一种纯化九肽-1的方法与流程

1.本发明属于多肽纯化技术领域，具体涉及一种纯化九肽-1的方法。


背景技术：

2.九肽-1是一种含有九个氨基酸的小分子亮肤活性肽，是一种天然α-msh的仿生肽，能够竞争性抑制a-msh与受体mci-r的结合，防止酪氨酸酶的进一步激活，从而阻断黑色素的生成，减少皮肤变黑以及防止褐斑产生。九肽-1近年来已经成为一种极为受欢迎的化妆品原料，常添加于亮肤霜、亮肤粉底、粉饼和祛斑霜中。
3.九肽-1做为化妆品原料时必须满足色谱纯度≥99％，但由于九肽-1合成过程中往往存在各种副反应以及保护剂脱除不完全，这些因素导致九肽-1粗品中含有多种分子量和性质的杂质肽，故需要对其进行分离纯化后才可以添加到化妆品中。常用的多肽分离纯化方法包括：盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析超滤法、吸附层析法、等电点沉淀法、酶解法等。传统纯化九肽-1的方法成本高、纯化效率低，得到的九肽-1纯度低。为提高九肽-1的纯度，增大纯化效率，降低成本，广大研究学者对九肽-1的纯化进行了改进研究，如专利cn106749526a公开了一种低成本纯化九肽-1的方法，其是采用高效液相色谱，先用反相聚合物柱对大批量的九肽-1粗品进行纯化，除去九肽-1粗品中的杂质，再用弱阴离子交换柱将三氟乙酸型九肽-1转化成醋酸型九肽-1，所得九肽-1的纯度大于99％，生产成本得到了降低，但其收率仅为79%，因此，仍有必要提供一种收率高、纯度高的纯化九肽-1的方法。


技术实现要素：

4.为解决现有技术存在的问题，本发明首先提供了一种改性硅胶色谱填料，该填料为球形且粒径均一，无团聚现象，耐酸、耐碱性能优异，利用该填料对九肽-1进行纯化，成本低，所得九肽-1的纯度和收率高。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种改性硅胶色谱填料，所述改性硅胶色谱填料具有如下结构：接枝有改性硅烷偶联剂的硅胶微球；以及形成于硅胶微球表面的亲水性环氧树脂包覆层；其中，所述改性硅烷偶联剂为2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺改性硅烷偶联剂。
6.具体地，所述改性硅胶色谱填料的平均孔径为6～10 nm，比表面积为230～290 m2/g。
7.具体地，所述改性硅烷偶联剂经由下述方法制备得到：将乙烯基三乙氧基硅烷、2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺混合，在28～35℃下搅拌反应1～4 h，减压蒸馏即得。
8.所述乙烯基三乙氧基硅烷、2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺的添加质量比为1∶1～2.5。
9.硅胶色谱填料的机械张度好，在长期高压操作下不变形，柱寿命长，但表面含丰富
的高反应活性硅羟基，在碱性条件下不稳定，分离碱性化合物时，会使碱性化合物保留增加、峰展宽和拖尾，硅胶填料基质塌陷减少寿命；本发明通过在硅胶表面键合接枝改性硅烷偶联剂和高亲水性环氧树脂，将硅胶保护起来，耐酸、耐碱性能提升。
10.上述所述改性硅胶色谱填料的制备方法，包括下述步骤：1）用酸性溶液对硅胶微球进行表面活化，得到表面活化硅胶微球；2）将改性硅烷偶联剂键合接枝在表面活化硅胶微球表面，得到硅烷偶联剂键合硅胶微球；3）在硅烷偶联剂键合硅胶微球的表面引入亲水性环氧树脂，形成包覆层，获得改性硅胶色谱填料。
11.本发明通过上述方法，硅胶表面的硅羟基与硅烷偶联剂反应，将含酚羟基的硅烷偶联剂键合固定到硅胶微球表面，然后将高亲水性环氧树脂键合接枝到硅胶微球表面，在硅胶微球表面形成一层高亲水层，所得改性硅胶色谱填料具有合适的孔体积，比表面积高，硅胶表面的硅羟基被保护起来，碱液不易侵蚀硅胶使其键合相流失，耐碱性能大大提升，使用寿命延长，且耐酸性也得到提升，可能是因为表面的改性硅烷偶联剂、环氧树脂中含有苯环等基团，立体效应阻碍了硅胶的键合相在低ph下的水解，从而提高了硅胶色谱填料在酸性条件下的稳定性；此外，所得改性硅胶色谱填料的内层为疏水层，其足够大的电荷排斥作用力和疏水性，使其具有良好的分离效果，有助于非目标物质的洗脱，从而提高多肽的分离效率和纯度，外层为亲水性，能够阻止蛋白质等的吸附，使得水溶性聚合物、蛋白、生物酶、多肽等生物大分子的非特异性吸附减小，增加使用寿命；将该改性硅胶色谱填料用于分离纯化九肽-1，减少了封尾反应过程中的位阻效应，色谱峰形对称性好，柱效和分离度提升。
12.具体地，所述步骤1）中的酸性溶液为含有5～15 wt%盐酸、0.5～1 wt%甲基磺酸的混合水溶液。
13.具体地，所述步骤1）的具体操作为：将硅胶微球加入到酸性溶液中，30～50℃下搅拌0.5～5 h，抽滤，水洗至中性，80～100℃下真空干燥，得到表面活化硅胶微球。
14.具体地，所述步骤2）中表面活化硅胶微球、改性硅烷偶联剂的质量比为1∶1.8～3。
15.具体地，所述步骤2）的具体操作为：氮气保护下，将表面活化硅胶微球、改性硅烷偶联剂加入到甲苯中，70～100℃下搅拌反应0.5～6 h，反应结束后过滤，滤渣用甲苯、丙酮、甲醇洗涤，洗涤后用丙酮抽提，水洗，60～80℃下真空干燥，得到硅烷偶联剂键合硅胶微球。
16.本发明通过上述方法，在活化硅胶微球表面键合接枝2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺改性后的乙烯基三乙氧基硅烷，在活化硅胶微球表面形成一层均匀的有机薄层，能够阻止碱液与硅胶微球表面的硅羟基反应，耐酸性和耐碱性得到提高，增加了使用寿命，将其用于分离纯化九肽-1，可提高九肽-1的分离纯化效果。
17.具体地，所述步骤3）中亲水性环氧树脂由双酚a聚醚多元醇、环氧氯丙烷反应制得，所述双酚a聚醚多元醇为beo-6，双酚a聚醚多元醇、环氧氯丙烷的摩尔比为1∶0.8～1.2。
18.具体地，所述步骤3）中硅烷偶联剂键合硅胶微球、亲水性环氧树脂的质量比为1∶10～30。
19.具体地，步骤3）的具体操作为：
将双酚a聚醚多元醇加入到甲苯中，加入催化剂cat-1，60～70℃下搅拌20～50 min，滴加环氧氯丙烷，滴加完后，加入氢氧化钠，搅拌反应1～4 h，中和，过滤，减压蒸馏，得到亲水性环氧树脂；取硅烷偶联剂键合硅胶微球置于亲水性环氧树脂中，升温至100～110℃，搅拌0.5～1 h，加入固化剂二乙氨基丙胺，继续搅拌10～50 min，滤出，烘干，即得改性硅胶色谱填料。
20.本发明通过上述方法，环氧树脂与硅胶中的硅羟基作用在硅胶微球表面形成一层亲水层，硅胶微球表面键合的2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺改性硅烷偶联剂中含有酚羟基，可与环氧树脂中的环氧基反应增加结合强度，并能增加亲水性环氧树脂层的均匀程度，使所得硅胶色谱填料具有均匀的球形结构，分散性好，具有合适的孔径，比表面积高，硅胶色谱填料经环氧树脂键合后，能够进一步阻止碱液与硅胶微球表面的硅羟基反应，耐酸、碱性得到提高，将其用于分离纯化九肽-1，减少了封尾反应过程中的位阻效应，色谱峰形对称性好，柱效和分离度大幅度提升；此外，双酚a聚醚多元醇中的醚键的存在使其具有良好的亲水性，从而减少水溶性聚合物、蛋白、生物酶、多肽等生物大分子的非特异性吸附，增加使用寿命。
21.上述所述改性硅胶色谱填料在纯化九肽-1中的应用，所述应用包括将改性硅胶色谱填料用于反相高效液相色谱中对九肽-1进行纯化。
22.一种纯化九肽-1的方法，所述方法包括：步骤一、将纯化九肽-1粗品用双蒸水溶解后离心、凝胶色谱柱层析分离；步骤二、采用反相高效液相色谱进行纯化，得到九肽-1纯化液；填料为前述所述改性硅胶色谱填料；步骤三、用阴离子交换色谱进行精纯，得到高纯九肽-1。
23.具体地，所述步骤一中九肽-1粗品、双蒸水的料液比为1g∶20～50 ml。
24.具体地，所述步骤一中凝胶色谱柱层析分离所用填料为葡聚糖凝胶g-25，装填体积为20～50 ml。
25.具体地，所述步骤一中凝胶色谱柱层析分离的条件为：流动相：双蒸水，检测波长：215 nm；柱温：30～45℃；进样量：0.5～2 ml；流速：1～5 ml/min。
26.具体地，所述步骤二中反相高效液相色谱条件为：流动相：a相为0.05～1 vol%的三氟乙酸水溶液，b相为含0.05～0.5 vol%的三氟乙酸的乙腈溶液；洗脱梯度：b相35～55%洗脱20～40 min，；检测波长：215 nm；柱温：30～45℃；进料量：4～20 μl；流速：10～30 ml/min。
27.具体地，所述步骤二中的装填体积为20～50 ml。
28.具体地，所述步骤三中阴离子交换色谱的填料为deae高流速琼脂糖微球，装填体积为20～100 ml。
29.具体地，所述步骤三中阴离子交换色谱的条件为：流动相：包含0.1～2 vol%的醋酸、0.05～0.5 vol%醋酸钠的混合水溶液；检测波长：215 nm；洗脱：100%的醋酸/醋酸钠的混合溶液；流速：4～10 ml/min。
30.本发明通过上述步骤，先利用凝胶色谱对九肽-1粗品进行粗纯，然后利用反相高效液相色谱法进行分离纯化，利用改性硅胶色谱填料对九肽-1进行纯化，减少了封尾反应过程中的位阻效应，色谱峰形对称性好，柱效和分离度大幅度提升，除去了大部分杂质，并
减少九肽-1的损失，得率和纯度得到提升，活性不被破坏，最后利用弱阴离子交换柱进行脱盐，将三氟乙酸型九肽-1转换成醋酸型九肽-1，进一步对九肽-1进行纯化，极大地提高了纯化效率，所得九肽-1的纯度高且收率高。
31.上述方法纯化得到的九肽-1，收率高于85%，纯度高于99%。
32.上述所述纯化九肽-1的方法在制备九肽-1中的应用。
33.本发明由于采用凝胶色谱柱层析分离、反相高效液相色谱、阴离子交换色谱组合的方法对九肽-1粗品进行纯化，因而具有以下有益效果：分离纯化方法简单，可快速去除九肽-1粗品中的杂质，高效地分离出九肽-1，所得九肽-1的得率高、损失低、纯度高、活性不被破坏；反相高效液相色谱用填料为改性硅胶色谱填料，其不仅耐酸、耐碱稳定性好，且在分离过程中不会塌陷，延长了使用寿命，利用该改性硅胶填料分离纯化九肽-1，可改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题，可快速高效地分离出九肽-1，出峰时间较快，提高九肽-1的得率和纯度，并减少活性的降低。
附图说明
34.图1是实施例1所得改性硅胶色谱填料的扫描电镜图；图2是改性硅胶色谱填料的孔径和比表面积测试结果示意图；图中b代表孔径，c代表比表面积；图3是改性硅胶色谱填料的耐酸碱性测试结果示意图；图中b代表耐碱性，c代表耐酸性；图4是实施例7中纯化后的九肽-1色谱图；图5是九肽-1的纯度测试结果示意图；图6是九肽-1的得率测试结果示意图。
具体实施方式
35.以下用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，应当指出的是，这些实施例仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
36.本发明中，为进一步提高九肽-1的得率，在阴离子交换色谱纯化过程中，流动相中还包含0.02～0.08 wt%的琥珀酸钠和0.01～0.03 vol%的1-甲基-4-哌啶醇；具体地，所述b相为包含0.1～2 vol%的醋酸、0.05～0.5 vol%的醋酸钠、0.02～0.08 wt%的琥珀酸钠、0.01～0.03 vol%的1-甲基-4-哌啶醇的混合水溶液。
37.实施例1：本实施例提供了一种改性硅胶色谱填料，经由下述方法制备得到：1）1 g硅胶微球加入到20 ml含有8 wt%盐酸、0.6 wt%甲基磺酸的混合溶液中，40℃下搅拌2 h，抽滤，水洗至中性，90℃下真空干燥，得到表面活化硅胶微球；2）2 g乙烯基三乙氧基硅烷与4.5 g 2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺混合，在30℃下搅拌反应2 h，减压蒸馏，得到2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺改性硅烷偶联剂；氮气保护下，将1 g表面活化硅胶微球、2.6 g 2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺改性硅烷偶联剂加入到30 g甲苯中，80℃下搅拌反应4 h，反应结束后过滤，滤渣用甲苯、丙酮、甲醇洗涤，丙酮抽提，水洗，70℃下真空干燥，得到硅烷偶联剂键合硅胶微球；
3）25 g beo-6加入到200 g甲苯中，加入0.05 g催化剂cat-1，65℃下搅拌40 min，滴加4.6 g环氧氯丙烷，滴加完后，加入氢氧化钠，搅拌反应2.5 h，中和，过滤，减压蒸馏，得到亲水性环氧树脂；取1 g硅烷偶联剂键合硅胶微球置于20 g亲水性环氧树脂中，加入5 g丙三醇，升温至105℃，搅拌0.5 h，加入6 g固化剂二乙氨基丙胺，继续搅拌20 min，取出，烘干，即得环氧树脂包覆的硅胶色谱填料。
38.通过jsm-6360lv型扫描电子显微镜对本实施例所得改性硅胶色谱填料进行表征，结果如图1所示，观察图1可知，硅胶经2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺改性硅烷偶联剂、亲水性环氧树脂键合后，依然具有良好的球形形貌和均匀粒径，无团聚现象。
39.实施例2：本实施例提供了另一种改性硅胶色谱填料，其制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于，步骤1）中，乙烯基三乙氧基硅烷、2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺的添加量分别为2 g、1 g。
40.实施例3：本实施例提供了另一种改性硅胶色谱填料，其制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于，步骤1）中，乙烯基三乙氧基硅烷、2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺的添加量分别为2 g、2 g。
41.实施例4：本实施例提供了另一种改性硅胶色谱填料，其制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于，步骤1）中，乙烯基三乙氧基硅烷、2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺的添加量分别为2 g、5 g。
42.实施例5：本实施例提供了另一种改性硅胶色谱填料，其制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于，步骤1）中，乙烯基三乙氧基硅烷、2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺的添加量分别为2 g、6 g。
43.实施例6：本实施例提供了另一种改性硅胶色谱填料，其制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于，步骤2）中，改性硅烷偶联剂用乙烯基三乙氧基硅烷代替，即硅烷偶联剂未经2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺改性。
44.试验例1：孔径、比表面积测试：采用北京金埃谱科技有限公司的v-sorb 2800p比表面及孔径分析仪，对实施例1～6所得改性硅胶色谱填料进行孔径、比表面积的测试，测得结果如图2所示。
45.图2是改性硅胶色谱填料的孔径和比表面积测试结果，其中b代表孔径，c代表比表面积，由图2可知，优选实施例1、3和4所得硅胶色谱填料的平均孔径在6～10 nm之间，比表面积在238～285 m2/g之间，对比实施例1～5的数据可以看出，随着改性硅胶色谱填料制备过程中2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺添加量的增大，对硅胶微球的均匀包覆增加，其平均孔径减小，比表面积相应降低，而实施例6的硅胶微球表面键合的硅烷偶联剂未经改性，硅胶微球的包覆层较少且均匀性较差，因此获得硅胶色谱填料的平均孔径和比表面积最大。综上所述，通过调控硅烷偶联剂改性过程中2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺的添加量，将硅胶色谱填料的
孔径控制在6～10 nm之间、比表面积控制在230～280 m2/g之间，避免孔径和比表面积过小或过大导致九肽-1的分离纯化效率降低。
46.试验例2：耐酸碱性测试：耐碱性：将实施例1～6的填料装柱，保持流速1.0 ml/min，柱温60℃，用200 mmol/l乙腈/三乙胺水溶液（乙腈/三乙胺的体积比为3∶7，ph=11.0）作流动相，测试20 h后对对羟基苯甲酸甲酯的保留损失率，检测波长254 nm。
47.耐酸性：将实施例1～6的填料装柱，保持流速1.0 ml/min，柱温60℃，用0.5%三氟乙酸作流动相，20 h后对对羟基苯甲酸甲酯的保留损失率，检测波长254 nm。
48.图3为改性硅胶色谱填料的耐酸碱性（对对羟基苯甲酸甲酯的保留损失率）测试结果，其中b代表耐碱性，c代表耐酸性观察图3可知，六种柱子在ph=11.0、60℃下冲洗20 h后，实施例1、3和4的柱子对对羟基苯甲酸甲酯的保留损失率较小，实施例2和5的保留损失率较大，实施例6的保留损失率最高，原因可能是硅烷偶联剂经改性后，有助于在硅胶微球表面形成均匀的包覆层，将硅胶微球很好的包裹起来，减少碱性流动相与硅胶表面硅羟基的接触，流动相不易侵蚀硅胶使其键合相流失，对其起到很好的保护作用，因此损失率低，耐碱性提高；而上述作用效果与硅烷偶联剂的改性程度密切相关。综上所述，本发明利用改性硅烷偶联剂和环氧树脂对硅胶微球进行键合包覆，能显著提升硅胶色谱填料的耐碱性能，弥补现有硅胶色谱填料的缺陷。
49.由图3还可以看出，六种柱子在0.5%三氟乙酸、60℃下冲洗20 h后，其对对羟基苯甲酸甲酯的保留损失率差异显著，实施例1、3和4的保留损失率不高于4.4%，而实施例2和5的保留损失率高于6.7%，实施例6的保留损失率达16.5%，明显高于实施例1，这说明硅胶微球经改性硅烷偶联剂和环氧树脂键合后，可以将硅胶微球很好保护起来，能够减少硅胶键合相的消失，从而降低损失率，提高耐酸性能。
50.实施例7：本实施例提供了一种纯化九肽-1的方法，包括下述步骤：步骤一、将1 g九肽-1粗品溶于30 ml双蒸水中，8000 r/min下离心20 min，上清液中加入双蒸水配置成50 mg/ml的溶液，放置过夜后，用葡聚糖凝胶g-25进行凝胶色谱柱层析分离，柱子装填体积为30 ml，流动相为双蒸水，柱温35℃，进样量1.5 ml，流速4 ml/min，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，得九肽-1粗液；步骤二、用实施例1所得改性硅胶色谱填料进行反相高效液相色谱纯化，柱子装填体积为30 ml，流动相a相为0.08 vol%的三氟乙酸水溶液，b相为0.2 vol%的三氟乙酸乙腈溶液，流速25 ml/min，柱温40℃，进料量8 μl，流速25 ml/min，检测波长215 nm，进样前先用0.08 vol%的三氟乙酸水溶液对柱子进行洗涤，上样后洗脱纯化，洗脱条件为：b相48%洗脱40 min，收集纯化后的九肽-1溶液，减压浓缩至30 mg/ml；步骤三、用deae高流速琼脂糖微球进行阴离子交换色谱纯化，柱子装填体积为30 ml，流动相为包含0.5 vol%的醋酸、0.2 vol%的醋酸钠的混合溶液，流速8 ml/min，柱温40℃，检测波长215 nm，进样前先用1 vol%的醋酸水溶液对柱子进行洗涤，上样后洗脱纯化，收集目标峰，减压浓缩，冷冻干燥得到高纯九肽-1。
51.实施例8：
本实施例提供了另一种纯化九肽-1的方法，其步骤与实施例7基本相同，不同之处在于，步骤二中的填料为实施例2所得改性硅胶色谱填料。
52.实施例9：本实施例提供了另一种纯化九肽-1的方法，其步骤与实施例7基本相同，不同之处在于，步骤二中的填料为实施例3所得改性硅胶色谱填料。
53.实施例10：本实施例提供了另一种纯化九肽-1的方法，其步骤与实施例7基本相同，不同之处在于，步骤二中的填料为实施例4所得改性硅胶色谱填料。
54.实施例11：本实施例提供了另一种纯化九肽-1的方法，其步骤与实施例7基本相同，不同之处在于，步骤二中的填料为实施例5所得改性硅胶色谱填料。
55.实施例12：本实施例提供了另一种纯化九肽-1的方法，其步骤与实施例7基本相同，不同之处在于，步骤二中的填料为实施例6所得改性硅胶色谱填料。
56.实施例13：本实施例提供了另一种纯化九肽-1的方法，其步骤与实施例7基本相同，不同之处在于，步骤二中的填料为未处理的硅胶色谱填料。
57.实施例14：本实施例提供了另一种纯化九肽-1的方法，其步骤与实施例7基本相同，不同之处在于，步骤三的流动相为包含0.5 vol%的醋酸、0.2 vol%的醋酸钠、0.06 vol%的琥珀酸钠、0.02 vol%的1-甲基-4-哌啶醇的混合水溶液。
58.实施例15：本实施例提供了另一种纯化九肽-1的方法，其步骤与实施例14基本相同，不同之处在于，步骤三的流动相中不包含琥珀酸钠。
59.实施例16：本实施例提供了另一种纯化九肽-1的方法，其步骤与实施例14基本相同，不同之处在于，步骤三的流动相中不包含1-甲基-4-哌啶醇。
60.应当明确的是，前述实施例7～16中的各九肽-1粗品均来自于同一实验条件下所得九肽-1粗品。
61.试验例3：纯度和收率测试：将实施例7～16所得高纯九肽-1充分干燥后，称量其重量，并进行高效液相色谱测定其纯度。
62.图4是实施例7中纯化所得九肽-1的色谱图，由图可知，纯化后的九肽-1的纯度较高，杂质峰完全分离。
63.图5、6分别是实施例7～16所得高纯九肽-1的纯度和得率测试结果，由图5、图6可知，应用实施例1、3和4所得改性硅胶色谱填料为反相高效液相色谱填料时，即进行实施例7、9和10所述方案对粗品进行纯化时，配合凝胶色谱柱层析分离、阴离子交换色谱得到的九肽-1的纯度较高，达99%以上，得率达85%以上，而实施例11的纯度仍为99%以上，而得率比实
施例7低，说明硅烷偶联剂的过度改性会降低纯化收率，而对纯度影响较小；对比实施例7～13，其纯化得到的九肽-1的纯度和得率具有明显的差距，说明硅烷偶联剂的改性处理对九肽-1的分离纯化具有较大的影响，控制硅烷偶联剂改性过程中2-氨基苯酚-4-磺酰苯胺的添加量，可获得具有合适的平均孔径和比表面积的硅胶色谱填料，有助于提升九肽-1的分离效率和纯度；从图6中还可以看出，实施例14纯化得到的九肽-1的得率高于实施例7，达到了87.5%，实施例15和16纯化得到的九肽-1的得率与实施例7相比无明显变化，说明阴离子交换色谱分离过程中，流动相中同时添加琥珀酸钠和1-甲基-4-哌啶醇，具有一定的协同作用，增加了流动相的离子强度，能够抑制阴离子交换色谱中九肽-1与固定相的疏水作用，改善分离选择性，提高九肽-1的得率。
64.本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
65.以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。