一种用于动脉粥样硬化治疗的大分子前药纳米载体及其制备方法与流程

1.本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种用于动脉粥样硬化治疗的大分子前药纳米载体及其制备方法。


背景技术：

2.炎性作为早期动脉硬化病变形成以及发展的关键因素，在近年来被广泛研究，用以实现对动脉粥样硬化的有效抑制。一般来说，皮质类固醇、糖皮质激素和非甾体类抗炎药物是治疗炎症的常用药物。然而，这些药物的副作用也令人担忧，如骨质疏松、胃肠道出血、慢性肾脏疾病等。为了降低不良反应，提高治疗效果，近年来科研工作者们开发了各种纳米药物载体用于药物的高效递送。
3.纳米载体已被证实可在动脉粥样硬化病灶处选择性富集，破损的血管内皮可以为纳米载体提供天然的富集途径。而考虑到药物的准确释放和治疗，在纳米载体的开发中，如何有效避免药物泄漏，以及当纳米载体富集在病灶处，又如何高效释放药物，成为另一个不可忽视的问题。在纳米载体的设计过程中，可以通过化学键将药物接枝到聚合物骨架上，构成大分子前药以减少药物泄漏。同时，伴随着动脉粥样硬化的炎症过程，科研工作者在病灶组织处特异性地发现了过度表达的活性氧(ros)，这为炎症治疗提供了一个准确高效给药的靶点。因此，在纳米载体中引入一系列具有ros响应性结构，可实现抗炎药物在动脉粥样硬化组织处的准确高效释放。
4.因此，开发用于动脉粥样硬化治疗的基于大分子聚合物前药的纳米载体有着非常重要的临床意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于动脉粥样硬化治疗的大分子前药纳米载体及其制备方法，该纳米载体由具有ros响应性的大分子聚合物前药组装形成。在通过静脉注射进入到血流运输过程中，该载体的前要结构保证了最低限度的药物泄漏。在被动富集至动脉粥样硬化组织后，在病变组织的炎症环境中所过度表达的ros影响下，纳米载体解体，伴随着抗炎药物与聚合物骨架的分离并发挥抗炎介导的抗动脉硬化作用。
6.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
7.一种用于动脉粥样硬化诊疗治疗的大分子前药纳米载体，包括基于甾体抗炎药物的大分子聚合物前药，
8.优选地，所述基于甾体抗炎药物的大分子聚合物前药，其化学结构式为：
[0009][0010]
其中，r为带有羟基的甾体抗炎药物，x、y、z为三种聚合单元的聚合度。
[0011]
纳米载体由基于甾体抗炎药物的大分子聚合物前药自组装而成，抗炎药物通过二羰基键连接到聚合物骨架上。制备得到的前药纳米载体具有活性氧响应性，而且二羰基键可敏感性断裂，释放的甾体抗炎药物可发挥高效的抗炎特性。此外，聚合物骨架中含有甲硫基团相关结构，可实现对药物的严密封装同时，响应活性氧并发生疏水至亲水的性质转换，从而辅助释放药物，良好的封装能力，较低的药物泄漏以及优异的活性氧响应性药物释放能力使该大分子前药纳米载体对动脉粥样硬化具有良好的治疗效果。
[0012]
优选地，所述甾体抗炎药物为带有羟基的抗炎药物包括：泼尼松龙、可的松、曲安西龙、地塞米松或倍他米松。
[0013]
优选地，所述大分子聚合物前药的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
(1)将甲基丙烯酸羟乙酯溶解后加入至草酰氯溶液中，室温搅拌10～15h后，除去草酰氯和溶剂；然后加入溶解后的抗炎药物和三乙胺，室温反应20～30h后，纯化，得药物单体；其中，所述抗炎药物、草酰氯、三乙胺和甲基丙烯酸羟乙酯的摩尔比为1～10:3～30:3～30:1～10；
[0015]
(2)将步骤(1)所得药物单体、甲硫乙基丙烯酸酯、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和偶氮二异丁腈加入装有四氢呋喃的schlenk烧瓶中；经过三个循环的冷冻-泵送-解冻程序后，在70℃的氩气保护下进行反应，反应时间为24小时；对所得溶液在离子水中(mcwo＝2000)透析24小时，然后冷冻干燥得到聚甲硫乙基丙烯酸酯；其中，药物单体，甲硫乙基丙烯酸酯，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和偶氮二异丁腈的质量比为2000-4000：2000-4000：100-200：25-50；
[0016]
(3)将步骤(2)所得物与甲基丙烯酰磷酸胆碱溶解于四氢呋喃中，然后加入偶氮二异丁腈，冻抽除氧后于70℃下反应24-28h，接着透析，最后冻干；其中，步骤(2)所得物、甲基丙烯酰磷酸胆碱和偶氮二异丁腈的质量比为1500-3000：3000-6000：12-25。
[0017]
本发明还提供了一种对上述的用于动脉粥样硬化治疗的大分子前药纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
[0018]
(1)将大分子聚合物前药溶于甲醇和二甲基亚砜混合的混合溶剂中，搅拌得混合溶液；
[0019]
(2)将混合溶液加入2-20倍混合溶液体积的生理盐水或超纯水中，搅拌1-4h，最后透析除去有机溶剂，制得。
[0020]
或将大分子聚合物前药溶于甲醇和四氢呋喃，然后旋转蒸发除去有机溶剂，再加入生理盐水或超纯水，充分振荡水化，制得。
[0021]
优选地，甲醇和二甲基亚砜的体积比为1～2:1～2，搅拌时间为2h。
[0022]
优选地，旋转蒸发温度为40～60℃，蒸发时间为0.5～2h。
[0023]
本发明的有益效果为：
[0024]
(1)本发明制备得到的纳米载体中的甲硫乙基丙烯酸酯聚合单元可在活性氧条件下发生疏水至亲水的性能转换，使纳米载体变松散，利于药物的快速释放。
[0025]
(2)纳米载体中的二羰基键可在活性氧条件下发生敏感性断裂，快速高效地释放出抗炎药物，对动脉粥样硬化具有良好的治疗效果。
[0026]
(3)本发明制备得到的纳米载体在体外细胞水平和体内动物水平上，与自由药物对比，在药效、生物安全性以及稳定性均有明显提高，可以实现高效、低毒、低泄漏的药物递送。
[0027]
(4)本发明提供的载药胶束在动脉粥样硬化组织中具有优异的炎症治疗效果。
附图说明
[0028]
图1为基于泼尼松龙构建的大分子聚合物前药的核磁共振氢谱图谱；
[0029]
图2为纳米载体的粒径分布图和透射电镜图；
[0030]
图3为在pbs中以及活性氧条件下纳米载体的粒径变化图；
[0031]
图4为纳米载体在不同条件下的体外药物释放结果图；
[0032]
图5为纳米载体对巨噬细胞的炎症因子抑制结果图；
[0033]
图6为纳米载体对体外泡沫细胞形成的抑制结果图；
[0034]
图7为动物试验中纳米载体对动脉粥样硬化成像及治疗的结果图。
具体实施方式
[0035]
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
[0036]
实施例1
[0037]
一种用于动脉粥样硬化诊疗治疗的大分子前药纳米载体，该纳米载体通过大分子聚合物前药的自组装构成。其中，抗炎药物通过二羰基键将其连接到聚合物骨架上。
[0038]
上述用于大分子聚合物前药的制备方法如下：
[0039]
(1)将甲基丙烯酸羟乙酯(0.25ml，2.0mmol)溶解，再滴加到草酰氯(0.032ml)溶液中。在室温下搅拌12小时后，在减压下去除多余的草酰氯和溶剂。将药物(0.36g)和三乙胺(0.11ml)溶解，加入。室温下反应24h后，用色谱纯化，得到药物单体。
[0040]
(2)将步骤(1)所得药物单体(0.22g，0.4mmol)、甲硫乙基丙烯酸酯(0.24g，1.5mmol)、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯(28.0mg，0.1mmol)和偶氮二异丁腈(3.3mg，0.02mmol)溶解于四氢呋喃并加入到schlenk烧瓶中。经过三个周期的冷冻-抽气-融化过程，在ar气体的保护下，70℃下反应24小时，将所得溶液在去离子水中(mcwo＝1000)透析24
小时，冷冻干燥。
[0041]
(3)将步骤(2)所得物(0.23g)、甲基丙烯酰磷酸胆碱(0.45g，1.5mmol)和偶氮二异丁腈(1.65mg，0.01mmol)溶于四氢呋喃和甲醇中。经过三个周期的冷冻-抽气-融化过程，在ar保护下，70℃中反应24小时，然后在去离子水中透析24小时并冷冻干燥，得到大分子聚合物前药。
[0042]
上述制得的大分子聚合物前药的核磁共振氢谱图谱见图1，由其出峰位置以及积分比例可知大分子聚合物前药成功合成
[0043]
实施例2
[0044]
一种对用于动脉粥样硬化诊疗治疗的大分子前药纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
[0045]
称取实施例1所得化合物(0.16g)溶解于1ml二甲基亚砜和1ml甲醇的混合溶液中并滴加到10ml去离子水中，搅拌4小时并在去离子水中透析24小时，制得纳米载体溶液。
[0046]
纳米载体粒径图及透射电镜图见图2，图2中a为透射电镜图，b为纳米载体径图；由图可知此类大分子聚合物前药可自组装形成具有纳米尺寸的均一颗粒，推测其为具有核-壳结构的纳米胶束。
[0047]
试验例1纳米载体的稳定性和敏感性的研究
[0048]
将实施例2制得的胶束置于37℃，过氧化氢浓度为0.1mm的条件下，每隔一段时间用动态光散射仪dls测定其粒径变化，粒径变化结果见图3a。此外，观察纳米载体在pbs中的长时间稳定性，结果如图3b。
[0049]
由图3可知，本发明制得的纳米载体在无过氧化氢条件下在30天内表现出很好的稳定性，而在过氧化氢条件下可迅速膨胀，均一性变差，表明其发生解体。
[0050]
试验例2胶束体外药物释放行为
[0051]
将实施例2制得的纳米载体制成浓度为1mg/ml的溶液，然后取2ml转移到截留分子量为3500的透析袋中，将透析袋密封后置于100ml pbs或0.1mm过氧化氢溶液中，于37℃避光条件下持续震荡，在固定时间内取出2ml，用高效液相色谱仪测药物释放量，其结果如图4所示。
[0052]
由图4可知，纳米载体在无活性氧条件下具有极少的药物泄漏，而在活性氧环境下会实现药物的高效释放。
[0053]
试验例3胶束对巨噬细胞的抗炎作用
[0054]
将实施例2制得的纳米载体，或自由药物与被脂多糖激活的巨噬细胞共培养48h，取上清液检测炎性分子(tnf-α，il-1β)的含量。
[0055]
由图5可知，与自由药物相比，本发明制得的纳米载体能够实现细胞层面的高效抗炎。
[0056]
试验例4胶束对泡沫细胞形成的抑制作用
[0057]
将实施例2制得的纳米载体，或自由药物与被脂多糖激活并加入氧化低密度脂蛋白的巨噬细胞共培养24h，对细胞进行油红o染色并用光学显微镜观察。
[0058]
由图6可知，与自由药物相比，本发明制得的纳米载体能够实现对泡沫细胞形成的有效抑制作用。
[0059]
试验例5动物试验验证胶束对动脉粥样硬化组织的成像能力及治疗效果
[0060]
将已知载药量的纳米载体冷冻干燥，再用生理盐水复溶，配置成一定浓度的储存液，并配置相同药物浓度的自由药物储存液。建立动脉粥样硬化小鼠模型。由尾静脉分别注射自由药物、纳米载体或等体积的生理盐水。药物的药量为10mg/kg老鼠。给药后分离小鼠主动脉，做切片并进行油红o染色，检测各项炎症指标，实验结果见图7。
[0061]
由图7可知，与自由药物相比，纳米载体具有更好的抑制动脉粥样硬化形成效果(图7a和图7b)，斑块处的炎症因子表达也显著减少(图7c和图7d)。