一组鉴定玉米杂交种纯度的SNP核心位点、引物和高通量鉴定纯度的方法与流程

一组鉴定玉米杂交种纯度的snp核心位点、引物和高通量鉴定纯度的方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一组鉴定玉米杂交种纯度的snp核心位点、引物和鉴定纯度的方法。


背景技术：

2.玉米杂交种的纯度高低是影响田间产量、产品品质以及农民收益的关键因素之一。因此，玉米杂交种纯度鉴定是把控玉米种子质量的重要手段尤其是对于杂交种中自交苗的检测，在种子企业质量自控、政府市场监测等多个环节提供重要依据。
3.目前用于玉米杂交种纯度鉴定的方法主要包括田间小区种植鉴定法、盐溶蛋白法和ssr分子标记法等。田间小区种植鉴定是目前广泛使用的纯度鉴定方法，在检验规程中也标注其是最准确的鉴定方法，但这种方法存在一些问题，主要包括以下几个方面。第一，鉴定周期长，需要等待一个种植周期才能得到结果，不能及时发现纯度问题并将经济损失降到最低。第二，结果易受环境因素影响，由于地力不均或病虫害产生的弱株和病株容易和自交株混淆，使得出现错判或漏判的结果，最终影响纯度结果。由于玉米品种适宜的种植生态区不同，如若种植鉴定不在品种适宜生态区，很有可能导致品种表型出现较大变化，增加判定的难度。第三，对检验员要求高，容易受人员因素影响，检验员需要充分了解不同品种的特征及其和亲本、近似品种的差别，要求检验员具有丰富的田间鉴定经验。
4.盐溶蛋白法由于其快速简便目前也广泛应用于玉米品种纯度鉴定中，但其也存在一些问题，蛋白电泳在某些品种上找不到双亲差异或无法区分自交苗，不能鉴定所有品种。ssr等分子标记鉴定法无法满足样本高通量的检测需求，尤其是制种到市场销售期间短期大量品种纯度鉴定的需求。
5.对于杂交种纯度鉴定，从制种环节到市场销售期间短期大量品种纯度鉴定的需求，因此探索出一套高效准确且适用于市场上绝大多数的玉米杂交种纯度鉴定的高通量方案具有很重要的意义。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一组鉴定玉米杂交种纯度的snp核心位点、引物和高通量鉴定纯度的方法，采用本发明提供的位点能够鉴定玉米杂交种的纯度。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
8.本发明提供了一组鉴定玉米杂交种纯度的snp核心位点，包括玉米1号染色体第8974336位、1号染色体第289408285位、2号染色体第109563976位、2号染色体第186339948位、3号染色体第27775731位、3号染色体第118083714位、4号染色体第20077010位、4号染色体第128874466位、5号染色体第13402375位、5号染色体第204879476位、6号染色体第39822979位、6号染色体第141476300位、7号染色体第126677146位、7号染色体第15521714位、8号染色体第20978845位、8号染色体第118299376位、9号染色体第104695670位、9号染
色体第127197714位、10号染色体第39960289位和10号染色体第109396730位。
9.本发明还提供了一组扩增上述技术方案所述的snp核心位点的引物，所述引物的核苷酸序列如seq id no.1～60所示。
10.优选的，扩增玉米1号染色体第8974336位的核苷酸序列如seq id no.1～3所示；
11.扩增玉米1号染色体第289408285位的核苷酸序列如seq id no.4～6所示；
12.扩增玉米2号染色体第109563976位的核苷酸序列如seq id no.7～9所示；
13.扩增玉米2号染色体第186339948位的核苷酸序列如seq id no.10～12所示；
14.扩增玉米3号染色体第27775731位的核苷酸序列如seq id no.13～15所示；
15.扩增玉米3号染色体第118083714位的核苷酸序列如seq id no.16～18所示；
16.扩增玉米4号染色体第20077010位的核苷酸序列如seq id no.19～21所示；
17.扩增玉米4号染色体第128874466位的核苷酸序列如seq id no.22～24所示；
18.扩增玉米5号染色体第13402375位的核苷酸序列如seq id no.25～27所示；
19.扩增玉米5号染色体第204879476位的核苷酸序列如seq id no.28～30所示；
20.扩增玉米6号染色体第39822979位的核苷酸序列如seq id no.31～33所示；
21.扩增玉米6号染色体第141476300位的核苷酸序列如seq id no.34～36所示；
22.扩增玉米7号染色体第126677146位的核苷酸序列如seq id no.37～39所示；
23.扩增玉米7号染色体第15521714位的核苷酸序列如seq id no.40～42所示；
24.扩增玉米8号染色体第20978845位的核苷酸序列如seq id no.43～45所示；
25.扩增玉米8号染色体第118299376位的核苷酸序列如seq id no.46～48所示；
26.扩增玉米9号染色体第104695670位的核苷酸序列如seq id no.49～51所示；
27.扩增玉米9号染色体第127197714位的核苷酸序列如seq id no.52～54所示；
28.扩增玉米10号染色体第39960289位的核苷酸序列如seq id no.55～57所示；
29.扩增玉米10号染色体第109396730位的核苷酸序列如seq id no.58～60所示。
30.本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的引物高通量鉴定玉米杂交种纯度的方法，包括以下步骤：
31.1)提取玉米材料的dna，将所述dna利用上述技术方案所述的引物进行pcr；
32.2)收集原始荧光信号后进行基因分型，将得到的分型结果导入snp数据库管理系统，去除双亲不互补和遗传不稳定的位点，统计至少两个位点的结果，计算玉米纯度。
33.优选的，所述步骤1)玉米包括玉米的籽粒、幼苗或叶片。
34.优选的，所述步骤1)pcr的体系每1μl包括：20ng烘干的dna、0.5μl 2
×
kasp pcr预混液、0.486μl去离子水和0.014μl引物工作液。
35.优选的，所述步骤1)pcr的体系每3μl包括：1.45μl dna、1.5μl 2
×
kasp pcr预混液和0.05μl引物工作液。
36.优选的，所述步骤1)pcr的体系每10μl包括：1.5μl dna、5μl 2
×
kasp pcr预混液、3.36μl去离子水和0.14μl引物工作液。
37.优选的，所述引物工作液中上游引物的浓度为12μmol/l，下游引物的浓度为30μmol/l。
38.优选的，所述pcr的程序包括：94℃15min；94℃20s，61-55℃1min 10个循环；94℃20s，55℃60s，30个循环。
39.本发明提供了一组鉴定玉米杂交种纯度的snp核心位点，包括玉米1号染色体第8974336位、1号染色体第289408285位、2号染色体第109563976位、2号染色体第186339948位、3号染色体第27775731位、3号染色体第118083714位、4号染色体第20077010位、4号染色体第128874466位、5号染色体第13402375位、5号染色体第204879476位、6号染色体第39822979位、6号染色体第141476300位、7号染色体第126677146位、7号染色体第15521714位、8号染色体第20978845位、8号染色体第118299376位、9号染色体第104695670位、9号染色体第127197714位、10号染色体第39960289位和10号染色体第109396730位。采用本发明提供的位点能够坚定玉米杂交种的纯度。
附图说明
40.图1为测试位点分型效果图(mg279)，a为ctab法分型效果，b为快提法分型效果；
41.图2为样品双亲互补基因型比率对比图，横坐标为按照20个位点双亲互补率从低到高的样品排序，纵坐标为样品双亲互补基因型比率；
42.图3为样品双亲互补基因型比率区间统计图，柱状图表示杂合率每增加10％区间的样品数。
具体实施方式
43.本发明提供了一组鉴定玉米杂交种纯度的snp核心位点，包括玉米1号染色体第8974336位、1号染色体第289408285位、2号染色体第109563976位、2号染色体第186339948位、3号染色体第27775731位、3号染色体第118083714位、4号染色体第20077010位、4号染色体第128874466位、5号染色体第13402375位、5号染色体第204879476位、6号染色体第39822979位、6号染色体第141476300位、7号染色体第126677146位、7号染色体第15521714位、8号染色体第20978845位、8号染色体第118299376位、9号染色体第104695670位、9号染色体第127197714位、10号染色体第39960289位和10号染色体第109396730位。
44.本发明还提供了一组扩增上述技术方案所述的snp核心位点的引物，所述引物的核苷酸序列如seq id no.1～60所示。
45.在本发明中，扩增玉米1号染色体第8974336位的核苷酸序列如seq id no.1～3所示；扩增玉米1号染色体第289408285位的核苷酸序列如seq id no.4～6所示；扩增玉米2号染色体第109563976位的核苷酸序列如seq id no.7～9所示；扩增玉米2号染色体第186339948位的核苷酸序列如seq id no.10～12所示；扩增玉米3号染色体第27775731位的核苷酸序列如seq id no.13～15所示；扩增玉米3号染色体第118083714位的核苷酸序列如seq id no.16～18所示；扩增玉米4号染色体第20077010位的核苷酸序列如seq id no.19～21所示；扩增玉米4号染色体第128874466位的核苷酸序列如seq id no.22～24所示；扩增玉米5号染色体第13402375位的核苷酸序列如seq id no.25～27所示；扩增玉米5号染色体第204879476位的核苷酸序列如seq id no.28～30所示；扩增玉米6号染色体第39822979位的核苷酸序列如seq id no.31～33所示；扩增玉米6号染色体第141476300位的核苷酸序列如seq id no.34～36所示；扩增玉米7号染色体第126677146位的核苷酸序列如seq id no.37～39所示；扩增玉米7号染色体第15521714位的核苷酸序列如seq id no.40～42所示；扩增玉米8号染色体第20978845位的核苷酸序列如seq id no.43～45所示；扩增玉米8
号染色体第118299376位的核苷酸序列如seq id no.46～48所示；扩增玉米9号染色体第104695670位的核苷酸序列如seq id no.49～51所示；扩增玉米9号染色体第127197714位的核苷酸序列如seq id no.52～54所示；扩增玉米10号染色体第39960289位的核苷酸序列如seq id no.55～57所示；扩增玉米10号染色体第109396730位的核苷酸序列如seq id no.58～60所示。
46.在本发明中，所述引物的核苷酸序列具体见表1。
47.表1玉米纯度鉴定snp核心位点表和引物序列
48.[0049][0050]
本发明优选在正向引物1的5’端连接fam荧光对应接头序列；在正向引物2的5’端连接hex荧光对应接头序列。
[0051]
本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的引物高通量鉴定玉米杂交种纯度的方法，包括以下步骤：
[0052]
1)提取玉米材料的dna，将所述dna利用上述技术方案所述的引物进行pcr；
[0053]
2)收集原始荧光信号后进行基因分型，将得到的分型结果导入snp数据库管理系统，去除双亲不互补和遗传不稳定的位点，统计至少两个位点的结果，计算玉米纯度。
[0054]
在本技术中，所述玉米优选包括玉米的籽粒、幼苗或叶片。本发明对所述提取玉米dna的方法没有特殊限定，采用常规提取植物dna的方法即可，在本发明具体实施方式中具体优选采用改良dna快速提取法提取。
[0055]
在本发明中，所述pcr的体系每1μl优选包括：20ng烘干的dna、0.5μl 2
×
kasp pcr预混液、0.486μl去离子水和0.014μl引物工作液。在本发明中，所述pcr的体系每3μl优选包括：1.45μl dna、1.5μl 2
×
kasp pcr预混液和0.05μl引物工作液。在本发明中，所述pcr的体系每10μl优选包括：1.5μldna、5μl 2
×
kasp pcr预混液、3.36μl去离子水和0.14μl引物工作液。在本发明中，所述引物工作液中上游引物的浓度优选为12μmol/l，下游引物的浓度优选为30μmol/l。在本发明中，所述pcr的程序优选包括：94℃15min；94℃20s，61-55℃1min 10个循环；94℃20s，55℃60s，30个循环。
[0056]
本发明优选使用pherastar荧光扫描仪采集原始荧光信号。本发明优选使用kraken(v16.3.16.16288)软件进行基因分型。本发明优选将分型结果导入snp数据库管理
系统(v1.0.0，软件登记号：2018sr043088)分析玉米纯度。
[0057]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0058]
实施例1
[0059]
玉米杂交种纯度鉴定核心引物的确定
[0060]
1.实验样品：供试材料12组三联体样品(表2)。
[0061]
表2玉米三联体样品信息表
[0062]
编号杂交种母本父本1先玉335ph6wcph4cv2郑单958郑58昌7-23农大108x178黄c4鲁单981齐319lx98015沈单16k12沈1376东单60a801丹5987丹玉39c8605-2丹5988中单2号mo17自3309掖单13掖478丹34010sc704b73mo1711京科糯2000京糯6白糯612农华101nh60s121
[0063]
2.核酸提取：三联体样品采用改良ctab法混株提取。匿名杂交种样品采用改良dna快提法(k-matedna提取试剂盒，lgc genomic)单株提取，向微孔板中加入100μl 1*提取液，95℃15min，4℃放置10min，加入100μl 1*缓冲液，1000rpm混匀1min，2500rpm离心30s静置，吸适量上清液，加入5倍去离子水制备为工作液备用。
[0064]
3.纯度侯选位点及引物设计：根据335份国家审定玉米杂交种标准样品384个snp位点的snp指纹数据统计各个位点的杂合率、最小等位基因频率(maf，minor allele frequency)、多态性信息含量(pic，polymorphic information content)等参数，挑选出在染色体上分布均匀，多态性好的60个位点作为纯度候选位点(表3)。将60个侯选位点设计合成kasp引物，在两条正向引物序列的5
′
端加上fam或hex荧光基团的接头序列，并按照上游引物12μmol/l，下游引物30μmol/l混合制备成引物工作液备用。
[0065]
表3玉米纯度鉴定snp候选位点信息表
[0066]
[0067]
[0068]
[0069][0070]
4.pcr反应体系：20ng烘干的dna，0.5μl 2
×
kasp pcr预混液(英国，lgc genomic，1536格式，标准含量rox)，0.486μl去离子水，0.014μl引物工作液。反应程序：94℃15min；94℃20s，61-55℃1min 10个循环；94℃20s，55℃60s，30个循环。
[0071]
5.荧光、数据采集及分析：利用pherastar荧光扫描仪采集原始荧光信号，kraken(v16.3.16.16288)软件进行基因分型，将分型结果导入snp数据库管理系统(v1.0.0，软件登记号：2018sr043088)分析样品纯度。使用snp比对统计工具软件(v1.0，软件登记号：2018sr026743)计算位点杂合率、maf、pic等参数。
[0072]
6.试验结果：基于玉米384snp基础位点组合，根据位点双亲互补区分能力、试验分型效果、染色均匀分布等条件筛选确定1套适于玉米杂交种纯度鉴定的核心位点组合。具体筛选过程为：(1)确定候选位点组合：基于335份国审品种基础位点的指纹数据计算位点双亲互补率、多态性等参数，筛选条件为位点双亲互补率高于40％，maf≥0.3，pic≥0.3，从而优选60个候选位点。(2)kasp引物评估：将候选位点设计合成kasp引物，使用12组玉米杂交种及其亲本三联体材料进行测试。其中57个引物都能分成紧密的三群，分型结果与预期结果一致，符合孟德尔遗传定律，并且试验重复结果一致(图1中的a)。(3)快速dna提取法评
估：为缩短dna制备时间，提高纯度鉴定的效率，进一步使用快提法对ctab法分型表现好的位点进行测试，共有48个位点使用ctab法和快提法均能清晰的分成三个紧密的分型，且与预期分型结果一致的位点(图1中的b)。(4)确定纯度鉴定核心位点：综合位点区分能力及染色体均匀分布等，筛选出20个位点作为纯度鉴定核心位点(表1)。
[0073]
实施例2
[0074]
snp核心位点区分能力验证
[0075]
1.实验样品：供试材料为335份1984-2013年国家审定玉米品种指纹数据(名单略)。
[0076]
2.核酸提取：采用改良ctab法(方法同实施例1)混株提取每95份样品至少放置一个空白对照。
[0077]
3.引物、反应体系及反应程序：同实施例1。
[0078]
4.荧光、数据采集及分析：同实施例1。
[0079]
5.试验结果：83.6％的样品双亲互补基因型比率在核心位点上高于基础位点(图2)。在335份杂交种样品中，99.7％样品的双亲互补基因型比率超过10％，多个双亲互补位点可供筛选用于纯度鉴定(图3)。综合各项参数说明，20个纯度鉴定核心位点均明显优于基础位点和候选位点，也证明这20个核心位点组合能够有效应用于目前国内市场绝大部分玉米杂交种进行纯度鉴定。
[0080]
实施例3
[0081]
利用玉米纯度核心位点对供试样品进行纯度鉴定
[0082]
1.实验样品：供试样品京科968种子若干，京科968亲本种子。
[0083]
2.核酸提取：采用改良dna快提法(k-mate dna提取试剂盒，lgc genomic)单株提取，制备成dna工作液备用。每93个单株中至少放置2份亲本dna及一个空白对照。
[0084]
3.引物、反应体系及反应程序：同实施例1。
[0085]
4.荧光、数据采集及分析：同实施例1。
[0086]
5.去除双亲不互补及遗传不稳定的位点，统计至少两个位点的结果，计算样品纯度。
[0087]
6.试验结果：供试样品在20个核心位点中有15个位点上都显示为双亲互补基因分型，从中选择mg072、mg135、mg175、mg215等四个位点进行纯度鉴定。在检测的110个个体中，共检出1个自交株，2个异型株，供试样品纯度为97.3％。根据国家标准规定，玉米单交种的纯度不低于96.0％，实验结果表明该供试样品纯度符合标准。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。