经修饰的CrRNA片段及非洲猪瘟病毒试剂盒的制作方法

经修饰的crrna片段及非洲猪瘟病毒试剂盒
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种经修饰的crrna片段及非洲猪瘟病毒试剂盒。


背景技术：

2.非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus，asfv)引起的一种烈性、高度接触性动物传染病，猪一旦感染之后死亡率可达到100％，世界动物卫生组织(oie)将其列为必须报告的动物疫病，我国也将非洲猪瘟列为一类动物疫病。非洲猪瘟病毒基因组为双连闭合线性dna分子，大小约为170
–
194kb，含有150
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160个开放阅读框(orf)，总共编码54种结构蛋白和100多种非结构蛋白。非洲猪瘟病毒基因组主要由末端的发卡环结构、中间部分是比较稳定的基因区和由串联重复序列和多基因家族构成的可变区三部分组成，其中可变区基因拷贝数的变化是造成基因组大小不等的主要因素。根据编码主要衣壳p72(b646l)基因末端约500bp核苷酸的差异已鉴定出24种基因型，但是基因型不能反映出病毒血清学特性，也不能反映毒株的免疫学特。利用pcr技术对不同病毒基因型进行遗传演化分析发现，西非地区流行的主要是基因ⅰ型，东非和南非则有20多种基因型。基因ii型流行于非洲东南部，2007年传至格鲁吉亚、俄罗斯和东欧地区；2017年该基因型病毒传播至俄罗斯伊尔库茨克地区。目前我国流行的毒株为基因ii型，与俄罗斯及东欧流行的毒株属同一分支。
3.由于目前世界上还没有研发出有效的针对非洲猪瘟病毒的疫苗，为防止疾病传播疫点内的生猪只能被全部扑杀和无害化处理，给养殖业带来巨大经济损失。因此，在当前严峻的防控形势下研发简便、快速、精确的非洲猪瘟病毒现场检测技术就显得非常迫切。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种经修饰的crrna片段及非洲猪瘟病毒试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
5.本发明的第一目的在于提供一种经修饰的crrna片段。在crrna片段的3’端具有长度为5~10bp的dna修饰片段。增加了dna修饰片段后的crrna片段在crispr/dx检测体系中能够进一步提高反应速率，从而缩短检测时间。
6.进一步，所述dna修饰片段的长度为7bp。具体地，所述dna修饰片段为5
’‑
tcccccc-3’或者5
’‑
tattatt-3’。在crrna片段的3’端增加上述修饰片段后，使用该经修饰的crrna片段的crispr/dx检测体系后期切割效率相较于使用未添加修饰的crrna片段有所提高。
7.进一步，所述经修饰的crrna片段如表1所示的任意一条：表1crispr/dx检测体系中经过dna修饰的crrna
8.本发明的第二目的在于提供一种检测体系，所述检测体系包括前述的经过dna修饰片段后的crrna片段。改进后的检测体系的检测效率获得了提高。
9.进一步，所述检测体系同时使用两段所述经修饰的crrna片段，包括第一crrna片段和第二crrna片段，所述第一crrna片段的序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4所示，所述第二crrna片段的序列如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7或seqidno.8所示。使用两段经修饰的crrna片段的检测体系是通过双靶点进行配对，能够进一步加快反应速率，提升检测效率。
10.进一步，所述检测体系还包括上游引物和下游引物。所述上游引物和下游引物如表2所示：表2rpa扩增体系引物
11.本发明的第三目的在于提供一种试剂盒。所述试剂盒包括前述的检测体系。
12.进一步，所述检测体系还包括rpa扩增体系及crispr/dx检测体系所需的试剂，如buffera、bufferb、crispr-cas12a蛋白酶、荧光淬灭探针、氯化镁、buffer或rna酶抑制剂等。
13.进一步，所述crispr/dx检测体系的反应温度为47℃。现有的crispr/dx检测体系反应温度一般在37℃或45℃，但本发明所提供的crispr/dx检测体系在47℃的反应条件下能显著提高反应速率。
14.进一步，所述crispr/dx检测体系的镁离子浓度为17.5mm。现有的crispr/dx检测体系所使用的镁离子浓度为15mm即可达到最快反应速率。出人意料地，本发明所提供的crispr/dx检测体系在镁离子浓度为17.5mm的反应条件下能显著提高反应速率，具有远优于使用镁离子浓度为15mm的检测效果。
15.进一步，所述rpa扩增体系采用10μl的反应体系，具体如下：
buffera5.9μl；primermix0.8μl(表2中任意一对上游引物及下游引物)；water0-0.8μl；dna样品2-2.8μl；bufferb0.5μl；再将所述rpa扩增体系与20μl的crispr/dx检测体系进行混合，于47℃下反应，根据荧光强度，可以检测非洲猪瘟病毒核酸。并且该反应体系，可检测的最低极限值为500copy/ml。
16.进一步，本发明所述检测体系对于核酸样品的纯度要求较低，有助于减少提取样品核酸的质量门槛，从而进一步缩短整个检测时间。使用免核酸提取试剂盒粗处理的样品（处理过程5分钟）也能利用本发明技术提供的检测体系进行检测，得到准确的荧光信号。
17.本发明包括以下有益效果：本发明的一种基于crispr技术的非洲猪瘟病毒快速检测体系。采用特定的引物组以crispr技术检测非洲猪瘟病毒，缩短了检测时间，可在20min内完成检测。并且，本发明通过筛选得到了特定的序列组合作为引物组进行检测，同时对检测条件进行了筛选，通过该引物组合条件检测非洲猪瘟病毒，具有灵敏性高、特异性强的优势，其检测限可以达500copies/ml，符合临床检测要求。
18.出乎意料地，发明人发现在crrna的3’端连接一段寡核苷酸片段可以显著提高crispr/dx检测体系的检测效率。特别能够提高lbcas12a蛋白的切割效率，并可以提高靶点特异性。独特的双靶配合，将两个针对不同靶点的crrna配合在一个反应体系当中，并且结合本发明所用的反应体系，将镁离子浓度升高到17.5mm,反应温度设定为47℃，可显著提高整体反应速率，保证了检测时间在20分钟内完成。
19.本发明包含的rpa扩增反应体系缩减为10μl，在保证检测极限值及缩短检测时间的同时，可降低检测成本。
20.为进一步缩短检测时间，采用核酸面提取试剂盒，处理样品（总处理过程只需5分钟），再利用上述的检测体系检测，将核酸提取以及检测的总时间降低到25分钟。
附图说明
21.图1是实施例1中筛选向导序列长度的检测结果图；图2是实施例2中筛选dna修饰序列的检测结果图；图3是实施例2中验证dna修饰序列对不同向导序列长度的提高效果检测图；图4是实施例3中crispr/dx检测体系优化镁离子浓度的柱状图；图5是实施例3中crispr/dx检测体系优化反应温度的柱状图；图6是实施例3中crispr/dx检测体系优化靶点配对以及配对浓度的柱状图；图7是实施例4中浓度分别为140copy/μl、14copy/μl和1.4copy/μl的样品使用ccmfd“一锅法”的检测结果；图8是实施例4中浓度为0.5copy/μl的样品使用ccmfd“一锅法”的检测结果；图9是实施例4中替换了crrna（t5-20-at与t8-23-at）后，使用浓度分别为140copy/μl和1.4copy/μl的样品使用ccmfd“一锅法”的检测结果；图10是实施例4中血样使用ccmfd“一锅法”的检测结果；图11是实施例5中免提取试剂配合ccmfd检测5份含有asfv的血液样本的曲线图。
具体实施方式
22.下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1、构建用于检测asfv的crrna以asfv的p72基因的t5位点和t8位点为检测目标，分别设计长度为23bp、20bp、17bp的向导序列，将向导序列与针对cas12a蛋白的锚定序列组合成crrna，以求获得较优的切割效率及降低脱靶率。构建的crrna如表3所示：表3供测试的crrna序列。
24.构建用于检测asfv的crispr/dx检测体系（20μl），包括：lbcas12a(1μm)1μl；crrna(1μm)2μl；probe(10μm)1μl；rnaseinhibitor1μl；buffer22μl；plasmid1μl(7
×
109copy/μl)；water10μl；mgcl22μl(17.5mm)；反应温度47℃，反应时长20分钟。所述荧光报告分子（probe）的序列为5
’‑
fam-cccccc-bhq1-3’。
25.根据表3分别合成不同长度的crrna序列用以组成不同的crispr/dx检测体系，其检测结果如图1所示，图中黑柱代表含有针对t5位点的向导序列，白柱代表含有针对t8位点的向导序列。无论哪个位点使用向导序列长度为17bp的crrna均无法获得良好的反应速率。从图中可以看出，t5位点使用向导序列长度为20bp的crrna为最优选择，对应的crrna序列命名为t5-20（seqidno.18）；t8位点使用向导序列长度为23bp的crrna为最优选择，对应的crrna序列命名为t8-23（seqidno.22）。
26.实施例2、crrna-dna结构优化设计（2-1）选定asfv的p72基因的t5位点，验证在crispr/dx检测体系中crrna的3’端添加dna修饰片段对切割效率的影响。构建检测体系：lbcas12a(1μm)1μl；crrna(1μm)2μl；probe(10μm)1μl；rnaseinhibitor1μl；buffer22μl；plasmid0.5μl(7
×
109copy/ul)；water10.5μl；mgcl22μl(17.5mm)；反应温度47℃，反应时长20分钟。crrna以靶向t5位点的rna序列为基础，以t5-20作为1号crrna，2号crrna至8号crrna序列为分别是t5-20的3’端修饰有5
’‑
tattatt-3’、5
’‑
aaataaa-3’、5
’‑
tttattt-3’、5
’‑
tcccgcc-3’、5
’‑
tgggggg-3’、5
’‑
tgggcggg-3’或5
’‑
tcccccc-3’的dna序列。
27.各检测体系样本的检测结果如图2所示，在同样的阳性质粒检测中，相较于基础的t5-20，使用了2号crrna及8号crrna的检测体系样本的检测到了较高的相对荧光单位（rfu）。
28.（2-2）在初步判定5
’‑
tattatt-3’与5
’‑
tcccccc-3’的dna修饰片段能够起到提升
crrna的切割效率后，为进一步验证其是否具有通用性，将t5-20与t8-23作为种子序列，分别添加上述dna修饰片段验证其切割效率。使用与前述（2-1）相同的检测体系进行测试。t5-20添加5
’‑
tattatt-3’dna修饰片段后命名为t5-20-at（seqidno.1）；t5-20添加5
’‑
tcccccc-3’dna修饰片段后命名为t5-20-6c（seqidno.3）；t8-23添加5
’‑
tattatt-3’dna修饰片段后命名为t8-23-at（seqidno.6）；t8-23添加5
’‑
tcccccc-3’dna修饰片段后命名为t8-23-6c（seqidno.8）。
29.检测结果如图3所示，图中黑柱代表针对t5位点的序列，白柱代表针对t8位点的序列。使用t5-20-at和t5-20-6c的crispr/dx检测体系所检测到的rfu均高于使用t5-20的crispr/dx检测体系，在t8-23-at和t8-23-6c的检测体系中也出现了相同的效果。所以可以判断在crrna的3’端添加特定的dna修饰片段确实能够起到提升crrna的切割效率的效果。
30.实施例3、crispr/dx检测体系的条件优化crispr/dx检测体系的反应速率还与多个反应条件相关，包括镁离子浓度、反应温度、靶点配对等因素，因此可以通过多方面条件的调整以获得更高的反应速率。以实施例2中（2-1）的crispr/dx检测体系为基准，所用的crrna为t8-23，分别优化其镁离子浓度、反应温度以及靶点的选择。
31.（3-1）镁离子浓度的优化。
32.分别配制浓度为17.5mm、16.4mm、15mm、13mm、10mm的氯化镁溶液，用于crispr/dx检测体系检测相同的asfv阳性质粒，反应温度定为crispr/dx检测体系常用的37℃。检测结果如图4所示，镁离子浓度为17.5mm的检测体系的rfu数据最优。
33.（3-2）反应温度的优化。
34.使用与前述（3-1）相同的检测体系进行测试。各检测体系的反应温度分别定为49℃、47℃、45℃、37℃。检测结果如图5所示，反应温度为47℃的检测体系的rfu数据最优。
35.（3-3）双靶点对反应速度的影响。
36.为验证检测单一靶点与双靶点的切割效率差异，以及crrna浓度对切割效率的影响，因此分别制备4组crrna样本：2μl的t5-23（seqidno.19）（于图6中标记为“t5”）；2μl的t8-23（于图6中标记为“t8”）；t5-23和t8-23各2μl（于图6中标记为“t5/t8（2）”）；t5-23和t8-23各1μl（于图6中标记为“t5/t8（1）”）。
37.构建检测体系：lbcas12a(1μm)1μl；probe(10μm)1μl；rnaseinhibitor1μl；buffer22μl；plasmid0.5μl(7
×
109copy/ul)；water10.5μl；mgcl22μl(17.5mm)；反应温度47℃，反应时长20分钟。
38.检测结果如图6所示，标记为“t5/t8（1）”的检测体系测得3.5
×
104以上的rfu，远高于其余组别。因此证明crispr/dx检测体系采用双靶点能够有效提高其检测速度。
39.实施例4、ccmfd（crispr/dx-crrnamutantfluorescencedetect）检测asfv将rpa扩增体系（安普未来rpa扩增试剂盒（dna））与实施例3优化后所得的crispr/dx检测体系结合，形成ccmfd，可以20分钟内可完成检测。最低检测浓度可达0.5copy/ul，耗时17.5分钟。当样品的核酸浓度为140copy/ul时，只需要7分钟左右，即可检测出信号。
40.（4-1）rpa扩增体系（10μl），包括：buffera5.9μl；primermix0.8μl(seqidno.9/seqidno.13)；water0-0.8μl；dna样品2-2.8μl；bufferb0.5μl；室温条件下反应。
41.crispr/dx检测体系（20μl），包括：lbcas12a(1μm)1μl；crrna(1μm)1μl 1μl(t5-20-6c与t8-23-6c)；probe(10μm)1μl；mgcl22μl（17.5mm）；rnaseinhibitor0.5μl；buffer22μl；water11.5μl；反应温度47℃。
42.图7分别是浓度分别为140copy/μl、14copy/μl、1.4copy/μl的标准品使用ccmfd“一锅法”的检测结果。图8是浓度为0.5copy/μl的标准品使用ccmfd“一锅法”的检测结果。将10μl的rpa扩增体系与20μl的crispr/dx检测体系混合，47℃孵育20分钟。由图8可知，本检测技术的检测下限能够达到浓度为0.5copy/μl的样品。
43.（4-2）使用与前述（4-1）相同的ccmfd试剂盒进行asfv临床血样检测。检测结果见图10，图中t1、t7分别为不同样本，已知t1为asfv弱阳性样品，t7为asfv强阳性样品。结果如图10所示，单独样本及混合样本均能在20分钟内获得正确的检测结果。
44.（4-3）使用与前述（4-1）相同的ccmfd试剂盒并将crrna替换成t5-20-at与t8-23-at试验检测效果。检测结果如图9所示，当标准品的浓度为140copy/ul时，可检测阳性结果；当标准品的浓度为1.4copy/ul时，可显示弱阳性。
45.实施例5、免提取试剂配合ccmfd检测asfv利用核酸免提取试剂盒（济凡生物核酸面提取系统）检验实施例4所述ccmfd技术与免提取核酸技术的匹配程度。
46.取20μl含有asfv的血液样本，加入100μl样品裂解液b1，振荡混匀后室温放置5分钟后，加入100μl样品裂解液b2，振荡混匀后在10000rpm下离心2分钟。取100μl上清液放于新的离心管中作为检测样本。结果如图11所示，5份阳性血清样本均在20分钟内，获得阳性信号。
47.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。