半知菌的酵母分成2个科，即掷孢酵母科(sporobolomycetaceae)(掷孢酵母属(sporobolomyces)和布勒掷孢学报酵母属(bullera))和隐球酵母科(如假丝酵母属(candida))。在另一实施方案中，所述真菌宿主细胞是丝状真菌细胞，如ashbyaspec，优选棉阿舒囊霉(ashbya gossypii)(棉假囊酵母(eremothecium gossypii))。
[0137]
优选地，所述真菌株选自黑曲霉(aspergillus nige)、里氏木霉(trichoderma reesei)和巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)。
[0138]
在一个实施方案中，所述宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。
[0139]
在一个实施方案中，所述细胞包含用于异源基因表达的一种或多种遗传构建体。
[0140]
感兴趣的蛋白
[0141]
本发明涉及用于回收微生物的工艺以产生感兴趣的蛋白。
[0142]
在一个优选实施方案中，所述感兴趣的蛋白是酶。
[0143]
所述酶可具有一个或多个二价阳离子结合位点。所述酶因而可具有ca
2
、mg
2
、ba
2
、pb
2
、fe
2
、zn
2
、ni
2
、cu
2
、mn
2
、sr
2
、co
2
、be
2
或ra
2
结合位点。优选地，酶具有ca
2
和/或mg
2
结合位点。技术人员已知具有ca
2
和/或mg
2
结合位点的酶。优选地，所述酶是蛋白酶或淀粉酶。所述蛋白酶优选是碱性蛋白酶，优选丝氨酸蛋白酶，更优选枯草杆菌蛋白酶。所述淀粉酶优选是α-淀粉酶。
[0144]
此外，所述酶的等电点(pi)可低于ph 11。优选地，所述酶的pi是ph 11下一个ph单位，更优选两个ph单位。酶的等电点是酶不携带正电荷或在统计平均上为电中性的ph。pi可通过本领域已知方法确定，如通过凝胶电泳，使用决定电泳凝胶ph的缓冲液。如果缓冲液的ph高于所分析蛋白的pi，该蛋白会迁移至阳极。如果缓冲液的ph低于所分析蛋白的pi，该蛋白会迁移至凝胶的阴极。如果缓冲液ph等于所分析蛋白的pi，该蛋白完全不会在凝胶内迁移。
[0145]
在另一个实施方案中，所述酶在高于ph 11的ph稳定。如果酶保留其天然折叠构象，即不是变性(未折叠或延伸)状态，则酶在特定ph稳定。
[0146]
在一个优选实施方案中，所述酶选自淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、普鲁兰酶、蛋白酶、金属蛋白酶、肽酶、脂酶、角质酶、酰基转移酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、木葡聚糖基转移酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、植酸酶、磷酸酶、木糖异构酶、葡糖异构酶、乳糖酶、乙酰乳酸脱羧酶、果胶酶、果胶甲酯酶、聚半乳糖醛酸苷酶、裂解酶、果胶裂解酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、半乳聚糖酶、虫漆酶、过氧物酶和天冬酰胺酶，优选其中所述酶是淀粉酶或蛋白酶。
gly-thr-his和gly-thr-ser-met-ala-xaa-pro内出现。肽酶家族s8的大部分成员在中性-轻度碱性ph下具有活性。家族中的许多肽酶是热稳定的。
[0156]
s8家族，a子家族的主要成员是：
[0157]
名称merops家族s8,子家族a枯草杆菌蛋白酶carlsbergs08.001枯草杆菌蛋白酶lentuss08.003嗜热蛋白酶s08.007枯草杆菌蛋白酶bpn’s08.034枯草杆菌蛋白酶dys08.037碱性肽酶s08.038枯草杆菌蛋白酶alp 1s08.045仙台枯草杆菌蛋白酶s08.098碱性弹性蛋白酶yabs08.157
[0158]
枯草杆菌蛋白酶型蛋白酶(ec 3.4.21.62)和变体可以是细菌蛋白酶。所述细菌蛋白酶可来自革兰氏阳性菌如杆菌、梭菌、肠球菌、地芽孢杆菌、乳杆菌、乳球菌、大洋芽孢杆菌、葡萄球菌、链球菌或链霉菌，或革兰氏阴性菌如弯曲杆菌(campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌(flavobacterium)、梭杆菌(fusobacterium)、螺杆菌(helicobacter)、llyobacter、奈瑟氏菌(neisseria)、假单胞菌、沙门氏菌(salmonella)或脲原体(ureaplasma)。关于此家族的综述提供于例如"枯草杆菌酶：枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(subtilases:subtilisin-like proteases)",r.siezen,第75-95页，收录于"枯草杆菌蛋白酶酶(subtilisin enzymes)",r.bott和c.betzel编,纽约,1996。
[0159]
至少一种蛋白酶可选自以下：来自解淀粉芽孢杆菌bpn'的枯草杆菌蛋白酶(由vasantha等.(1984)j.bacteriol.卷159,第811-819页和ja wells等.(1983)收录于nucleic acids research,卷11,第7911-7925页描述)；来自地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶carlsberg；公开于el smith等.(1968)收录于j.biol chem,卷243,第2184-2191页和jjacobs等.(1985)收录于nucl.acids res,卷13,第8913-8926页)；枯草杆菌蛋白酶pb92(碱性蛋白酶pb92的初始序列描述于ep 283075a2)；枯草杆菌蛋白酶147和/或309(分别为)，如公开于wo 89/06279；来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，如公开于wo 91/02792，例如来自迟缓芽孢杆菌dsm 5483或迟缓芽孢杆菌dsm 5483变体，如描述于wo 95/23221；来自嗜碱芽孢杆菌(bacillus alcalophilus)(dsm 11233)的枯草杆菌蛋白酶，如公开于de 10064983；来自吉氏芽孢杆菌(bacillus gibsonii)(dsm 14391)的枯草杆菌蛋白酶，如公开于wo 2003/054184；来自芽孢杆菌属(dsm 14390)的枯草杆菌蛋白酶，如公开于wo 2003/056017；来自芽孢杆菌属(dsm 14392)的枯草杆菌蛋白酶，如公开于wo 2003/055974；来自吉氏芽孢杆菌(dsm 14393)的枯草杆菌蛋白酶，如公开于wo 2003/054184；具有seq id no:4的枯草杆菌蛋白酶，如描述于wo 2005/063974；具有seq id no:4的枯草杆菌蛋白酶，如描述于wo 2005/103244；具有seq id no:7的枯草杆菌蛋白酶，如描述于wo 2005/103244；和具有seq id no:2的枯草杆菌蛋白酶，如描述于申请de 102005028295.4。
[0160]
蛋白酶还包括wo 92/19729、wo 95/23221、wo 96/34946、wo 98/20115、wo 98/
20116、wo 99/11768、wo 01/44452、wo 02/088340、wo 03/006602、wo 2004/03186、wo 2004/041979、wo 2007/006305、wo 2011/036263、wo 2011/036264和wo 2011/072099中描述的变体。合适的示例特别包括衍生自如ep 1921 147所述的seq id no:22的枯草杆菌蛋白酶蛋白酶变体，带有一个或多个下列位置处的氨基酸取代：3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274，其具有蛋白水解活性。另外，枯草杆菌蛋白酶蛋白酶在asp32、his64和ser221位未突变。
[0161]
枯草杆菌蛋白酶样酶可具有ep 1921147所述的seq id no:22，或可以是变体，其与ep 1921147所述的seq id no:22至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同，且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶样酶与ep 1921147所述的seq id no:22至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同，且特征为在101位(根据bpn’编号)具有氨基酸谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)或天冬酰胺(n)或谷氨酰胺(q)或丙氨酸(a)或甘氨酸(g)或丝氨酸(s)并有蛋白水解活性。在一个实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶样酶与ep 1921147所述的seq id no:22至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同，且特征为在101位(根据bpn’编号)具有谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)并有蛋白水解活性。这种枯草杆菌蛋白酶变体可包含在101位的氨基酸取代如r101e或r101d，单独或与在位置3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和/或274(根据bpn’编号)的一个或多个取代组合，且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，所述蛋白酶包含一个或多个其他取代(a)-(h)：(a)在3位的苏氨酸(3t)，(b)在4位的异亮氨酸(4i)，(c)在63位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(63a、63t或63r)，(d)在156位的天冬氨酸或谷氨酸(156d或156e)，(e)在194位的脯氨酸(194p)，(f)在199位的甲硫氨酸(199m)，(g)在205位的异亮氨酸(205i)，(h)在217位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(217d、217e或217g)，(i)根据(a)-(h)的2或更多氨基酸的组合。
[0162]
枯草杆菌蛋白酶样酶可具有与ep 1921147所述的seq id no:22至少80％相同的氨基酸序列，且进一步表征为包含取代r101e以及一个或多个选自以下的取代：s156d、l262e、q137h、s3t、r45e、d、q、p55n、t58w、y、l、q59d、m、n、t、g61d、r、s87e、g97s、a98d、e、r、s106a、w、n117e、h120v、d、k、n、s125m、p129d、e136q、s144w、s161t、s163a、g、y171 l、a172s、n185q、v199m、y209w、m222q、n238h、v244t、n261t、d和l262n、q、d(如wo 2016/096711所述且根据bpn’编号)，并具有蛋白水解活性。
[0163]
用于本发明的蛋白酶具有蛋白水解活性。确定蛋白水解活性的方法通过文献熟知(参见例如gupta等.(2002),appl.microbiol.biotechnol.60:381-395)。蛋白水解活性可用琥珀酰-ala-ala-pro-phe-p-硝基苯胺(suc-aapf-pna，短aapf；参见例如delmar等.(1979),analytical biochem 99,316-320)作为底物测定。pna通过蛋白裂解切割从底物分子切割，导致黄色游离pna释放，其能通过测量od405来定量。
[0164]
淀粉酶
[0165]
α-淀粉酶(e.c.3.2.1.1)可对多糖中的(1-》4)-α-d-糖苷键进行内部水解，所述多糖含有3个或更多(1-》4)-α连接d-葡萄糖单元。淀粉酶以随机方式作用于淀粉、糖原和相关
多糖及寡糖；还原基团以α构象释放。其他淀粉酶示例包括：β-淀粉酶(e.c.3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖淀粉酶(e.c.3.2.1.60)、异淀粉酶(e.c.3.2.1.68)、葡聚糖1,4-α-麦芽六糖苷酶(e.c.3.2.1.98)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(e.c.3.2.1.133)。
[0166]
淀粉酶描述于专利文献，包括但不限于：wo 2002/068589,wo 2002/068597,wo 2003/083054,wo 2004/091544和wo 2008/080093。
[0167]
衍生自地衣芽孢杆菌的淀粉酶具有wo 95/10603所述的seq id no:2。此淀粉酶的合适变体是与wo 95/10603所述的seq id no:2至少90％相同和/或包含一个或多个下列位置处取代且具有淀粉水解活性的那些：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。这类变体描述于wo 94/02597、wo 94/018314、wo 97/043424和wo 99/019467的seq id no:4。
[0168]
衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)的淀粉酶具有wo 02/10355所述的seq id no:6此淀粉酶的合适变体是与之至少90％相同且具有淀粉水解活性的那些。seq id no:6的合适变体包括与wo 02/10355所述的seq id no:6至少90％相同和/或进一步包含181和/或182位缺失和/或193位取代的那些。
[0169]
衍生自芽孢杆菌属707的淀粉酶具有wo 99/19467所公开的seq id no:6或与之至少90％相同，其具有淀粉水解活性。
[0170]
衍生自盐敏芽孢杆菌(bacillus halmapalus)的淀粉酶具有wo 96/23872所述的seq id no:2或seq id no:7，也描述为sp-722，或与序列之一至少90％相同，其具有淀粉水解活性。
[0171]
衍生自芽孢杆菌属dsm 12649的淀粉酶具有wo 00/22103所公开的seq id no:4或与之至少90％相同，其具有淀粉水解活性。
[0172]
衍生自芽孢杆菌菌株ts-23的淀粉酶具有wo 2009/061380所公开的seq id no:2或与之至少90％相同，其具有淀粉水解活性。
[0173]
衍生自噬细胞菌属(cytophaga)的淀粉酶具有wo 2013/184577所公开的seq id no:1或与之至少90％相同，其具有淀粉水解活性。
[0174]
衍生自巨大芽胞杆菌dsm 90的淀粉酶具有wo 2010/104675所公开的seq id no:1或与之至少90％相同，其具有淀粉水解活性。
[0175]
已知淀粉酶具有wo 00/60060所述的seq id no:2的氨基酸1-485,或淀粉酶包含与seq id no:2中氨基酸1-485至少96％相同的氨基酸序列且具有淀粉水解活性。
[0176]
还已知淀粉酶具有wo 2006/002643所述的seq id no:12或淀粉酶与之至少80％相同且具有淀粉水解活性。合适的淀粉酶包括相较于seq id no:12至少80％相同和/或包括y295f及m202litv位取代且具有淀粉水解活性的那些。
[0177]
还已知淀粉酶具有wo 2011/098531所述的seq id no:6或淀粉酶与之至少80％相同且具有淀粉水解活性。合适的淀粉酶包括相较于seq id no:6至少80％相同和/或包含选自下组一个或多个位置处取代的那些：193[g、a、s、t或m]、195[f、w、y、l、i或v]、197[f、w、y、l、i或v]、198[q或n]、200[f、w、y、l、i或v]、203[f、w、y、l、i或v]、206[f、w、y、n、l、i、v、h、q、d或e]、210[f、w、y、l、i或v]、212[f、w、y、l、i或v]、213[g、a、s、t或m]和243[f、w、y、l、i或v]，且具有淀粉水解活性。
[0178]
已知淀粉酶具有wo 2013/001078所述的seq id no:1或淀粉酶与之至少85％相
同，具有淀粉水解活性。合适的淀粉酶包括相较于seq id no:1至少85％相同和/或包括2个或更多(多个)位置处改变且具有淀粉水解活性的那些，所述位置对应于g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477位。
[0179]
已知淀粉酶具有wo 2013/001087所述的seq id no:2或淀粉酶与之至少85％相同且具有淀粉水解活性。合适的淀粉酶包括相较于seq id no:2至少85％相同和/或包含181 182或182 183或183 184位缺失的那些，其具有淀粉水解活性。合适的淀粉酶包括相较于seq id no:2至少85％相同和/或包含181 182或182 183或183 184位缺失的那些，其包含对应w140、w159、w167、q169、w189、e194、n260、f262、w284、f289、g304、g305、r320、w347、w439、w469、g476和g477的任意位置处的1个或2个或更多修饰且具有淀粉水解活性。
[0180]
淀粉酶还包括上述淀粉酶的混合α-淀粉酶，例如如wo 2006/066594所述。
[0181]
市售可得淀粉酶包括：duramyl
tm
、termamyl
tm
、fungamyl
tm
、stainzyme
tm
、stainzyme plus
tm
、natalase
tm
、liquozyme x和ban
tm
(来自诺维信公司)、和rapidase
tm
、purastar
tm
、powerasetm、effectenz
tm
(m100，来自杜邦)、preferenz
tm
(s1000、s110和f1000；来自杜邦)、primagreen
tn
(全部；杜邦)、optisize
tn
(杜邦)。
[0182]
在一个实施方案中，所述酶是拖麦米尔样淀粉酶。在本背景下，术语“拖麦米尔样淀粉酶”意在指α-淀粉酶，其在氨基酸水平与wo 96/23874所述的地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)α-淀粉酶有至少60％的序列相同性。在一个实施方案中，所述拖麦米尔样α-淀粉酶展示出与wo 96/23874所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％的相同性。
[0183]
本文另一α-淀粉酶是natalase或其变体，如wo 95/26397,wo 99/19467and wo 01/66712所述。
[0184]
脂酶
[0185]“脂酶”、“解脂酶”、“脂肪酯酶”都指ec类3.1.1(“羧酸酯水解酶”)的酶。脂酶(e.c.3.1.1.3,三酰基甘油脂酶)可使甘油三酯水解为更疏水的甘油单酯和甘油二酯、游离脂肪酸和甘油。脂酶通常还包括作用于不同于甘油三酯底物或切割特定脂肪酸的酶，如磷脂酶a(e.c.3.1.1.4)、半乳糖脂酶(e.c.3.1.1.26)、角质酶(ec 3.1.1.74)，以及具有固醇酯酶活性(ec 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(ec 3.1.1.50)的酶。
[0186]
本领域描述了许多脂酶，包括但不限于：wo00/032758、wo03/089620、wo2005/032496、wo 2005/086900、wo2006/00976、wo 2006/031699、wo2008/036863、wo2011/046812和wo2014/059360。
[0187]
纤维素酶
[0188]“纤维素酶”、“纤维酶”或“纤维素分解酶”是参与纤维素水解的酶。已知3种主要纤维素酶类型，即内切-β-1,4-葡聚糖酶(内切-1,4-p-d-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，e.c.3.2.1.4；水解纤维素中的β-1,4-糖苷键)、纤维二糖水解酶(1,4-p-d-葡聚糖纤维二糖水解酶,ec 3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(ec 3.2.1.21)。
[0189]
纤维素酶描述于专利和发表的专利申请，包括但不限于：wo 97/025417、wo98/024799、wo03/068910、wo2005/003319和wo 2009/020459。
[0190]
市售可得的纤维素酶包括celluzyme
tm
、endolase
tm
、carezyme
tm
、cellusoft
tm
、renozyme
tm
、celluclean
tm
(来自诺维信公司)、ecostone
tm
、biotouch
tm
、econase
tm
、ecopulp
tm
(来自芬兰的英联酶配制物有限公司(ab enzymes))、clazinase
tm
和puradax ha
tm
、genencor洗涤剂纤维素酶l、indiage
tm neutra(来自杰能科国际公司(genencor international inc.)/杜邦)、revitalenz
tm
(2000，来自杜邦)、primafast
tm
(杜邦)和kac-500
tm
(来自花王公司(kao corporation))。
[0191]
用于本发明所述方法的纤维素酶具有“纤维素分解活性”或“纤维素酶活性”。测量纤维素分解活性的试验为本领域技术人员已知。例如，纤维素分解活性可因为纤维素酶使羧甲基纤维素水解成还原碳水化合物来测定，其还原能力根据hoffman,w.s.,j.biol.chem.120,51(1937)通过铁氰化物反应方式比色测定。
[0192]
甘露聚糖酶
[0193]
甘露聚糖酶(e.c.3.2.1.78)水解甘露糖聚合物中的内部β-1,4键。“甘露聚糖酶”可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。已知甘露聚糖酶衍生自芽孢杆菌或腐质霉(humicola)的野生型，尤其是黏琼脂芽孢杆菌(b.agaradhaerens)、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(b.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌(b.clausii)或特异腐质霉(h.insolens)。合适的甘露聚糖酶描述于wo 99/064619。
[0194]
市售可得的甘露聚糖酶包括但不限于(诺维信公司(novozymes ais))。
[0195]
果胶裂解酶
[0196]
果胶裂解酶(e.c.4.2.2.2)催化(1-》4)-α-d-聚半乳糖醛酸的消除剪切以产生寡糖，在其非还原端带有4-脱氧-α-d-半乳糖-4-enuronosyl基。
[0197]
果胶裂解酶描述于专利和发表的专利申请，包括但不限于：wo2004/090099。已知果胶裂解酶衍生自芽孢杆菌，尤其是地衣芽孢杆菌或黏琼脂芽孢杆菌，或任意这些的变体，例如描述于us 6,124,127、wo 99/027083、wo 99/027084、wo 2002/006442、wo 02/092741、wo 03/095638。
[0198]
市售可得的果胶裂解酶包括：xpecttm、pectawashtm和pectawaytm(诺维信公司)；primagreentm、ecoscour(杜邦)。
[0199]
核酸酶
[0200]
核酸酶(ec 3.1.21.1)也称为脱氧核糖核酸酶i或dnase，对5'-磷酸二核苷酸和5'-磷酸寡核苷酸末端产物进行内切剪切。
[0201]
核酸酶描述于专利和发表的专利申请，包括但不限于：us3,451,935、gb1300596、de10304331、wo2015/155350、wo 2015/155351、wo2015/166075、wo2015/181287和wo2015/181286。
[0202]
当与亲代酶作比较时，酶变体可通过其序列相同性定义。序列相同性通常提供为“％序列相同性”或“％相同性”。为在第一步中确定2种氨基酸序列之间的相同性百分比，在这2种序列之间产生成对序列比对，其中所述2种序列在其全长中比对(即成对全局比对)。比对用实施needleman和wunsch算法(j.mol.biol.(1979)48,第443-453页)的程序生成，优选使用程序“needle”(欧洲分子生物学开放软件套件(emboss))，采用程序默认参数(缺口开放＝10.0，缺口延伸＝0.5和矩阵＝eblosum62)。出于本发明目的的优选比对是从中能确定最高序列相同性的比对。
[0203]
比对2条序列后，在第二步中，应从比对确定相同性值。因此，根据本发明，适用下
列相同性百分比的计算：
[0204]
％相同性(相同残基/在其全长显示本发明中各序列的比对区长度)*100。因而，涉及本实施方案所述2条氨基酸序列的序列相同性如下计算：将相同残基数除以比对区长度，其在全长显示本发明的各序列。该值乘以100产生“％相同性”。
[0205]
对于计算2条dna序列的相同性百分比，其与计算2条氨基酸序列的相同性百分比相同，除了有一些规定。对于编码蛋白的dna序列，成对比对应在编码区全长中进行，从起始到终止密码子，排除内含子。对于非蛋白编码的dna序列，成对比对应在本发明的全长序列中进行，从而本发明的完整序列与另一序列或另一序列外的区域作比较。此外，实施needleman和wunsch算法(j.mol.biol.(1979)48,第443-453页)的优选比对程序是“needle”(欧洲分子生物学开放软件套件(emboss))，采用程序默认参数(缺口开放＝10.0，缺口延伸＝0.5和矩阵＝ednafull)。
[0206]
蛋白表达
[0207]
对于本发明的感兴趣的蛋白的来源没有限制。因此，术语感兴趣的蛋白不仅包括天然或野生型蛋白，还包括感兴趣的蛋白的任意突变变体、片段等，以及合成蛋白。这类基因工程蛋白能如本领域一般所知制备，如通过定点突变、pcr(使用含有所需突变的pcr片段作为pcr反应的引物之一)或随机突变。
[0208]
微生物能包含内源编码感兴趣的蛋白的基因(即感兴趣基因)或感兴趣基因可以对微生物细胞而言是异源的。优选地，编码感兴趣的蛋白的基因对宿主细胞而言是异源的。
[0209]
所需蛋白可分泌入发酵液的液体部分或可保留在微生物细胞内。优选地，发酵产物由微生物分泌入发酵液。感兴趣的蛋白分泌入发酵培养基允许感兴趣的蛋白与发酵液分离。对于感兴趣的蛋白分泌入发酵培养基，用于表达感兴趣的蛋白的核酸构建体包括编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽指导感兴趣的蛋白分泌入发酵培养基。本领域已知多种信号肽。优选的信号肽选自来自枯草芽孢杆菌apre蛋白的信号肽，或来自枯草芽孢杆菌yvce蛋白的信号肽。
[0210]
特定实施方案
[0211]
以下显示本发明特定实施方案的列表：
[0212]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0213]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0214]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0215]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0216]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0217]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0218]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0219]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0220]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0221]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0222]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0223]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0224]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0225]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0226]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0227]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0228]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0229]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0230]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0231]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0232]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0233]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0234]
b)将发酵液或其部分的ph调整到高于ph 11，和
[0235]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离，
[0236]
其中在添加二价阳离子前的发酵液或其部分包含磷酸根，优选其中发酵液或其部分中的磷酸根在添加二价阳离子的盐后不超过10mmol。
[0237]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0238]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0239]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0240]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0241]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0242]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0243]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0244]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0245]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0246]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0247]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0248]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0249]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0250]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0251]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0252]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0253]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0254]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0255]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0256]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0257]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0258]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0259]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0260]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0261]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0262]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0263]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0264]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0265]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0266]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0267]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0268]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0269]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0270]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0271]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11，和
[0272]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0273]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0274]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0275]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0276]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0277]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0278]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0279]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0280]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0281]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0282]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0283]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0284]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0285]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0286]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0287]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0288]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0289]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0290]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0291]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0292]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0293]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：
[0294]
a)向包含感兴趣的蛋白的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0295]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0296]
c)使感兴趣的蛋白与杂质和/或生物质分离。
[0297]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0298]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0299]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0300]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0301]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0302]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0303]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0304]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0305]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0306]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0307]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0308]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0309]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0310]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0311]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0312]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0313]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0314]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0315]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0316]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0317]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0318]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0319]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0320]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0321]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0322]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0323]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0324]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0325]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0326]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0327]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0328]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0329]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0330]
a)向包含蛋白酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0331]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0332]
c)使蛋白酶与杂质和/或生物质分离。
[0333]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0334]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0335]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0336]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0337]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0338]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0339]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0340]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0341]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0342]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0343]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0344]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0345]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0346]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0347]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0348]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0349]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0350]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0351]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0352]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0353]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0354]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0355]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0356]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0357]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0358]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0359]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0360]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0361]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0362]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0363]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0364]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0365]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0366]
a)向包含淀粉酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0367]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0368]
c)使淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0369]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0370]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0371]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0372]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0373]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0374]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0375]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0376]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0377]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0378]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入二价阳离子的盐，和
[0379]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0380]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0381]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0382]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0383]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0384]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0385]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0386]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0387]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0388]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0389]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0390]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入cacl2，和
[0391]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0392]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0393]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0394]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0395]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 11.5，和
[0396]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0397]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0398]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0399]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12，和
[0400]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0401]
在一个实施方案中，本发明涉及从发酵液中回收α-淀粉酶的方法，包括以下步骤：
[0402]
a)向包含α-淀粉酶的发酵液或其部分加入mgcl2，和
[0403]
b)将发酵液的ph调整到高于ph 12.5，和
[0404]
c)使α-淀粉酶与杂质和/或生物质分离。
[0405]
本发明在下列实施例中进一步阐明，所述实施例不意在以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
实施例
[0406]
下列实施例仅用于阐明本发明。对于本领域技术人员明显的许多可能变化也在本发明范围内。
[0407]
除非另有说明，进行下列实验是通过应用基因工程所用标准设备、方法、化学品和生化药剂以及经微生物培养的化合物发酵生产。还参见sambrook等.(《分子克隆：实验室手册》(molecular cloning:a laboratory manual).第2版,冷泉港实验室(cold spring harbor laboratory),纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press),1989)和chmiel等.(bioprocesstechnik 1.einf
ü
hrung in die bioverfahrenstechnik,gustav fischer verlag,stuttgart,1991)。
[0408]
用于下面实施例(实施例1-3)的发酵液通过培养地衣芽孢杆菌细胞获得，所述细胞包含编码淀粉酶的基因，该淀粉酶是wo 96/23873所公开的sp722淀粉酶的变体。地衣芽孢杆菌细胞在发酵工艺中培养，使用化学成分确定的发酵培养基，提供表1和表2所列的组分。
[0409]
表1:发酵工艺过程中提供的大量元素
[0410][0411][0412]
表2:发酵工艺过程中提供的微量元素
[0413][0414]
含有50％葡萄糖的溶液用作进料溶液。在发酵期间用氨调整ph。在想要的产物滴度处终止发酵，产物淀粉酶以可溶和结晶形式存在，如用显微镜目测确认。发酵结束时，磷酸根浓度是约3g/l。
[0415]
实施例1
[0416]
下列实施例显示溶解(增溶)相当部分发酵液中存在淀粉酶晶体需要高于11.0的ph水平。
[0417]
通过在搅拌下加入稀释的(10％(w/v))naoh溶液，将发酵液调整至ph水平11.0、11.5和12.0。一旦达到所需ph，取0min时间点的光密度样品，上清在搅拌下进一步孵育至多120分钟。更多样品在孵育期间数个时间点获取。为确定700nm的光密度(od700)，样品用水1:100稀释，随后在光度计中700nm测量。
[0418]
od700值在孵育的前15分钟减少到平台值(图1)。od700减少反映了晶体溶解。图1显示晶体溶解(增溶)程度取决于溶液ph水平，ph水平越高，引起的晶体溶解越好。重要的是，溶解可接受部分的淀粉酶晶体需要大于11.0的ph水平，以用于进一步回收和纯化操作。
[0419]
实施例2
[0420]
下列实施例显示先前没有添加cacl2时，可溶部分的大量酶活性损失在高于11的ph水平发生。
[0421]
发酵液在实验室离心机中10000g离心10分钟。通过在搅拌下加入稀释的(10％(w/v))naoh溶液，上清调整至ph水平11.0、11.5和12.0。一旦达到所需ph，取0min时间点的酶活性样品，上清在搅拌下进一步孵育至多120分钟。更多样品在孵育期间数个时间点获取。为确定剩余酶活性，样品直接稀释到分析缓冲液(50％mpg,mops,ph＝7)中，离心，且上清用淀粉酶活性测定分析(lorentz k.等.(2000),clin.chem.,46/5:644
–
649)。
[0422]
图2中，显示相对于各样品0min值，含有淀粉酶的上清剩余酶活性。ph 11样品显示120min中，活性下降百分之一。ph 11.5样品显示120min中，活性下降百分之九，其中最高下降在前30分钟内观察到。ph 12.0样品在前30分钟内完全失去活性。
[0423]
实施例3
[0424]
下列实施例显示在调整ph水平高于11.0之前添加cacl2防止了可溶部分的大量酶活性损失。
[0425]
发酵液在实验室离心机中10000g离心10分钟。调整ph前，7.5g/l cacl2在搅拌下加入上清。随后，通过在搅拌下加入稀释的(10％(w/v))naoh溶液，上清调整至ph水平11.0、11.5和12.0。一旦达到所需ph，取0min时间点的活性样品，上清在搅拌下进一步孵育至多120分钟。更多样品在孵育期间数个时间点获取。为确定剩余酶活性，样品直接稀释到分析缓冲液(50％mpg,mops,ph＝7)中，离心，且上清用淀粉酶活性测定分析(lorentz k.等.(2000),clin.chem.,46/5:644
–
649)。
[0426]
图3中，显示相对于各样品0min值，含有淀粉酶的上清的剩余酶活性。ph 11.0和ph 11.5样品显示90min中，活性几乎没有下降。ph 12.0样品在90min中损失约14％。相较于实施例2的结果，其显示添加cacl2几乎完全防止了ph 11.5下的酶活性损失且ph 12.0的酶活性损失显著减少。