一种长果番茄材料的制备方法与流程

1.本发明属于农业生物技术领域，具涉及一种长果番茄材料的制备方法。


背景技术：

2.番茄是全球广泛种植的蔬菜和水果兼用类作物，深受消费者喜欢。番茄的果形是重要的经济性状。目前大部分鲜食番茄果实都是圆形，长果番茄比较少，长果番茄耐压且型状特别，是改良番茄果形的重要方向之一。
3.在技术上，番茄品种培育主要是利用传统的杂交、回交的手段来改良番茄果形，该法周期长，一般需要5-10年，且受连锁累赘等因素的限制。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种长果番茄材料的制备方法。
5.本发明提供了一种蛋白质，获自番茄，命名为slfs8.1蛋白，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
6.(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；
7.(a2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与番茄果形相关的由其衍生的蛋白质；
8.(a3)来源于番茄且与(a1)所限定的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且与番茄果形相关的蛋白质。
9.所述番茄果型为番茄的圆果形和/或长果形。
10.编码slfs8.1蛋白的基因，命名为slfs8.1基因，也属于本发明的保护范围。
11.slfs8.1基因具体为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
12.(b1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；
13.(b2)序列表中序列3所示的dna分子；
14.(b3)来源于番茄且与(b1)或(b2)至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且编码所述蛋白质的dna分子；
15.(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子。
16.所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，
0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6
×
ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2
×
ssc,0.1％sds和1
×
ssc,0.1％sds各洗膜一次；也可为：2
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1
×
sspe(或0.1
×
ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
17.含有slfs8.1基因的表达盒、重组载体或重组微生物均属于本发明的保护范围。
18.本发明还保护slfs8.1蛋白的应用，为如下(c1)或(c2)：
19.(c1)调控植物的果形；
20.(c2)调控番茄的果形。
21.所述番茄的果型为番茄的圆果形和/或长果形。
22.本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：对植物中slfs8.1基因进行基因编辑，从而得到长果形果实的植物。所述植物可为茄科植物。所述植物可为番茄属植物。所述植物为圆果形果实的植物。所述植物具体可为番茄品种ac。所述基因编辑具体借助cas9技术实现。sgrna中的靶序列结合区如序列表的序列4第2-21位核苷酸所示。sgrna具体如序列表中的序列4所示。
23.本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：抑制植物中slfs8.1基因的表达，从而得到长果形果实的植物。所述植物可为茄科植物。所述植物可为番茄属植物。所述植物为圆果形果实的植物。所述植物具体可为番茄品种ac。
24.本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：降低植物中slfs8.1蛋白的含量和/或活性，从而得到长果形果实的植物。所述植物可为茄科植物。所述植物可为番茄属植物。所述植物为圆果形果实的植物。所述植物具体可为番茄品种ac。
25.本发明还保护一种制备基因编辑植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中导入重组质粒，得到转基因植物，从转基因植物中筛选得到基因编辑植物；所述重组质粒中具有cas9蛋白的编码基因和sgrna的编码基因；所述sgrna的靶序列位于slfs8.1基因；所述基因编辑植物的果实形状为长果形。所述植物可为茄科植物。所述植物可为番茄属植物。所述植物为圆果形果实的植物。所述植物具体可为番茄品种ac。sgrna中的靶序列结合区如序列表的序列4第2-21位核苷酸所示。sgrna具体如序列表中的序列4所示。所述重组质粒具体可为在crispr/cas9载体的bsai酶切位点插入所述靶序列结合区的编码dna得到的。
26.本发明还保护一种制备基因编辑植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中导入表达sgrna基因的重组质粒和表达cas9基因的重组质粒，得到转基因植物，从转基因植物中筛选得到基因编辑植物；所述sgrna的靶序列位于slfs8.1基因；所述基因编辑植物的果实形状为长果形。所述植物可为茄科植物。所述植物可为番茄属植物。所述植物为圆果形果实的植物。所述植物具体可为番茄品种ac。sgrna中的靶序列结合区如序列表的序列4第2-21位核苷酸所示。sgrna具体如序列表中的序列4所示。
27.本发明利用crispr/cas9方法对圆果形番茄的slfs8.1基因进行基因编辑，得到了长果形番茄。本发明可以在1年以内得到一个果型改变的植物新品种，而利用传统育种手段需要连续回交、自交，至少需要3-4年时间，本发明的方法操作简单，成本低，大大加快了育种进程。本发明对于长果形番茄育种具有重要的应用推广价值。
附图说明
28.图1为供试植株果实的照片(右下角标线长度为1厘米)。
29.图2为供试植株果实的长宽比统计数据(星号代表利用t-test检验基因编辑植株果实长宽比与野生型存在显著性差异)。
具体实施方式
30.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
31.crispr/cas9载体：即文献“deng et al.,efficient generation of pink-fruited tomatoes using crispr/cas9 system,journal of genetics and genomics 45(2018)51-54”中的ptx041。
32.番茄品种ac，又称为番茄品种ailsa craig，也称为野生型番茄，来源于美国番茄遗传资源中心(tgrc，http://tgrc.ucdavis.edu/)，编号为la2838a。
33.从番茄中发现一个新蛋白，命名为slfs8.1蛋白，如序列表的序列1所示。番茄中，编码slfs8.1蛋白的基因命名为slfs8.1基因，cdna中的开放阅读框如序列表的序列2所示，基因组dna中起始密码子至终止密码子之间的部分如序列表的序列3所示(序列3中第1-392位和第502-1057位为外显子)。
34.将长宽比大于1的果实定义为长果。将长宽比小于等于1的果实定义为圆果。长宽比指的是长度与宽度的比值。长度指的是与果蒂部分垂直的果实最长直径。宽度指的是与果蒂部分平行的果实的最长直径。
35.实施例1、利用crispr/cas9方法编辑番茄slfs8.1基因获得长果番茄
36.一、重组载体的构建
37.1、分别制备两条单链dna分子，然后一起进行退火，得到两端具有粘末端的双链dna分子。
38.两条单链dna分子的核苷酸序列分别如下：
[0039]5’-
tttgagtagatcagtctcagacgg-3’；
[0040]5’-
aaacccgtctgagactgatctact-3’。
[0041]
2、取crispr/cas9载体，用限制性内切酶bsai进行酶切，回收载体骨架。
[0042]
3、将步骤1得到的两端具有粘末端的双链dna分子和步骤2得到的载体骨架连接，得到重组质粒。重组质粒已进行测序验证。该重组质粒表达序列表中序列4所示的sgrna。该sgrna中的靶序列结合区如序列表的序列4第2-21位核苷酸所示。
[0043]
二、基因编辑植株的制备
[0044]
1、取步骤一制备的重组质粒，导入农杆菌lba4404，得到重组农杆菌。
[0045]
2、取步骤1得到的重组农杆菌，通过农杆菌介导的方法对野生型番茄进行遗传转化,得到t0代植株。
[0046]
(1)取野生型番茄种子，挑选饱满、粒大的种子，用75％乙醇水溶液浸泡2min，然后用10％naclo水溶液浸泡10min，然后用无菌水冲洗7遍，然后将种子播种于种子生长培养基
并培养8天。取子叶，在无菌条件下将子叶切成小方块，将子叶块接种于预培养培养基并培养2天，得到的子叶块作为外植体。
[0047]
种子生长培养基：将2.2g ms盐、30g蔗糖和水混合，用水定容至1l，用1mol/l koh调ph至5.8～6.0之间，加入琼脂并使其浓度为0.8％，高压灭菌。
[0048]
预培养培养基：将4.4g ms盐、1.0mg玉米素(zeatin)和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1l，用1mol/l koh调ph至5.8～6.0之间，加入琼脂并使其浓度为0.8％，高压灭菌。
[0049]
(2)取步骤1得到得到重组农杆菌，用50ml液体ms培养基重悬，得到od
600nm
＝0.4的菌悬液，然后加入50μl 0.074mol/l乙酰丁香酮水溶液，即为侵染液。
[0050]
液体ms培养基：将4.4g ms盐、30g蔗糖和水混合，用水定容至1l，用1mol/l koh调ph至5.8～6.0之间，高压灭菌。
[0051]
(3)取步骤(1)得到的外植体，在步骤(2)得到的浸染液中浸没10min，然后接种至预培养培养基上培养2天。
[0052]
(4)完成步骤(3)后，取外植体，接种至筛选分化培养基培养8周(每2周继代一次)，此时外植体长出抗性芽。
[0053]
筛选分化培养基：将4.4g ms盐、2.0mg玉米素、50mg卡那霉素、100mg肌醇、0.5mg叶酸和20g蔗糖溶于水中，用水定容至1l，用1mol/l koh调ph至5.8～6.0之间，加入琼脂并使其浓度为0.8％，高压灭菌。
[0054]
(5)步骤(4)中抗性芽芽长为3cm时，切取抗性芽，转接至生根培养基进行培养，生根的植株即为t0代植株。
[0055]
生根培养基：将4.4g ms盐、50mg卡那霉素、0.5mg叶酸、0.5mg吲哚丁酸和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1l，用1mol/l koh调ph至5.8～6.0之间，加入琼脂并使其浓度为0.8％，高压灭菌。
[0056]
整个过程的培养条件：25℃、16h光照/8h黑暗。
[0057]
3、从t0代植株中筛选纯合突变的植株。
[0058]
筛选方法：取植株叶片的基因组dna，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物并进行测序。
[0059]
f1：5
′-
atgcaatcagattatgaaatgg-3
′
；
[0060]
r1：5
′-
gaggctgtgtacagtatcgctc-3
′
。
[0061]
筛选到2株发生纯合突变的植株(突变均位于slfs8.1基因中f1和r1组成的引物对的靶序列中)，分别命名为植株6和植株7。
[0062]
与野生型番茄相比，植株6中的“agtagatcagtctcagacggcgg”替换为了“agtagatcagcgg”，且为纯合型替换(即两条染色体发生了相同替换)。上述替换导致基因cds序列从第232位发生移码突变，提前产生终止密码子，翻译出丧失dna结合结构域的截短蛋白，以致slfs8.1蛋白质功能的丧失(植株中不含有slfs8.1蛋白)。
[0063]
与野生型番茄相比，植株7中的“agtagatcagtctcagacggcgg”替换为了“agtagatcagtctcagaacggcgg”，且为纯合型替换(即两条染色体发生了相同替换)。上述替换导致基因cds序列从第239位发生移码突变，提前产生终止密码子，翻译出丧失dna结合结构域的截短蛋白，以致slfs8.1蛋白质功能的丧失(植株中不含有slfs8.1蛋白)。
[0064]
4、正常培养植株6，自交获得种子，即为t1代种子，将t1代种子培育为植株，即为t1
代植株。正常培养植株7，自交获得种子，即为t1代种子，将t1代种子培育为植株，即为t1代植株。
[0065]
5、从t1代植株中筛选不含外源dna的植株。
[0066]
筛选方法：取植株叶片的基因组dna，采用f2和r2组成的引物对进行pcr扩增(f2和r2组成的引物对的靶序列位于crispr/cas9载体中的cas9基因，扩增产物预期为约402bp)，如果得到扩增产物说明植株中含有外源dna，如果没有得到扩增产物说明植株中不含外源dna。
[0067]
f2：5
′-
ttgacaagctgttcatccag-3
′
；
[0068]
r2：5
′-
ccttcgtaatctcggtgttc-3
′
。
[0069]
植株6得到的t1代植株群体中约1/4的个体不含外源dna。
[0070]
植株7得到的t1代植株群体中约1/4的个体不含外源dna。
[0071]
6、取步骤5筛选得到的植株，提取叶片的基因组dna，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物并进行测序。
[0072]
从植株6得到的t1代植株中筛选得到的不含外源dna的植株，slfs8.1基因均发生了与植株6相同的纯合型替换。从植株7得到的t1代植株中筛选得到的不含外源dna的植株，slfs8.1基因均发生了与植株7相同的纯合型替换。结果表明，将步骤一制备的重组质粒导入野生型番茄产生的突变能够从t0代稳定遗传到t1代。
[0073]
将从植株6得到的t1代植株中筛选得到的不含外源dna的植株均命名为6-slfs8.1基因编辑植株。将从植株7得到的t1代植株中筛选得到的不含外源dna的植株均命名为7-slfs8.1基因编辑植株。
[0074]
三、果实观察
[0075]
供试植株为：6-slfs8.1基因编辑植株、7-slfs8.1基因编辑植株、野生型番茄植株。
[0076]
1、25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养供试植株幼苗，直至植株长至4-5个叶片。
[0077]
2、完成步骤1后，将植株(每种供试植株10株，且长势一致)移栽到大棚中。株距、行距在60cm以上；供试植株随机分布；正常的水肥管理，保证所有植株水肥条件基本一致。
[0078]
移栽3个月后，植株开始进入结果期，结果期持续约6个月。整个结果期，收集成熟果实。
[0079]
6-slfs8.1基因编辑植株，平均每株植株在整个结果期收获的成熟果实数量为50，均为长果。
[0080]
7-slfs8.1基因编辑植株，平均每株植株在整个结果期收获的成熟果实数量为60，均为长果。
[0081]
野生型番茄，平均每株植株在整个结果期收获的成熟果实数量为56，均为圆果。
[0082]
部分果实的示例性结果见图1。
[0083]
每种供试植株的果实的长宽比(平均值)见图2。
[0084]
与野生型番茄植株的果实相比，slfs8.1基因编辑植株的果实由圆形转变成长形。
[0085]
以上结果表明，slfs8.1基因及其编码的蛋白质可以调控番茄的果形，通过对slfs8.1基因进行基因编辑可以使圆形番茄材料转变成长形番茄材料。
[0086]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和
范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。