一种重组猫细小病毒VP2蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用的制作方法

一种重组猫细小病毒vp2蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用
技术领域
1.本发明属于生物疫苗和微生物的检测与诊断领域，更具体的涉及一种重组猫细小病毒vp2蛋白的串联抗原，及其将其用于检测fpv抗体的间接elisa方法。本发明还涉及所述的重组猫细小病毒vp2蛋白在制备猫细小病毒vp2亚单位疫苗以及在制备诊断或检测猫细小病毒感染的试剂中的应用。


背景技术：

2.猫细小病毒（feline parvovirus，fpv）属于细小病毒科，细小病毒属，又称猫泛白细胞减少症病毒、猫瘟病毒和猫传染性肠炎病毒。该病毒是一种主要易感幼小动物的高度致死性接触性传染病，可以感染猫科、浣熊科等多种动物，其中以6月龄以下的幼猫最为易感。其典型的临床为高热、呕吐、腹泻和肠炎，并且导致白细胞数目严重减少。根据猫的日龄、生活环境、免疫状况以及并发感染等差异，并不是所有的感染者都会出现典型症状。是目前肉食兽细小病毒属中感染范围最广、致病性最强的一种病毒。该病于 1928年首次被法国人发现，随后该病毒在意大利、葡萄牙、日本等各地均有发现，而我国由李刚等人首次于1984年从自然病例中分离到fpv，随后在我国河南、安徽、广西等地均有发生，进而遍布全国各地。给宠物行业和动物养殖业带来重大经济损失。
3.fpv是一种单股线状无囊膜的dna病毒，直径25ｎｍ左右，呈二十面体对称。其基因组全长 5 kb左右，核酸分子量为 1.6
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106。含有两个开放阅读框(orf)。第一个orf编码两个非结构蛋白ns1和ns2，第二个orf编码两个结构蛋白vp1和vp2。它能利用宿主细胞的rna聚合酶ⅱ分别启动结构蛋白(vp1和vp2)和非结构蛋白(ns1和ns2)编码基因的转录。vp1和vp2及ns1和ns2是通过同一条mrna分别剪接后翻译形成的。vp2是主要的衣壳蛋白，它包括了所有的中和抗原位点，其基因全长1755 bp,编码584个氨基酸,vp2基因上的几个关键碱基和氨基酸发生变化会改变其抗原特性和宿主范围。
4.目前，我国宠物产业在不断地发展，fpv在我国广泛流行，严重制约着猫宠物业的发展。fpv引起的疾病发病率和传染性较高，对fpv的防控工作带来巨大的困难。 而抗体水平是评价fpv疫苗效果的最重要参数，抗体水平过低则不能保护需要及时补打疫苗。目前监测fpv的抗体水平常用的方法为猪红细胞血凝抑制法，但该方法操作复杂、成本高昂故仅限于专业实验室操作。因此，需要建立一种价格低廉、快速、敏感且能简便检测血清样本的fpv抗体的方法。现有技术中细小病毒的研究不多，尤其是猫细小病毒，因此没有很多文献对其表位有透彻的研究。虽然有的研究者针对其他动物的细小病毒的检测取得了一定的进展，针对的虽然是vp2蛋白，但是首先病毒的序列相差很大，其同源性有的不足70%，而且现有研究中也只取了其中一段表位，没有将全部可行表位预测和验证后进行串联表达。而且现有技术中所选取的表位也并没有完全实现其识别和预防功能。
5.理论上对于fpv抗体检测可用全病毒包被的形式建立间接elisa检测方法；也可以用针对vp2的单抗建立双抗夹心elisa方法。但全病毒包被需大量病毒，成本高且存在散毒
风险。单抗制备较为繁琐且费时费力，短期内不能完成。由于fpv的vp2蛋白是该病毒的唯一抗原保护基因，因此采用表达vp2蛋白代替全病毒，理论上可用于检测fpv特异性抗体。但由于fpv的vp2全长的重组蛋白表达量低、蛋白纯化困难等问题，一度限制了其应用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种特异性好，灵敏度高的重组抗原，该抗原是由猫细小病毒vp2蛋白多个b细胞表位串联表达后获得，所示氨基酸序列为seq id no .1所示，其对应的核苷酸序列为seq id no .2。
7.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：利用在线资源 bepi pred 1.0b server，bcepred 对实验室fpv分离株sh612,zz6293,bj19株 以及国内外已经测序的多个毒株进行抗原表位预测分析。bepi pred1.0bserver 预测时抗原表位的打分临界值选为 1，bcepred 利用亲水性、柔性、可及性的平均值进行筛选，打分临界值选为 0.5。最终选取打分值同时满足两种软件要求且连续的氨基酸数目大于等于 4 的抗原表位（中间间隔氨基酸数目小于等于2 同样满足筛选条件）作为有效抗原表位的代表序列。统计fpv不同毒株共同的b细胞抗原表位，并根据b细胞表位长度在5-25氨基酸之间的原则，选取长度在此范围内的多个潜在表位进行串联表达，每个表位表位之间加入一个柔性linker序列ggggs,构建成一个多表位串联表达盒。序列为seq id no .2所示，嵌入pet32载体，成功构建pet32
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fpv vp2原核表达质粒，并将pet32
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fpv vp2质粒转化至e .coli bl21(de3)感受态中，使其在e .colibl21(de3)菌株中高效表达并纯化，最后获得纯化的fpv vp2重组蛋白。
8.进一步的，本发明提供所述改造后的重组猫细小病毒vp2重组抗原在制备预防猫细小病药物以及在制备检测或诊断猫细小病毒抗体试剂，特别是elisa检测试剂中的应用。
9.本发明的另一个目的在于提供一种包含上述可溶性抗原的间接elisa抗体检测试剂盒，该试剂盒主要为猫病毒抗体的检测，用于猫抗体水平的监测。
10.具体的，所述的利用表达的vp2蛋白开发了相应的elisa检测方法，该方法敏感性好、特异性高。 通过对elisa方法中的各个参数进行优化分析，最终确认所述方法当抗原浓度为 8 ug/ml，待检血清 1:400 稀释时，p/n 值最大，阴性临界值（x 3sd）值为 0.327。
11.优选的，最佳抗原包被浓度为8ug/ml、最佳一抗血清稀释倍数为1：400、最佳包被时间4℃过夜、最佳一抗孵育时间37℃ 60min、最佳二抗稀释倍数的确定1：10000、最佳二抗孵育时间的为37℃ 60min、最佳显色时间是37℃15min。
12.所述应用包括但不限于对患病动物的检测，还包括对生物样品、离体生物组织、环境样品、水体、食物、污染物等的检测或者流行病学检测等。
13.进一步的，本发明提供一种间接elisa抗体检测试剂盒，鉴定猫是否感染非猫细小病毒或者检测猫血清中是否含有猫细小病毒抗体。截短的fpv vp2重组蛋白作为包被抗原，通过条件优化，建立了检测fpv间接elisa抗体检测方法。
14.所述试剂盒包括：包被液的组分为碳酸钠 1.58g、碳酸氢钠 2.93g 加去离子水定容至1l，调节ph值为9.6。pbst 缓冲液为含终浓度 0.01%，tween-20 的 pbs 缓冲液 。2m 的硫酸溶液组分22.2ml 98%的h2so
4 加177.2ml的去离子水定容至200ml。检测抗体为山羊抗猫igg-hrp购自上海拓然生物有限公司。阳性对照为使用fpv灭活病毒后免疫多次自行制
备，阴性血清为本实验室保存。pbs缓冲液干粉购自北京索莱宝科技有限公司。封闭液为5%的脱脂奶粉。
15.进一步，本技术提供一种可以预防和/或治疗猫细小病毒的疫苗，所述疫苗为dna疫苗或亚单位疫苗，所述疫苗的活性成分为，氨基酸序列如seq id no .1所示的蛋白片段和/或核苷酸序列为seq id no .2所示的核苷酸。
16.有益效果与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明使用的抗原为猫细小病毒蛋白vp2截短蛋白，嵌入到原核载体pet32 的重组抗原pet32
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fpv vp2，该抗原为可溶性抗原并且经诱导表达纯化后，具有灵敏度高，特异性好以及纯度高等特点。同时，pet32
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fpv vp2具有免疫原性，因此是可作为检测试剂盒的包被抗原。
17.截短后vp2蛋白表达于上清且表达量高以及临床实用性强。本发明制备的elisa抗体检测试剂盒能够准确检测样品中是否含有猫细小病毒抗体，同时与全病毒的间接elisa相比，本发明基于b细胞表位串联表达包被的重组蛋白elisa试剂盒的特异性与其相当，且灵敏度高，阳性率高，操作简便。
18.而本发明使用的截短的vp2重组蛋白表达量高且易于纯化进行大量制备，可以实现elisa检测的包被抗原的大规模使用。
19.本发明选取fpv vp2的多个b细胞表位区域，并使用linker序列（ggggs）将多个片段串联起来。利用本发明的蛋白抗原制备出的elisa试剂盒，灵敏度高，阳性率高，操作简便，检测时间短，与现有的利用fpv全病毒建立的间接elisa检测方法相比，具有明显的优势。
20.该重组蛋白表达量高，为可溶性表达便于纯化，易于大量制备高纯度的重组蛋白。用于elisa方法建立后特异性、敏感性强，与全病毒的检测效果一致，相较与全病毒该方法操作方便快捷，成本低，且没有散毒的风险。
附图说明
21.图1为fpv vp2基因b细胞表位对应氨基酸位点示意图。
22.图2为重组质粒pet32
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fpv vp2基因酶切鉴定结果。
23.图3为fpv vp2全长重组蛋白sds-page电泳结果图4为fpv vp2截短重组蛋白sds-page电泳结果图5为fpv vp2截短重组蛋白纯化后sds-page电泳结果图6为表达目的蛋白纯化后的western blot结果，其中m为蛋白maker，1为阴性对照 2为重组蛋白。
具体实施方式
24.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
25.实施例 1首先，我们根据多个b细胞预测软件，将分离自不同年代和国家的20株fpv病毒的
vp2基因b细胞抗原表位进行预测统计，共获得理论上保守的潜在b细胞表位35个。先将35个潜在的b细胞表位分别合成多肽，并与骨架蛋白偶联形成完全抗原，并免疫小鼠后检测该b细胞表位是否能刺激产生特异性抗体。经过验证共获得11个免疫原性良好的表位如表1所示。
26.根据所选择的fpv不同毒株vp2共同的b细胞抗原表位区域信息如表1所示，随后使用一个柔性linker序列将不同区域串联起来，并在序列两端引入 bamhi 限制性酶切位点和 ecori 限制性酶切位点，得到重组 dna。对应的氨基酸位点示意图如图1所示，相应的氨基酸序列如seq id no.1所示，其编码重组 dna 的序列为 seq id no.2 所示。
27.表1选择的抗原表位区域信息2）阳性重组质粒 pet32
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fpv vp2 的构建将所需的b细胞抗原表位区域用linker连接，在公司进行合成，pcr扩增后和原核表达载体 pet32 用bamhi和ecori 进行双酶切后用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的同源重组酶37℃连接30min，转化 dh5α 感受态细胞后，摇菌后进行菌液鉴定，将疑似阳性菌送上海生物工程有限公司进行序列测定。测序鉴定为阳性的重组质粒即为阳性重组质粒 pet32
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fpv vp2。提取质粒进行双酶切鉴定如图2所示。
28.3）目的蛋白的表达将鉴定的阳性重组质粒pet32
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fpv vp2小提质粒后转化入bl21 大肠杆菌感受态细胞中，挑取单个菌落接种 lb 培养基，培养过夜。取 100μl 菌液加入到 5ml lb 培养基中震荡培养至 od 值为0.5（0.4-0.6 左右）时，加入 iptg 16℃诱导，取不同时间段（诱导表达 12h、16h、20h、24h）表达产物 1ml，超声裂解后进行 sds-page。结果如图 3 所示 ，而fpv vp2全长表达效果图如图4所示。
29.4）表达产物的纯化按照步骤 3）中优化的条件进行大规模培养，按照 his 蛋白纯化说明书进行纯化。纯化后同样进行 sds-page。结果如图 5 所示。
30.5）纯化蛋白的 western blot 分析将纯化的蛋白进行 western blot 分析，一抗为 hi s mab（1:1000），酶标二抗为羊抗鼠 igg/ 辣根酶（hrp）（1:10000），按常规步骤做 western-blot，用dab 显色观察结果。结果如图 6所示。
31.实施例2 elisa 方法的建立用纯化后的重组蛋白为包被抗原制备elisa 平板，检测猫血清中fpv 抗体水平，并对影响实验的各种条件进行优化选择。具体而言：a) 抗原包被浓度与血清最佳稀释度采用矩阵滴定法，横排选择抗体稀释度（1:100、1:200、1:400、1:800），纵排选择抗原浓度（0.5 ug/ml 、1ug/ml、2 ug/ml、4 ug/ml 、8 ug/ml 、16 ug/ml），每个稀释度重复 3 次，取平均值。结果，当抗原浓度为 8 ug/ml，待检血清 1:400 稀释时，p/n 值最大，因此，最佳抗原包被浓度为 8 ug/ml，抗体最佳稀释度为 1:400如表2所示。
32.表 2 最适抗原包被浓度与血清稀释度的确定b) 抗原包被时间的确定用最佳抗原浓度包被酶标板，包被条件为室温作用1h再4℃过夜、室温作用 2h再4℃过夜、37℃作用1h再4℃过夜、37℃作用 2h再4℃过夜、直接4℃作用过夜，结果 4℃作用过夜包被效果最好如表3所示。
33.表 3 最适包被条件的确定
c) 血清最佳反应时间加入血清后，反应时间为30min、60min、90min，进行elisa 检测，结果作用 60min 效果最好如表4所示。
34.表4血清最佳反应时间的确定d) 酶标二抗最佳反应时间加入酶标二抗后，反应时间为30min、60min、90min，进行elisa 检测，结果作用 60min 效果最好如表5所示。
35.表5酶标二抗最佳反应时间确定e) 底物最佳反应时间的确定加入底物（tmb）后，反应时间为10min、15min、20min ，进行 elisa 检测，结果作用 15min 效果最好如表6所示。
36.表6底物最佳反应时间的确定通过上述优化的步骤筛选，最终确定利用本技术所述的融合抗原所获得的elisa检测优选步骤具体为：(1)包被 ：将纯化后的重组蛋白，用抗原包被液稀释至含重组蛋白8ug/ml 的终浓度，每个 elisa 孔加入 100ul，4℃包被过夜，pbst 缓冲液洗涤 5min，重复三次 ；(2)封闭 ：每孔加入 5% 脱脂奶粉的pbst 封闭液 100ul，37℃作用 2h，pbst 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；(3)加待检血清 ：每孔加入 100ul 用pbs稀释 1:400 倍稀释的猫血清，37℃作用 1h， pbst 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；(4)加酶标二抗 ：每孔加入100ul 用pbs稀释 1:10000 稀释的兔抗猫igg/ 辣根酶，37℃作用 1h，pbst 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；(5)加显色液 ：每孔加入 100ul tmb显色液，37℃作用 15min ；(6)加终止液 ：每孔加入50ul 终止液，用酶标仪测定od450 值 ,所述终止液为2m 的硫酸溶液 。
37.f) 最佳 elisa 临界值的确定在最佳工作浓度条件下，对收集的 13 份 fpv 抗体阴性的猫血清进行间接elisa 方法检测，确定阴性临界值（x 3sd）值为 0.327如表7所示。
38.表7最佳 elisa 临界值的确定
g) 间接 elisa 的特异性实验利用所表达的可溶蛋白作为诊断抗原包被 elisa 方法检测猫杯状病毒（fcv）阳性血清、猫疱疹病毒（fhv）阳性血清，所检测 od450 值均小于 0.327，检测结果均为阴性如表8所示，证明所建立的方法与上述病毒无交叉反应，特异性好。
39.表8特异性实验h)间接 elisa 的重复性试验对五份血清进行测定，计算组内、组间的变异系数，结果均在 10 % 以内如表9、10所示，表明所建立的间接 elisa 方法有较好的重复性。
40.表 9 批内重复性试验表 10 批间重复性试验i) 全病毒包被法与本专利建立的表位串联表达包被法比较随机抽取五份猫血清用全病毒包被建立的elisa与本专利建立的表位串联表达elisa 方法进行检测结果如表11所示，显示两种elisa方法检测结果基本一致。
41.表11全病毒包被法与本专利建立的表位串联表达包被法比较
j)临床样品的检测利用 a）-i）步骤所优化好的条件包被 elisa 平板，并对 45 份采自上海地区采集的猫血清进行检测，结果可见，19 份未免疫猫血清检测 od450 值均小于 0.327，用全病毒建立的elisa方法进行检测与本专利建立的elisa 方法结果一致，表明本专利建立的elisa 方法，可用于 fpv 的临床检测。
42.可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。