产胞外多糖的青霉菌D306菌株及其在制备胆汁酸结合剂中的应用的制作方法

产胞外多糖的青霉菌d306菌株及其在制备胆汁酸结合剂中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，更具体地，涉及产胞外多糖的青霉菌d306 菌株及其在制备胆汁酸结合剂中的应用。


背景技术：

2.目前，高脂血症已经成为多种疾病的源头，严重影响人类健康。当血液中的胆固醇过高则会造成高脂血症并引发心血管疾病。由于胆固醇的主要代谢途径是在肝内转化为胆汁酸，可通过胆汁酸螯合剂与胆汁酸呈不可逆性结合，阻碍胆汁酸的肝肠循环，促进胆汁酸排出，引起胆固醇向胆汁酸的加速转化；另外肠道吸收外源胆固醇时需要经过胆汁酸的乳化，而被螯合剂结合后的胆汁酸随粪便排出，影响了胆固醇从肠道的消化吸收，从而达到降低肝内和血浆内胆固醇水平的目的。临床上最常用于治疗这类疾病的药物为考来烯胺，但副作用大，最常见的不良反应为便秘，明显的肠胃道不良反应，也会影响多种维生素和一些酸性药物的吸收等。因此开发天然、有效、对人体副作用小的药物是有十分必要的。
3.胞外多糖是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞外的次级代谢物。胞外多糖是一种活性大分子，对人体具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗凝血等生理作用，且胞外多糖具有生产成本低、生产周期短、易于分离的特点，成为食品科学、天然药物等领域的研究热点之一。
4.pigeon r m等[pigeon r m,cuestaep,gil liland s e.binding offree bile acids by cells of yogurt starter culture bacteria[j].j dairy sci,2002, 85(11):2705
‑
2710.]通过研究报道，利用产胞外多糖菌体发酵的发酵乳喂养小鼠，具有降低小鼠血液中胆固醇含量的能力，而不产胞外多糖菌体发酵乳不具有此效果。说明胞外多糖对胆固醇的结合、吸收、排泄等代谢过程起到了重要的作用，胞外多糖和游离胆汁酸的结合，导致胆汁酸无法被肠道吸收，抑制了肠肝循环的进行。但目前尚未有青霉菌(penicillium gerundense)d306 菌株所产的胞外多糖具有胆汁酸结合能力的相关报道，因此寻求新的胆汁酸结合剂有助于开发天然、有效、对人体副作用小的药物。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于弥补现有技术中的不足，本发明提供了一株青霉菌 (penicillium gerundense)d306菌株在产胞外多糖中的应用。本发明的青霉菌d306菌株具有产胞外多糖的特性，该胞外多糖具有胆汁酸结合能力，为开发高脂血症预防、治疗药物提供了新的方向，是一个非常有潜力的菌株。
[0006]
本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0007]
本发明提供了一株青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株在产胞外多糖中的应用，所述青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株于2021年4 月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no: m 2021487。
[0008]
优选地，将上述青霉菌d306菌株进行常规发酵，发酵后上清液中即含有胞外多糖。
[0009]
青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株属于子囊菌亚门门，不整囊菌纲，散囊菌目，青霉属。
[0010]
本发明的产胞外多糖的青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株是从广西壮族自治区梧州市六堡茶企业渥堆过程中发酵茶叶获得。在ca培养基菌落呈现圆形，正面灰色，质地紧密，无渗出液，反面灰色；在cya培养基菌落呈现椭圆形，正面灰色，质地疏松，无渗出液，反面灰色；显微镜下菌丝有间隔，孢子梗壁光滑，帚状枝多轮生，分生孢子呈圆形或类圆形、光滑。
[0011]
本发明的另一目的是提供青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株在制备胆汁酸结合剂胞外多糖中的应用。具体技术方案如下：
[0012]
青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株在制备胆汁酸结合剂胞外多糖中的应用，所述青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株于2021年4月 29日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为中国武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc no:m 2021487。
[0013]
本发明还提供一种由上述青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株制备得到的胆汁酸结合剂胞外多糖。
[0014]
该目的通过以下技术方案实现：
[0015]
利用青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株制备胆汁酸结合剂胞外多糖方法，包括如下步骤：
[0016]
s1、对保藏编号为cctcc no:m 2021487的青霉菌d306菌株进行发酵，发酵产物过滤，得到发酵液；
[0017]
s2、将s1中所得发酵液离心去除菌体，取上清液用醇沉法提取多糖；
[0018]
s3、将s2中多糖复溶，溶液用sevag法去蛋白，取上清液醇沉提取多糖，产物复溶透析，所得溶液真空冷冻干燥，即得胆汁酸结合剂胞外多糖，标记为胆汁酸结合剂eps
‑
d306。
[0019]
优选地，步骤s1中所述发酵条件为：培养基选择pdb培养基，发酵温度为28℃，摇床转速120r/min，发酵时间为168小时。
[0020]
优选地，步骤s2中所述离心转速为6000r/min，离心20min。
[0021]
优选地，步骤s2所述醇沉法乙醇与发酵液体积比为3:1，醇沉温度为4℃。
[0022]
优选地，步骤s3中所述sevag法中正丁醇与氯仿溶液体积比为1:4，试剂磁力搅拌20min；所述透析所用透析袋的截留分子量为8000da
‑
12000 da，透析条件为加入100倍体积蒸馏水中透析，每隔4小时更换，透析时间为48h。
[0023]
本发明对上述青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株制备得到的胆汁酸结合剂胞外多糖成分及分子量进行了鉴定分析。
[0024]
作为本发明优选，所述胆汁酸结合剂胞外多糖成分中总糖含量为76.14％，糖醛酸含量为21.63％，不含有蛋白质；分子量由8.88％的1092.677kda和 91.12％的13.187kda组成；单糖由man、glua、rha和gal组成，摩尔比为 0.35：1.16：0.09：52.46。
[0025]
本发明的另一个目的在于提供上述青霉菌(penicillium gerundense)d306 菌株制备得到的胆汁酸结合剂胞外多糖在预防和治疗高脂血症及高脂血症引发的心血管疾病的药物中的应用。
[0026]
本发明提供的青霉菌d306菌株所生产的胆汁酸结合剂胞外多糖具有与胆汁酸结
合的能力，半抑制浓度ic50值为20.075mg/ml，可以有效地降低胆固醇水平，该胆汁酸结合剂胞外多糖是一种有潜力应用于预防和治疗高脂血症的活性成分。
[0027]
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0028]
本发明提供的青霉菌(penicillium gerundense)d306菌株，能够生产具有胆汁酸结合能力的胞外多糖，利用其制备得到的胆汁酸结合剂半抑制浓度 ic50值为20.075mg/ml，可以阻碍胆汁酸的肝肠循环，促进胆汁酸排出，引起胆固醇向胆汁酸的加速转化，降低体内胆固醇水平；胞外多糖天然、有效、对人体副作用小，为开发高脂血症的防治和治疗药物提供了新的思路，具有良好的应用前景。
附图说明
[0029]
图1为d306菌株显微镜观察图。
[0030]
图2为d306菌株系统进化树图。
[0031]
图3为d306菌株胞外多糖eps
‑
d306紫外光谱图。
[0032]
图4为d306菌株胞外多糖eps
‑
d306红外光谱图。
[0033]
图5为d306菌株胞外多糖eps
‑
d306凝胶色谱图。
[0034]
图6为d306菌株胞外多糖单糖组成检测图；其中a为不同单糖标品，b 为eps
‑
d306。
[0035]
图7为d306菌株胞外多糖的胆汁酸结合能力。
具体实施方式
[0036]
以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0037]
实施例1 青霉菌d306菌株的分离、培养与鉴定
[0038]
1、菌株分离与纯化
[0039]
(1)菌落收集：称取每个茶叶样品(采样于广西壮族自治区梧州市六堡茶企业渥堆过程中发酵茶叶)2g，剪碎后加入20ml无菌水的蓝口瓶， 80r/min条件下振荡30min，使附着在茶叶上的微生物脱落。
[0040]
(2)菌群培养：取1ml上述菌液，分别稀释成10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、 10
‑5、10
‑6的梯度浓度菌悬液，吸取200μl的菌悬液，加入培养皿中，用一次性涂布棒涂布均匀，放置28℃和37℃的培养箱培养2到3天。
[0041]
(3)菌株纯化：挑取上述涂布培养皿上的白毛状菌落，用pda平板进行划线培养并进行标记，重复纯化4次以上，直至得到单一菌株，命名为d306 菌株。
[0042]
2、菌株形态学观察：将纯化后的菌株接种到ca和cya培养基，在28℃条件下培养3到7天。观察两种培养皿的正反面，对菌落颜色、生长速度、渗出液等特征进行描述，并根据《真菌鉴定手册》进行鉴定。
[0043]
(1)d306菌株在ca培养基，菌落呈现圆形，正面灰色，质地紧密，无渗出液，反面灰色。
[0044]
(2)d306菌株在cya培养基，菌落呈现椭圆形，正面灰色，质地疏松，无渗出液，反面灰色。
[0045]
(3)显微镜观察：在载玻片的正中央滴一滴乳酸酚棉兰染色液染色剂，用镊子夹取少量的菌丝体于染色液中并将菌体挑开，盖上盖玻片并进行10、 20、40倍镜观察。
[0046]
d306属于青霉菌属，经乳酸酚棉兰染色液染色呈蓝色，显微镜下可观察到菌丝有间隔，孢子梗壁光滑，帚状枝多轮生，分生孢子呈圆形或类圆形、光滑。(显微镜观察图如图1所示)。
[0047]
3、分子鉴定：
[0048]
(1)dna的提取：将纯化后的单菌落接种于isp2培养基，在37℃的培养箱培养12到24小时。取50μl灭菌过的树脂溶液于八连管，用牙签挑取极少部分的菌体放置于八连管中研磨1min。八连管在金属浴100℃下保持10 min，离心取上清液即为模板dna。
[0049]
(2)pcr反应：制备真菌的pcr反应体系：
[0050]
表1.pcr反应体系
[0051][0052][0053]
将上述表1中196μl的pcr反应体系均匀的分配到灭菌后的八连管中，每个孔加入0.5μl的模板dna。引物27f：agtttgatcmtggctcag，引物1492r：ggttaccttgttacgactt。
[0054]
pcr扩增条件：95℃预变性8min；94℃变性50s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，31个循环，最后72℃延伸10min，
‑
20℃保存备用。
[0055]
(3)检测pcr扩增结果：配置质量分数为1％的琼脂糖溶液，微波炉加热溶解后加入gold view i染色剂。将琼脂糖溶液缓慢到电泳仪模具，并插入梳子使其形成小孔，琼脂糖冷却形成凝胶后取出梳子。缓慢倒入1
×
tae电泳缓冲液使其刚好没过琼脂糖凝胶表面。用移液枪吸取2.5μl的pcr产物打入凝胶小孔。在110v、100ma的条件下电泳25min。用凝胶成像仪观察pcr 扩增条带是否清晰，以检验dna扩增是否成功。
[0056]
(4)pcr产物测序：将合格的pcr产物低温运送至上海美吉有限公司进行序列测定，测序结果如seq id no.1所示。
[0057]
(5)blast比对：将测序后的结果选择合适的序列在blast进行核苷酸序列比对，选择同源性较高的菌株，采用megax软件进行进化树的建立，确定所分离菌株的种属。
[0058]
利用序列比对进行系统发育分析，d306菌株属于青霉菌(penicilliumgerundense)，进化树见图2。
[0059]
实施例2 青霉菌d306菌株所产胞外多糖提取及成分测定
[0060]
1、胞外多糖提取与纯化
[0061]
(1)菌株活化：将实施例1菌株接种到pda培养基，28℃下培养72小时。
[0062]
(2)菌株培养：在青霉菌培养基生长最密集的地方，用打孔器取下一小块接入pdb
培养基，在28℃，120r/min的条件下发酵168小时。
[0063]
(3)胞外多糖粗提取：青霉菌发酵液先抽滤除去大部分菌体后，滤液在 6000r/min，20min下离心，取上清液加入3倍体积的95％乙醇，4℃过夜。离心收集沉淀，沉淀晾干后加入一定体积的蒸馏水重融，再加入3倍体积的 95％乙醇，4℃过夜。收集沉淀，晾干，即为青霉菌的胞外多糖粗提物。
[0064]
(4)胞外多糖纯化：胞外多糖粗提物加入蒸馏水溶解配制成为1％的糖溶液，用sevag法除蛋白。将正丁醇与蒸馏水等体积混合，超声10min，取上层溶液为水饱和的正丁醇溶液，在上述正丁醇溶液加入4倍体积氯仿得到 sevag试剂。在1％糖溶液中加入三分之一倍体积的sevag试剂，磁力搅拌器搅拌20min，倒入分液漏斗静止直至明显分层，将下层有机试剂和中层变形蛋白除去，收集上层为除蛋白后的糖溶液。重复除蛋白操作，直至无乳白色沉淀。然后在60℃条件下旋转蒸发除去有机试剂，加入三倍体积95％的乙醇并在4℃冰箱过夜，离心收集沉淀。沉淀加适量蒸馏水溶解后装入截留分子量为8000da
‑
12000 da的透析袋，在100倍体积蒸馏水中透析，每隔4小时换一次水，共透析48小时。透析后，将截留液进行冷冻干燥，得到d306菌株胞外多糖，标记为eps
‑
d306。
[0065]
2、eps
‑
d306胞外多糖成分测定
[0066]
发酵液干物质含量的测定：记录恒重后的称量皿的重量(m1)，加入1ml 发酵上清液，记录重量(m2)。放入110℃鼓风干燥箱干燥至恒重，记下质量(m3)。每1ml发酵上清液干物质含量(d)按照以下方式计算：
[0067][0068]
(1)总糖含量测定：配制0.1mg/ml的标准葡萄糖母液。吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml标准葡萄糖母液蒸馏水定容到2ml。分别加入1ml 的苯酚溶液，再快速的加入5ml浓硫酸，摇匀，放置10min，再在25℃反应20min。移取200μl反应溶液于96孔酶标板，在490nm处测定吸光值。标准曲线的线性回归方程为y＝10.69x
‑
0.0096，r2＝0.9966。y是吸光值，x是葡萄糖浓度(mg/ml)。取2ml的待测样本，其余操作同标准曲线的条件。将待测样本的吸光值带入标准曲线，得到总糖浓度。发酵液总糖含量按照下式进行计算：
[0069][0070]
c2是菌株待测样本的总糖浓度(mg/ml)，c1是蒸馏水待测样本总糖浓度(mg/ml)，a是稀释倍数，d是菌株待测样本干物质含量(g/ml)。
[0071]
(2)糖醛酸含量测定：配制200μg/ml的标准糖醛酸母液，取一定量标准糖醛酸母液，补足蒸馏水至0.5ml，使得成为0、15、30、45、60、75、90、 105、120、135、150μg/ml的系列标准溶液。将这0.5ml的系列标准溶液置于10ml的ep试管，ep试管置于碎冰上，向每支试管加入3ml的0.025mol/l 的四硼酸钠
‑
硫酸试剂，盖紧试管盖，轻轻摇动，然后放在沸水浴加热10min，取出冷却至室温。向每支试管加入0.1ml的0.125％的咔唑
‑
乙醇试剂，再次摇动管子，盖紧盖子，沸水浴加热15min，冷却到室温。吸取200μl反应液在530nm处测定吸光值。半乳糖醛酸标准曲线的线性回归为 y＝0.0044x
‑
0.0238，r2＝0.9933。y是吸光值，x是半乳糖醛酸浓度(μg/ml)。取0.5ml待测样本，其余操作同标准曲线。菌株发酵液糖醛酸含量按照下面的公式进行计算：
[0072][0073]
其中，c2是菌株待测样本的糖醛酸浓度(mg/ml)，c1是空白培养基待测样本的糖醛酸浓度(mg/ml)，a是稀释倍数，d是菌株待测样本干物质含量(g/ml)。
[0074]
(3)蛋白质含量测定：配制蛋白质试剂，100mg的考马斯亮蓝g
‑
250 溶于50ml的95％的乙醇溶液，在该溶液中加入100ml的85％(w/v)磷酸。所得溶液稀释至最终体积1000ml。试剂的最终浓度为0.01％(w/v)考马斯亮蓝g
‑
250、4.7％(w/v)乙醇及8.5％(w/v)磷酸。
[0075]
配制成为100μg/ml的牛血清蛋白标准液。吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5ml的标准液，用蒸馏水补足到0.5ml，加入2.5ml蛋白质试剂，涡旋混合均匀。反应15min后，用96孔酶标板测量595nm处的吸光度。将蛋白质的浓度与相应的吸光度绘制成标准曲线，用于测定未知样品中的蛋白质。蛋白质的标准曲线的线性回归为y＝0.0033x 0.0183，r2＝0.9936。y是吸光值，x 是蛋白质浓度(μg/ml)。胞外多糖提取物用蒸馏水稀释后取0.5ml，加入考马斯亮蓝溶液2.5ml，反应15min后在同样的条件下比色。胞外多糖粗提物的蛋白质含量按照下面的公式进行计算：
[0076][0077]
c2是菌株待测样本的蛋白质浓度(mg/ml)，c1是空白对照蒸馏水的蛋白质浓度(mg/ml)，a是稀释倍数，d是待测样本的质量(g)。
[0078]
实验结果为eps
‑
d306总糖含量为76.14％，糖醛酸含量为21.63％，不含有蛋白质。
[0079]
实施例3 青霉菌d306菌株所产胞外多糖结构表征
[0080]
1、紫外光谱分析
[0081]
将胞外多糖样品溶于蒸馏水并调节到合适的浓度，随后进行紫外光谱 (uv)扫描分析，扫描波长在200nm
‑
400nm范围。
[0082]
紫外光谱扫描如图3所示，在260nm
‑
280nm处没有吸收峰，说明不含蛋白或核酸。
[0083]
2、红外光谱分析
[0084]
称取胞外多糖样品3mg和溴化钾固体粉末270mg，混合研磨至样品颗粒没有晶状体后用压片机制成均匀的薄片。用傅里叶变换红外光谱仪进行扫描，扫描范围为4000cm
‑1‑
400cm
‑1。
[0085]
红外光谱扫描如图4所示，在3426.69cm
‑1处出现强烈吸收峰可归因于 o
‑
h键的伸缩振动峰，表明存在羟基；2936.65cm
‑1处的峰是糖链上的
‑
ch2或
‑
ch的c
‑
h键的伸缩振动峰。1642.70cm
‑1处附近的峰归因于束缚水的存在。 1420.64cm
‑1处出峰可能是羧基或羧酸盐的特征，表明胞外多糖都是酸性多糖。多糖在1240.23cm
‑1处有吸收峰，这是s＝o的伸缩振动峰，表明是一种硫酸多糖。1100cm
‑1‑
1010cm
‑1有3个吸收峰则代表有吡喃环，而有2个吸收峰则代表有呋喃环。结果证明6种多糖都只有2个峰，表明含呋喃环。在1087.52 cm
‑1处是吡喃环的醚键c
‑
o
‑
c和羟基的吸收峰；多糖在1010.68cm
‑1处是c
‑
o 伸缩振动峰；928.11cm
‑1处出峰表明多糖可能含有甘露糖；在890cm
‑1和812 cm
‑1没有吸收峰，而在850cm
‑1左右出峰，表明含有α
‑
糖苷键。在762.98cm
‑1有吸收峰是由α
‑
吡喃环对称伸缩振动引起的。
[0086]
3、分子量的测定
[0087]
采用凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，gpc)法测定胞外多糖的分子量。胞外多糖和系列葡聚糖标品(580、29330、10730、31420、 63350、143400、280500、841700、2560000和7500000da)溶于超纯水，配制成1mg/ml的溶液。
[0088]
色谱条件：waters gpc 1515型，配备示差折光检测器，色谱柱：watersultrahydrogel 500column(7.8
×
300mm)、waters ultrahydrogel 250column (7.8
×
300mm)和waters ultrahydrogel 120column(7.8
×
300mm)串联合用。流动相：超纯水；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：40μl。
[0089]
通过葡聚糖标品的标准曲线，得到的标准曲线为y＝
‑
0.5409x 12.424,计算得到r2＝0.9985，说明线性范围较好。图5是菌株胞外多糖的gpc图，把胞外多糖的保留时间带入标准曲线，得出分子量，见表2。
[0090]
表2 胞外多糖的分子量
[0091][0092]
结果表明，eps
‑
d306是非均一多糖，分子量为1092.677kda(8.88％)、 13.187kda(91.12％)。
[0093]
4、单糖组成分析
[0094]
采用pmp柱前衍生法测定胞外多糖的单糖组成。
[0095]
多糖的水解：取胞外多糖粉末0.0500g置于水解管中，加1ml的hcl (3.0mol/l)，封口，混匀，110℃水解4
‑
6小时，放冷，用3.0mol/l的naoh 调节ph值至中性，吸取400μl进行衍生化处理。
[0096]
单标和梯度混标的配制(1)单标：各单糖对照品(阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、岩藻糖和鼠李糖)溶于超纯水，浓度为2mmol/l。(2)混标：单糖对照品共溶于超纯水，使得每个标品的浓度为1.6mg/ml，后稀释为1.6、1.2、1.0、0.8、0.4、0.2mg/ml共6个浓度的梯度混标。
[0097]
单糖衍生：取标品溶液(单标和梯度混标)及水解好的多糖样品400μl，加0.5mol/l的pmp
‑
甲醇溶液与0.3mol/l的naoh各400μl，混匀，70℃水浴反应100min。再加入500μl的0.3mol/l的hcl，用三氯甲烷萃取pmp 试剂3次，每次5ml，弃去三氯甲烷层，水层离心后，取上清液1ml过0.45 μm有机系滤膜，进行高效液相色谱(hplc)分析。
[0098]
采用waters 2984lc型高效液相色谱仪进行分析。色谱条件：waters c18 色谱柱(4.6
×
150mm，5μm)；以乙腈
‑
0.02mol/l的乙酸铵溶液(17：83) 为流动相色谱条件；柱温30℃；流速1.0ml/min；检测波长250nm，进样量 10μl。
[0099]
实验结果如图6所示eps
‑
d306的胞外多糖由man、glua、rha和gal 组成，摩尔比为0.35：1.16：0.09：52.46(1
‑
甘露糖，2
‑
葡萄糖醛酸，3
‑
半乳糖醛酸，4
‑
鼠李糖，5
‑
葡萄糖，6
‑
半乳糖，7
‑
阿拉伯糖，8
‑
岩藻糖，x
‑
未知组分，pmp
‑
pmp衍生剂)。
[0100]
实施例4 青霉菌d306菌株所产胞外多糖胆汁酸活性结合能力测定
[0101]
将制备的胆汁酸结合剂eps
‑
d306配置成溶液，浓度为10mg/ml
‑
110 mg/ml，通过胆汁酸测试盒测定结合能力。
[0102]
胆汁酸测试盒购于南京建成生物工程研究所有限公司。
[0103]
胆汁酸工作液：甘氨胆酸(9mmol/l)、鹅去氧胆酸(9mmol/l)、甘氨脱氧胆酸(9mmol/l)，牛磺鹅胆酸(4.5mmol/l)，牛磺脱氧胆酸(4.5 mmol/l)溶于ph＝6.8的磷酸盐缓冲溶液，即配制成为36mmol/l的胆汁酸储备溶液。将该36mmol/l的储备溶液储存在
‑
20℃的冰箱并在使用前稀释为 0.72μmol/ml的胆汁酸工作液。
[0104]
将1ml的配置的胆汁酸结合剂胞外多糖eps
‑
d306溶液或者与胞外多糖同等浓度的考来烯胺装入15
×
150mm的玻璃试管，加入1ml，0.01mol/l的 hcl，于37℃，120r/min模拟胃的酸性消化2小时。用0.2mol/l的naoh将样品ph调节至7
‑
7.5。向每个待测样品中加入4ml胆汁酸工作液(0.72 μmol/ml)和5ml胰酶(10mg/ml，溶于ph＝6.8的磷酸缓冲液)，于37℃， 120r/min条件下模拟体外肠消化2小时。混合物在6000r/min的条件下离心 20min，取上清液存于
‑
20℃待测。以蒸馏水作为阴性对照。
[0105]
根据总胆汁酸试剂盒的测定方法对上清液中胆汁酸含量进行检测。胆汁酸含量的公式为：
[0106][0107]
其中，酶标仪读取405nm处吸光度a0，3min后再读取吸光度a1，δa＝a1‑
a0。δa测定是样品的δa值，δa校准是校准品的δa值，胆汁酸校准品的浓度为50μmol/l。
[0108]
测定结果如图7所示，胆汁酸结合剂eps
‑
d306在浓度为10mg/ml
‑
110 mg/ml的范围内都表现出活性，半抑制浓度ic50值为20.075mg/ml，表明d306 菌株制备的胆汁酸结合剂胞外多糖在高脂血症的防治和治疗等方面具有良好的应用前景。