用于改变开花和植物构造以提高产量潜力的组合物和方法与流程

用于改变开花和植物构造以提高产量潜力的组合物和方法
1.本技术是申请日为2016年4月18日、申请号为201680025807.8、发明名称为“用于改变开花和植物构造以提高产量潜力的组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求分别于2015年4月20日和2015年9月25日提交的美国临时专利申请号62/150,142和62/233,019的优先权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
4.序列表的并入
5.计算机可读形式的序列表通过电子呈递与本技术一起提交，并且以引用的方式整体并入到本技术中。序列表包含在名为60760_anniversary_st25.txt的文件中，所述文件的大小为61,079个字节(在操作系统ms windows中测量)并且于2016年4月1日创建。
发明领域
6.本发明涉及用于通过对作物进行基因改造来调节花发育和营养生长以增加产量的组合物和方法。
技术背景
7.从营养生长到开花的转变是植物发育期间的关键过程，其为以作物产生粮食产量所必需的。控制陆地植物的开花时间(其响应于环境信号或发育信号)有四种主要途径，除自发(环境上独立的)途径之外，还包括光周期现象(即，白昼长度)、春化作用(即，响应于冬冷)、以及植物激素(例如，赤霉素或ga)。除ga和自发途径以外，植物开花的调节通常涉及开花时间的两种重要调节因子，constans(co)和开花基因座(flowering locus)c(flc)。flc基因是响应于春化作用而调节开花的成花阻遏子，而co基因是响应于光周期条件的成花激活物。在诱导性光周期条件下，源叶中的co活性增加开花基因座t(ft)的表达，所述开花基因座t(ft)易位到分生组织以触发下游成花激活基因的表达，所述下游开花激活基因包括leafy(lfy)、apetala1(ap1)和co过表达抑制因子1(soc1)。其他基因(诸如开花基因座c(flc)和顶生花1(tfl1))用于抑制这些基因的表达或活性。
8.除白昼长度中性植物以外，大多数开花植物响应于每日光周期，并且基于诱导开花所需要的光周期条件被分类为短日照(sd)植物或长日照(ld)植物。光周期是指在24小时周期内光照时间和黑暗时间的相对长度或持续时间。一般来讲，长日照植物倾向于在白昼长度超过光周期阈值时(例如，当白昼在春天变得更长时)开花，而短日照植物倾向于在白昼长度落至低于光周期阈值时(例如，当白昼在夏至之后变得更短时)开花。换言之，sd植物在白昼变得更短时开花，而ld植物在白昼变得更长时开花。大豆是短日照(sd)植物的实例，其中当植物暴露于较短光照条件时诱导开花。
9.植物种植者一直在寻找调控植物产量，尤其是增强农学上重要的作物的种子产量的新方法。因此，在本领域中一直需要用于增加各种作物产量的改进组合物和方法。现在提出，可通过增强与开花和生殖发育相关的农学性状来实现提高的作物产量。
10.发明概述
11.根据本发明的第一方面，提供一种重组dna构建体，其包含可操作地连接到营养阶段启动子的编码促花ft蛋白(florigenic ft protein)的多核苷酸序列。由多核苷酸序列编码的促花ft蛋白可包含与选自由以下组成的组的序列或其功能性片段具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列：seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、以及seq id no:20。所述多核苷酸序列还可与选自由以下组成的组的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列：seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、以及seq id no:19。营养阶段启动子还可以是分生组织优选启动子或分生组织特异性启动子。还提供包含此重组dna构建体的dna分子和载体。
12.根据本发明的第二方面，还提供转基因植物、植物细胞、植物组织和植物部分，其包含本发明的重组dna构建体到此类植物、细胞、组织和植物部分的基因组中的插入物。本发明的转基因植物对于重组dna构建体的插入物而言可以是纯合的或半合子的。转基因植物可以是短日照植物和/或双子叶植物。根据植物物种，本发明的转基因植物可相对于不具有重组dna构建体的对照或野生型植物在转基因植物的每个苤节中产生更多的棉铃、长角果、果实、坚果或豆荚。本发明的转基因植物还可相对于不具有重组dna构建体的对照或野生型植物在每个苤节中产生更多的花和/或花总状花序。
13.根据本发明的第三方面，提供用于产生具有提高的产量相关的性状或表型的转基因植物的方法，其包括：(a)使用重组dna构建体转化外植体的至少一个细胞，所述重组dna构建体包含可操作地连接到营养阶段启动子的编码促花ft蛋白的多核苷酸序列；以及(b)使转基因植物从转化的外植体再生或发育。此类方法还可包括(c)选择具有以下性状或表型中的一种或多种的转基因植物：与不具有重组dna构建体的对照植物相比，更早开花、更长生殖或开花持续时间、每个苤节的花的数量增加、每个苤节的花总状花序的数量增加、每个苤节的豆荚、棉铃、长角果、果实或坚果的数量增加、以及每个苤节的种子的数量增加。
14.根据本发明的第四方面，提供用于在田间以正常或较高密度种植本发明的转基因作物的方法。根据一些实施方案，提供方法，其包括：在田间以较高密度种植转基因作物，其中所述转基因作物使用重组dna构建体来转化，所述重组dna构建体包含可操作地连接到营养阶段启动子的编码促花ft蛋白的多核苷酸序列。根据这些实施方案中的一些，营养阶段启动子可以是分生组织优选启动子或分生组织特异性启动子。对于大豆，可每英亩种植约150,000至250,000个转基因大豆植物种子的较高密度。对于棉花，可每英亩种植约48,000至60,000个转基因棉花植物种子的较高密度。对于油菜，可每英亩种植约450,000至680,000个转基因油菜植物种子的较高密度。
15.附图简述
16.图1a提供示出各种ft基因的每种组合的核苷酸序列的比较(包括其同一性百分比)的矩阵表。
17.图1b提供示出各种ft蛋白的每种组合的蛋白质序列的比较(包括其同一性百分
比)的矩阵表。
18.图1c提供各种ft蛋白的clustal 2.0.9多序列比对。
19.图2示出在短日光或长日光处理1天、3天和5天之后采集的大豆叶和顶端组织中的总ft转录水平。
20.图3和图4示出通过监测早期大豆发育期间的gus活性获得的pat.erecta启动子的表达模式。图3是染色组织的一组黑白图像，并且图4中的图像对应于图3，但是针对蓝色gus染色进行过滤。图3a至图3c和图4a至图4c示出在3天大的发芽幼苗中的表达；图3d至图3i和图4d至图4i示出在10天大的营养枝(在14小时光照/10小时黑暗光周期中生长)中的表达；图3j至图3l和图4j至图4l示出在16天大的生殖枝中的表达；并且图3m至图3o和图4m至图4o示出在生殖枝的30天大的成熟叶和未成熟叶中的表达。标准是100μm。
21.图5和图6示出在发育的r1阶段和成花阶段期间(发芽之后35-40天)使用pat.erecta启动子的gus表达模式。图5是染色组织的一组黑白图像，并且图6中的图像对应于图5，但是针对蓝色gus染色进行过滤。图5a和图6a示出在花序茎或花梗(箭头)中的表达，并且图5b和图6b示出中总花梗(箭头)中的表达。还示出在维管结构和薄壁细胞(图5c和图6c)、雄蕊花丝(图5d和图6d；箭头)、以及未授粉胚珠(图5e、图5f、图6e和图6f；箭头)中的表达。标准是1mm。
22.图7示出使用扫描电子显微镜(esem)分析获得的来自在种植之后7天的野生型植物相对于表达gmft2a的转基因植物的枝顶端分生组织(sam)的部分成像。
23.图8示出与来自表达gm.ft2a的转基因事件的腋生花序原基(种植9天之后采集)相比来自野生型植物的腋生花序原基(种植27天之后采集)的扫描电子显微镜(esem)显微图。
24.图9示出在大豆中由at.erecta启动子驱动的gm.ft2a表达的效应。图9a描绘示出正常腋芽的无转基因分离子，而图9b和图9c(分别对应于对gm.ft2a转基因是纯合的或半合子的植物)各自示出早期开花和相对于无转基因分离子的每个苤节的豆荚增加。
25.图10示出与对于如所指示的gm.ft2a转基因是半合子的和纯合的植物相邻的野生型无转基因分离子的全株植物图像。
26.图11示出与如所指示的无转基因分离子相比对于pat.erecta-gm.ft2a转基因是纯合的或半合子的植物的主茎的图像。
27.图12a示出野生型无转基因分离子和对于如所指示的per:zm.zcn8转基因是纯合的植物的全株植物图像。
28.图12b示出野生型无转基因分离子和对于如所指示的per:zm.zcn8转基因是纯合的植物的主茎上的豆荚的近距离图像。
29.图13a示出野生型无转基因分离子和对于如所指示的per:nt.ft样转基因是纯合的植物的全株植物图像。
30.图13b示出野生型无转基因分离子和对于如所指示的per:nt.ft样转基因是纯合的植物的主茎上的豆荚的近距离图像。
31.图14示出野生型无转基因分离子和对于如所指示的per:gm.ft2b转基因是纯合的植物的全株植物图像。
32.图15示出野生型无转基因分离子和对于如所指示的per:le.sft转基因是纯合的植物的全株植物图像。
id no：14)、来自拟南芥的at.tsf(seq id no：15)或编码at.tsf蛋白的多核苷酸(seq id no：16)、来自稻的os.hd3a(seq id no：17)或编码os.hd3a蛋白的多核苷酸(seq id no：18)、来自毛果杨的pt.ft(seq id no：19)或编码pt.ft蛋白的多核苷酸(seq id no：20)。
39.编码来自其他物种的具有已知氨基酸序列的额外ft蛋白的ft转基因的多核苷酸编码序列也可根据本发明的实施方案使用，所述额外ft蛋白可例如包括以下各项：来自苹果(苹果(malus domestica))的md.ft1和md.ft2；来自大麦(多棱大麦(hordeum vulgare))的hv.ft2和hv.ft3；来自菊花的cs.ftl3；来自莴苣(莴苣(lactuca sativa))的ls.ft；来自箭杆杨(钻天杨(populus nigra))的pn.ft1和pn.ft2；来自悬铃木(悬铃木(platanus acerifolia))的pa.ft；来自龙眼(龙眼(dimocarpus longan))的dl.ft1；来自豌豆(豌豆(pisum sativum))的ps.fta1、ps.fta2、ps.ftb1、ps.ftb2和ps.ftc；来自菠萝(菠萝(ananas comosus))的ac.ft；来自南瓜(南瓜(cucurbita maxima))的cm-ftl1和cm-ftl2；来自玫瑰的ro.ft；来自春兰(兰花(cymbidium))的cg.ft；来自草莓(野草莓(fragaria vesca))的fv.ft1；来自甜菜(甜菜(beta vulgaris))的bv.ft2；来自向日葵(向日葵(helianthus annuus))的ha.ft4；以及来自小麦(小麦(triticum aestivum))的ta.ft或taft1。参见，例如，wickland，dp等人，“the flowering locus t/terminal flower 1gene family：functional evolution and molecular mechanisms,”molecular plant 8：983-997(2015)，其内容和公开内容以引用的方式并入本文。
40.除非另外声明，本文所述的核酸或多核苷酸序列以5’至3’方向(左向右)提供，并且氨基酸或蛋白质序列以n末端至c末端方向(左向右)提供。来自这些或其他物种的另外已知或随后发现的ft基因和蛋白质也可根据本发明的实施方案使用。这些ft基因可以是已知的或根据其核苷酸和/或蛋白质序列推断的，所述核苷酸和/或蛋白质序列可通过视觉检查或通过基于与已知ft序列、结构域等进行的比较算法使用基于计算机的搜索和识别工具或软件(和数据库)，并且根据任何已知的序列比对技术(诸如blast、fasta等)来确定。
41.根据本发明的实施方案，重组dna分子的ft转基因可包含(当最佳地对齐时)与以上列出的多核苷酸ft编码序列(例如，seq id nos:1、seq id nos:3、seq id nos:5、seq id nos:7、seq id nos:9、seq id nos:11、seq id nos:13、seq id nos:15、seq id nos:17或seq id nos:19)中的一个或多个或与任何其他已知的促花ft编码序列至少60％相同、至少65％相同、至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多核苷酸序列。以上列出的全长ft基因的多核苷酸序列中的序列同一性百分比在图1a中呈现。图1a的表中的每个单元示出对应行(查询序列)中的ft基因除以查询序列的总长度与对应列(目标序列)中的ft基因除以查询序列的总长度相比的同一性百分比，并且括号中的数字是查询序列与目标序列之间的相同碱基的总数量。如此图所示，这些采样ft基因的多核苷酸序列中的同一性百分比的范围是约60％至约90％同一性。因此，处于这些序列同一性范围中的一个或多个范围内或具有更高序列同一性的多核苷酸序列可根据本发明的实施方案用于诱导开花、增加产量和/或改变植物的一种或多种生殖性状。ft的相似多核苷酸编码序列可基于已知的ft蛋白质序列、保守的氨基酸残基和结构域、遗传密码的简并性、以及对于待转化的具体植物物种的任何已知的密码子优化来设计或选择。
42.如以下所述的，包含以上编码序列中的任一种的ft转基因还可包含一种或多种表
达和/或调控元件，诸如前导序列、内含子等。实际上，ft转基因可包含编码ft蛋白或氨基酸序列或其片段或部分的基因组序列。
43.根据本发明的实施方案，重组dna分子的ft转基因可包含编码(当最佳地对齐时)与以上列出的ft蛋白或氨基酸序列(例如，seq id nos:2、seq id nos:4、seq id nos:6、seq id nos:8、seq id nos:10、seq id nos:12、seq id nos:14、seq id nos:16、seq id nos:18、或seq id nos:20)中的一个或多个或任何其他已知的促花ft蛋白质序列或其功能性片段至少60％相同、至少65％相同、至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的氨基酸或蛋白质序列的多核苷酸序列。此“功能性片段”定义为具有与全长ft蛋白相同或高度相似的多肽序列但是缺少全长ft蛋白的一个或多个氨基酸残基、部分、蛋白质结构域等的蛋白质，只要所述片段当在植物中转基因表达时在引起与全长蛋白质相似的表型效应或变化中的一种或多种方面保持活性即可。以上列出的全长ft蛋白中的序列同一性百分比在图1b中呈现。所述百分比基于查询ft蛋白质序列与目标ft蛋白质序列之间的相同氨基酸残基的数量(在括号中)如以上参考图1a所述地进行计算。这些ft蛋白的多序列比对也在图1c中示出。如可从这些图中看出，这些ft基因的蛋白质序列中的同一性百分比的范围是从约60％至约90％同一性。因此，编码处于这些序列同一性范围中的一个或多个范围内或具有更高序列同一性的氨基酸或蛋白质序列的多核苷酸序列可根据本发明的实施方案用于诱导开花、增加种子产量和/或改变植物的一种或多种生殖性状。由本发明的多核苷酸序列编码的这些ft蛋白质序列可基于已知ft蛋白质序列及其保守的氨基酸残基和结构域来设计或选择。
44.如本文所用，术语“序列同一性”是指两个最佳比对的dna序列相同的程度。各种成对或多序列比对算法和程序是本领域中已知的，诸如clustalw等，所述算法和程序可用于比较两个或更多个序列之间(诸如两个或更多个ft基因或蛋白质序列之间或ft基因(核苷酸)或蛋白质序列与另一个核苷酸或蛋白质序列之间)的序列同一性或相似性。例如，一个序列(查询)与另一个序列(目标)的同一性百分比可如以上参考图1a和图1b所述地进行计算(即，在序列最佳地比对的情况下，将相同碱基或残基的数量除以查询序列的碱基或残基的总数量，并乘以100％)。虽然其他比对和比较方法是本领域中已知的，但是两个序列之间的比对和同一性百分比(包括以上所述的同一性百分比范围)可通过clustalw算法来确定，参见，例如，chenna r.等人，“multiple sequence alignment with the clustal series of programs,”nucleic acids research 31：3497-3500(2003)；thompson jd等人，“clustal w：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice,”nucleic acids research 22：4673-4680(1994)；以及larkin ma等人，“clustal w and clustal xversion 2.0,”bioinformatics 23：2947-48(2007)，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。出于本发明的目的，当两个序列最佳地比对(允许其比对中存在间隙)时，然后如以上参考图1a和图1b所述地计算查询序列的“同一性百分比”，即，同一性百分比＝(查询序列与目标序列之间的相同位置的数量/查询序列中的位置的总数量)x100％，其中每个序列由一系列位置(核苷酸碱基或氨基酸残基)组成。
45.由本发明的多核苷酸序列或转基因编码的ft蛋白质序列还可被设计或选择为具有已知在化学上和/或结构上保守的一个或多个氨基酸取代(例如，用具有相似化学或物理特性(诸如疏水性、极性、电荷、立体效应、酸/碱化学、相似侧链基(诸如羟基、巯基、氨基等)的另一种氨基酸取代一种氨基酸)，以避免可能影响蛋白质功能的蛋白质结构变化或使所述结构变化最小化。例如，缬氨酸经常是丙氨酸的保守取代物，并且苏氨酸可以是丝氨酸的保守取代物。蛋白质中的保守氨基酸取代的额外实例包括：缬氨酸/亮氨酸、缬氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、天冬氨酸/谷氨酸、以及天冬酰胺/谷氨酰胺。由本发明的多核苷酸序列或转基因编码的ft蛋白质序列还可包括由于与一个或多个氨基酸有关的缺失和/或插入而与已知ft蛋白或相似序列有一个或多个氨基酸的差异的蛋白质。
46.如果来自不同植物物种的各种ft基因和蛋白质具有与至少一个已知ft基因或蛋白质相似的核酸和/或蛋白质序列并且与所述至少一个已知ft基因或蛋白质共享保守氨基酸和/或结构域，则它们可被识别并视为用于本发明中的ft同源物或直系同源物。如本文所用，关于ft基因或蛋白质的术语“同源物”旨在共同地包括ft基因或蛋白质的任何同源物、类似物、直系同源物、旁系同源物等，并且关于多核苷酸或蛋白质序列的术语“同源的”旨在意指相似的或相同的序列。此ft同源物还可定义为具有与已知ft基因相同的或相似的生物功能(例如，当在植物中异位地表达时，起作用来相似地影响开花和/或其他生殖或产量相关的性状或表型)。
47.来自不同植物物种的ft蛋白质序列的序列分析和比对进一步揭示保守氨基酸残基的数量和至少一个保守结构域。通过使用pfam数据库(例如，2011年11月发布的pfam版本26.0或最新版本)使各比对的ft蛋白质序列(参见，例如，图1b和图1c)经受蛋白质结构域识别工具处理，发现这些ft蛋白包含并且共享推定的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(pebp)结构域(pfam结构域名称：pbp_n；登录号：pf01161)的至少一部分。参见，例如，banfield，mj等人，“the structure of antirrhinum centroradialis protein(cen)suggests a role as a kinase inhibitor,”journal of mol biol.，297(5)：1159-1170(2000)，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。发现此pebp结构域例如对应于全长gm.ft2a蛋白的氨基酸28至162(参见以下表5)。因此，由本发明的实施方案涵盖的ft蛋白可包括根据pfam分析识别或表征为具有或含有至少pebp结构域(登录号：pf01161)的那些蛋白质。因此，本发明还可包括编码具有至少pebp结构域的ft蛋白的多核苷酸序列。如本领域中已知的，“pfam”数据库是多序列比对和隐马尔科夫模型的大集合，其覆盖许多普通蛋白质家族并且包含关于各种蛋白质家族以及其结构域结构的信息。通过识别给定蛋白质序列的推定pfam结构域，可推断或确定所述蛋白质的类别和功能。参见，例如，finn，rd等人，“the pfam protein families database,”nucleic acids research(数据库问题)，42:d222-d230(2014)，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。
48.本发明的实施方案还可包括编码诱导性或促花ft蛋白的多核苷酸序列。如果由多核苷酸序列编码的ft蛋白在植物中异位地表达时能够引起较早开花和/或引起植物的每一个或多个苤节的花、豆荚和/或种子的数量的出产力增加，则所述ft蛋白可以是“诱导性的”或“促花的”。在不受任何理论约束的情况下，植物的每个苤节的花、豆荚和/或种子的数量的此出产力增加可由在这些苤节处经历营养至生殖转变并且产生花的分生组织的数量的增加引起。由于“促花”ft的异位表达引起的在每个苤节处的此出产力增加可能是由于在每
个苤节处早期总状花序和侧生分生组织的释放和花发育的同步增加而引起。虽然“促花”ft蛋白当在植物中异位地表达时可起作用来诱导较早开花，但是转基因表达的“促花”ft蛋白可通过独立于与开花时间和/或生殖持续时间相关的任何促花效应或除所述任何促花效应之外的一种或多种途径或机制增加植物的每个苤节的花、豆荚和/或种子的数量。
49.来自各种植物物种的促花ft样基因通常是高度保守的。然而，pebp家族中的许多蛋白质具有与促花ft蛋白基本上相似的氨基酸序列，但是不表现为促花素。例如，来自各种植物物种的顶生花(tfl)基因具有与促花ft基因相似的蛋白质序列，但是实际上使开花延迟。最近的研究已识别通常在促花ft蛋白与其他pebp蛋白(诸如tfl)之间不共享的特定氨基酸残基，并且已经显示在许多这些位置处的取代将促花ft蛋白转化为成花阻遏蛋白。参见，例如，ho和weigel，plant cell 26：552-564(2014)；danilevskaya等人，plant physiology146(1)：250-264(2008)；harig等人，plant journal 72：908-921(2012)；hsu等人，plant cell 18：1846-1861(2006)；kojima等人，plant cell physiology 43(10)：1096-1105(2002)；kong等人，plant physiology 154：1220-1231(2010)；molinero-rosales等人，planta 218：427-434(2004)；zhai等人，plos one，9(2)：e89030(2014)，以及wickland dp等人(2015)，同上，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。因此，这些氨基酸残基可充当进一步定义并区分本发明的促花ft蛋白的特征。
50.根据本发明的实施方案，“诱导性”或“促花”ft蛋白还可定义或表征为包含以下氨基酸残基中的一种或多种(氨基酸位置是指全长拟南芥ft蛋白(seq id no:14)的对应位置)：在氨基酸位置21处的脯氨酸(p21)；在氨基酸位置44处的精氨酸或赖氨酸(r44或k44)；在氨基酸位置57处的甘氨酸(g57)；在氨基酸位置59处的谷氨酸或天冬氨酸(e59或d59)；在氨基酸位置85处的酪氨酸(y85)；在氨基酸位置128处的亮氨酸(l128)；在氨基酸位置129处的甘氨酸(g129)；在氨基酸位置132处的苏氨酸(t132)；在氨基酸位置135处的丙氨酸(a135)；在氨基酸位置138处的色氨酸(w138)；在氨基酸位置146处的谷氨酸或天冬氨酸(e146或d146)；和/或在氨基酸位置164处的半胱氨酸(c164)。其他ft蛋白的对应氨基酸位置可通过与拟南芥ft序列进行比对来确定(参见，例如，图1c)。本领域技术人员将能够基于其序列比对识别其他ft蛋白的对应氨基酸位置。这些关键残基中的若干个落在ft样蛋白的外部环状结构域内，所述结构域定义为拟南芥全长ft序列(seq id no:14)和其他ft蛋白的对应序列的氨基酸128至145(参见，例如，图1c)。因此，本发明的多核苷酸可编码具有这些保守氨基酸残基中的一种或多种的促花ft蛋白。
51.本发明的促花ft蛋白还可在一个或多个以上识别的残基位置处具有一种或多种其他氨基酸。例如，参考拟南芥ft(at.ft)蛋白质序列(seq id no:14)的以上氨基酸位置，促花ft蛋白可以可替代地具有以下氨基酸中的一种或多种：在对应于at.ft蛋白质序列的位置21的位置处的丙氨酸(代替脯氨酸)(p21a)或在此位置处可能的其他小的非极性残基(诸如甘氨酸或缬氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置44的氨基酸位置处的组氨酸(代替赖氨酸或精氨酸)或在此位置处可能的其他极性氨基酸；在对应于at.ft蛋白质序列的位置57的氨基酸位置处的丙氨酸或半胱氨酸(代替甘氨酸)或在此位置处可能的其他小的非极性残基(诸如脯氨酸或缬氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置59的氨基酸位置处的天冬酰胺或丝氨酸(代替谷氨酸或天冬氨酸)或在此位置处可能的其他小的极性残基(诸如谷氨酰胺、半胱氨酸或苏氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置85的氨基酸位置处的各
种极性和非极性不带电荷残基(除了酪氨酸以外)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置128的氨基酸位置处的非极性或疏水性不带电荷残基(除了亮氨酸以外)(诸如异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置129的氨基酸位置处的各种较小的非极性和不带电荷残基(除了甘氨酸以外)(诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸等)，但是在此位置处可容忍一些极性和带电荷残基；在对应于at.ft蛋白质序列的位置132的氨基酸位置处的极性不带电荷残基(除了苏氨酸以外)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置135的氨基酸位置处的各种氨基酸(除了脯氨酸以外，诸如苏氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置138的氨基酸位置处的各种其他大的非极性或疏水氨基酸(代替色氨酸)(诸如甲硫氨酸或苯丙氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置146的氨基酸位置处的各种其他极性或非正电荷氨基酸(诸如天冬酰胺或丝氨酸)；和/或在对应于at.ft蛋白质序列的位置164的氨基酸位置处的各种其他极性或非极性氨基酸(代替半胱氨酸)(诸如异亮氨酸)。本领域技术人员将能够基于其与拟南芥ft蛋白质序列的序列比对来识别ft蛋白的对应氨基酸位置和取代。此外，基于蛋白质生物化学领域的技术人员的知识，其他化学上保守的氨基酸取代也涵盖在促花ft蛋白的范围内。因此，本发明的多核苷酸还可编码具有一个或多个保守氨基酸取代的促花ft蛋白。实际上，由本发明的多核苷酸编码的促花ft蛋白包含自然序列和人工序列以及其功能性片段，所述自然序列和人工序列包含一个或多个保守氨基酸取代。
52.本发明的促花ft蛋白还可定义为排除(即，不具有)可具有tfl或其他非促花或抗促花蛋白质的特征或与所述蛋白质相关联的一个或多个氨基酸取代。例如，参考拟南芥ft蛋白质序列(seq id no:14)的氨基酸位置，促花ft蛋白可排除以下氨基酸中的一种或多种：在对应于at.ft蛋白质序列的位置21的位置处的苯丙氨酸或丝氨酸(例如，代替脯氨酸或丙氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置44的位置处的苯丙氨酸(例如，代替精氨酸或赖氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置57的位置处的组氨酸、谷氨酸或天冬氨酸(例如，代替甘氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置59的位置处的甘氨酸或丙氨酸(例如，代替谷氨酸或天冬氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置85的位置处的组氨酸(例如，代替酪氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置109的位置处的赖氨酸、精氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸；在对应于at.ft蛋白质序列的位置128的位置处的赖氨酸或精氨酸(例如，代替亮氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置129的位置处的谷氨酸或天冬氨酸(例如，代替甘氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置132的位置处的缬氨酸或半胱氨酸(例如，代替苏氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置134的位置处的赖氨酸、精氨酸或丙氨酸(例如，代替酪氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置135的位置处的脯氨酸(例如，代替丙氨酸或苏氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置138的位置处的丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸或精氨酸(例如，代替色氨酸或甲硫氨酸)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置140的位置处的赖氨酸或精氨酸；在对应于at.ft蛋白质序列的位置146的位置处的赖氨酸或精氨酸(例如，代替酸性或不带电荷极性残基)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置152的位置处的赖氨酸或精氨酸；和/或在对应于at.ft蛋白质序列的位置164的位置处的丙氨酸(例如，代替半胱氨酸或异亮氨酸)。本领域技术人员将能够基于其序列比对来识别其他ft蛋白的对应氨基酸位置和取代。因此，本发明的实施方案可排除编码具有一个或多个与tfl或其他抗促花素相关联的以上氨基酸取代的ft样蛋白质的多核苷酸。然而，ft蛋白可容忍这些
氨基酸取代中的一个或一些取代，同时仍然维持促花活性。
53.本发明的促花ft蛋白还可定义为与已知ft蛋白相似，除了具有以上特征氨基酸残基中的一种或多种之外。例如，促花蛋白可定义为与选自由以下组成的组的序列或其功能性片段具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、以及seq id no:20，除以下特征残基中的一种或多种之外：在对应于at.ft蛋白质序列的位置85的氨基酸位置处的酪氨酸或其他不带电荷极性或非极性残基(例如，丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、丝氨酸或天冬酰胺)；在对应于at.ft蛋白质序列的位置128的氨基酸位置处的亮氨酸或其他非极性或疏水性残基(例如，异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸)；和/或在对应于at.ft蛋白质序列的位置138的氨基酸位置处的色氨酸或其他大的非极性或疏水性残基(例如，甲硫氨酸或苯丙氨酸)。此促花ft蛋白还可定义为具有另外的特征氨基酸残基，诸如以下中的一种或多种：在对应于at.ft蛋白质序列的位置129的氨基酸位置处的甘氨酸或其他小的非极性和不带电荷残基(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸)；和/或在对应于at.ft蛋白质序列的位置132的氨基酸位置处的苏氨酸。
54.本发明的促花ft蛋白还可定义为与选自由以下组成的组的序列或其功能性片段具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、以及seq id no:20，但是不具有(即，排除)一种或多种非促花或抗促花残基，诸如以下中的一种或多种：在对应于at.ft蛋白质序列的位置85的氨基酸位置处的组氨酸；在对应于at.ft蛋白质序列的位置128的氨基酸位置处的赖氨酸或精氨酸；和/或在对应于at.ft蛋白质序列的位置138的氨基酸位置处的丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸。此促花ft蛋白还可定义为不具有(即，排除)一种或多种另外的残基，诸如以下中的一种或多种：在对应于at.ft蛋白质序列的位置129的氨基酸位置处的谷氨酰胺或天冬酰胺；和/或在对应于at.ft蛋白质序列的位置132的氨基酸位置处的缬氨酸或半胱氨酸。
55.开花基因座t(ft)基因在高等植物中发挥关键作用，并且起作用来整合开花途径。已经显示ft蛋白充当从叶转运到枝顶端的移动信号或促花素，在所述枝顶端处，所述移动信号或促花素触发各种不同物种中的生殖发育的启动。参见，例如，jaeger，k.e.等人，“interlocking feedback loops govern the dynamic behavior of the floral transition in arabidopsis,”the plant cell，25:820-833(2013)；corbesier，l等人，“ft protein movement contributes to long distance signaling in floral induction of arabidopsis,”science 316：1030-1033(2007)；jaeger，ke等人，“ft protein acts as a long range signal in arabidopsis,”curr biol17：1050-1054(2007)；以及amasino，r.m.等人，“the timing of flowering,”plant physiology，154(2):516-520(2010)，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。在拟南芥中，ft蛋白在分生组织中结合到14-3-3蛋白和开花基因座d(fd)蛋白，以在枝顶端处形成触
发关键性花分生组织决定基因激活的开花复合物，所述基因诸如apetatal1(ap1)和soc1。参见，例如，taoka，k.等人，“14-3-3protein act as intracellular receptors for rice hd3a florigen,”nature476:332-335(2011)。顶生花1(tfl1)基因是ft靶标维持枝顶端分生组织(sam)在营养状态中的中心的关键阻遏子。tfl1通过抑制leafy(lfy)和ap1基因来起作用。因此，靶组织中的ft和tfl1的相对浓度竞争性地用于控制分生组织从营养状态到生殖转变的时间，所述生殖转变可终止进一步的营养生长。。参见，例如，abe，m等人，science 309:1052-1055(2005)；以及mcgarry，rc等人，plant science188/189：71-81(2012)。
56.已识别来自许多不同物种的ft基因，并且已报道诱导早期开花的异位ft表达。参见，例如，kong，f.等人，“two coordinately regulated homologs of flowering locus t are involved in the control of photoperiodic flowering in soybean,”plant physiology 154：1220-1231(2010)；turck，f.等人，“regulation and identity of florigen：flowering locus t moves center stage,”ann rev plant biol 59：573-594(2008)；blackman，bk等人，“the role of recently derived ft paralogsin sunflower domestication,”curr biol 20：629-635(2010)；lifschitz，e.等人，“the tomato ft orthologs triggers systemic signals that regulate growth and flowering and substitute for diverse environmental stimuli,”pnas 103：6398-6403(2006)；trankner，c.等人，“over-expression of an ft-homologous gene of apple induces early flowering in annual and perennial plants,”planta 232：1309-1324(2010)；xiang，l.等人，“functional analysis of flowering locus t orthologs from spring orchid(cymbidium goeringii rchb.f.)that regulates the vegetative to reproductive transition,”plant cell&biochem 58：98-105(2012)，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。然而，关于ft转基因表达的先前研究使用组成型或组织特异性启动子，所述启动子产生非常严重的表型、非细胞自发性(系统性)表型、或自发性叶特异性表型，其中植物或幼苗比对照物更早开花并且在发育早期阶段终止。鉴于这些发现，异位ft表达通常并不被视为通过诱导花或改变开花时间来增加植物产量的可行方法。
57.根据本发明的实施方案，提供一种重组dna分子或多核苷酸，其包含可操作地连接到一种或多种启动子和/或其他调控元件的编码ft蛋白的多核苷酸编码序列，所述启动子和/或调节元件可在植物细胞中起作用以便当转化到植物中时控制或影响ft表达的时间和/或位置。如本领域中通常理解的，术语“启动子”可通常是指含有rna聚合酶结合位点、转录起始位点和/或tata盒并且协助或促进相关可转录多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达的dna序列。启动子可从已知的或天然存在的启动子序列或其他启动子序列(例如，如本文所提供的)合成产生、改变或得出。启动子还可包括含有两种或更多种异源序列的组合的嵌合启动子。本发明的启动子因此可包含与已知的或本文所提供的其他启动子序列组成相似但是并不相同的启动子序列的变体。如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子或其他调控元件与基因(或转基因)的相关可转录多核苷酸序列或编码序列之间的功能性连接，使得启动子等至少在特定组织、发育阶段中和/或在某些条件下起作用来启动、协助、影响、引起和/或促进相关编码序列或可转录序列的转录和表达。
58.启动子可根据与可操作地连接到启动子的编码序列或基因(包括转基因)的表达
模式相关的各种标准来分类，诸如组成型、发育型、组织特异型、诱导型等。在植物的所有或大多数组织中启动转录的启动子被称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段启动转录的启动子被称为“发育”启动子。其表达在植物的某些组织中相对于其他植物组织得到增强的启动子被称为“组织增强”或“组织优选”启动子。因此，“组织优选”启动子在植物的特定组织中引起相对较高或优先的表达，但是在植物的其他组织中表达水平较低。在植物的特定组织中表达、在其他植物组织中很少表达或不表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。在植物的某一细胞类型中表达的启动子被称为“细胞类型特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应于环境刺激(诸如寒冷、干旱或光照)或其他刺激(诸如伤害或化学应用)而启动转录的启动子。启动子还可根据其起源(诸如异源的、同源的、嵌合的、合成的等)来分类。“异源”启动子是相对于其相关可转录序列、编码序列或基因(或转基因)具有不同的起源并且/或者在待转化的植物物种中非天然存在的启动子序列。术语“异源”可广泛地是指两个或更多个dna分子或序列的组合(当此组合通常在自然界中不存在时)。
59.根据本发明的实施方案，提供一种重组dna分子或多核苷酸，其包含可操作地连接到在植物中起作用的启动子的促花ft转基因或编码序列，所述重组dna分子或多核苷酸可引入或转化到植物中以使植物具有改变的开花、生殖和/或产量相关的性状或表型。因为认为ft蛋白在植物的分生组织(包括顶端和/或腋生分生组织)中起作用来触发这些分生组织的成花转变并且诱导开花，本发明的实施方案提供一种重组dna分子，其包含可操作地连接到“营养阶段”启动子的ft转基因或编码序列，以便当引入或转化到植物中时引起ft转基因在植物发育早期(即，在植物的营养生长阶段期间)表达，以在相同的发育阶段在靶组织中产生比以其他方式发生在野生型植物中的增加的ft水平。在发育的营养阶段期间的定时ft转基因表达对于通过提供及时诱导信号来影响一种或多种生殖、开花和/或产量相关性状或表型以用于在植物的一个或多个苤节处产生增加的数量的花分生组织和成功的花可能是重要的。在不受任何理论约束的情况下，ft转基因在植物中的营养阶段表达可起作用来在一个或多个苤节处同步和/或增加早期开花以便产生植物的每个苤节更多的花。作为本发明的一部分的以下所述的启动子提供用于定时ft表达的选项。
60.如本文所用，“营养阶段”启动子包括在植物发育的一个或多个营养阶段期间(诸如在ve、vc、v1、v2、v3、v4等中的一个或多个期间和/或在发育的任何或所有晚期营养阶段(例如，多至vn阶段)期间)启动、引起、驱动等其相关基因(或转基因)的转录或表达的任何启动子。此“营养阶段”启动子还可定义为在植物发育的一个或多个营养阶段(与生殖阶段相反)期间至少优选地或几乎全部地(若非排他地)启动、引起、驱动等其相关基因(或转基因)的转录或表达。然而，“营养阶段”和“营养阶段优选”启动子也可各自在植物的一个或多个细胞或组织中在发育的生殖阶段期间允许、容许、引起等其相关基因(或转基因)的转录或表达。给定植物物种的这些营养阶段的特征和特性是本领域中已知的。对于双子叶植物，植物在发育的营养阶段期间的营养形态学特征和特性可包括子叶形式、营养分生组织(顶端、侧生/腋生和根)、叶序、叶形状、叶缘、叶脉序、叶柄、托叶、托叶鞘、下胚轴、以及根。根据本发明的实施方案，“营养阶段”启动子还可通过特定营养阶段来定义，在所述特定营养阶段期间，首先启动其相关基因(或转基因)的可观察到的或明显的转录或表达。例如，营养阶段启动子可以是vc阶段启动子、v1阶段启动子、v2阶段启动子、v3阶段启动子等。由此，“vc阶段”启动子定义为在植物发育的vc阶段期间首先启动其相关基因(或转基因)的转录的营
养阶段启动子，“v1阶段”启动子定义为在植物发育的v1阶段期间首先启动其相关基因(或转基因)的转录的营养阶段启动子，“v2阶段”启动子定义为在植物发育的v2阶段期间首先启动其相关基因(或转基因)的转录的营养阶段启动子，以此类推，虽然相关基因(或转基因)的表达可在发育的晚期营养阶段期间在一个或多个组织中连续地或不连续地存在。本领域技术人员将能够使用本领域已知的各种分子测定和技术确定给定基因(或转基因)在植物发育期间的表达的时间。
61.根据本发明的实施方案，“营养阶段”启动子可包括组成型启动子、组织优选启动子或组织特异性启动子。例如，营养阶段启动子可在植物发育的营养阶段期间在一个或多个植物组织中(诸如在根、茎、单片叶/多片叶、分生组织等中的一个或多个中)驱动ft表达。然而，此营养阶段启动子可优选地驱动其相关ft转基因或编码序列在植物的一个或多个分生组织中表达。根据许多实施方案，“营养阶段”启动子可优选地是“分生组织特异性”启动子或“分生组织优选”启动子，以引起ft转基因或编码序列在分生组织中表达。已知ft蛋白在植物的分生组织中起作用以有助于在ft蛋白从叶移位之后触发从营养生长至生殖生长的转变。相比之下，本发明的实施方案提供ft转基因直接在植物的分生组织中的选择性表达，以诱导开花并且使植物具有改变的生殖和/或产量相关的性状或表型。因此，根据本发明的实施方案，提供一种重组dna分子，其包含可操作地连接到“分生组织特异性”或“分生组织优选”启动子的ft转基因或编码序列，所述启动子在所述重组dna分子转化到植物中时驱动ft转基因至少优先地在植物的一个或多个分生组织中表达。如本文所用，“分生组织优选启动子”是指在植物的至少一个分生组织中相对于其他植物组织优先地引起相关基因或转基因表达的启动子，而“分生组织特异性启动子”是指引起相关基因或转基因排他地(或几乎排他地)在植物的至少一个分生组织中表达的启动子。
62.在发育的营养阶段期间使用人工早期“短日照”光照处理的最新研究揭示，开花时间可以改变一种或多种产量相关性状或表型(例如，通过使植物上的每个苤节的豆荚或种子的数量增加)的方式来改变，并且这些处理的效应根据(i)短日照暴露的持续时间(即，成花诱导信号剂量)和(ii)在长日照条件下短日照后光周期的长度(即，短日照诱导信号之后营养生长诱导信号的剂量或长度)对于每株植物(和/或植物的每个苤节)的花、种子和/或豆荚的数量是剂量依赖性的。参见，例如，在以上引入的美国专利号8,935,880和美国专利申请公开号2014/0259905。经历较低或较少延长的早期短日照诱导(esdi)处理(之后返回到长日照生长条件)的大豆植物每株植物具有更多的花、豆荚和种子，具有更多正常的植物高度和成熟度，而暴露于较大或较多延长的esdi处理的大豆植物产生更短、更早终止的植物，每株植物具有更少豆荚和种子(虽然可能每个苤节的的豆荚和/或种子数量增加)。
63.在不受任何理论约束的情况下，提出早期促花信号(例如，对于大豆和其他sd植物的短日照)触发植物的早期营养至生殖转变并且甚至触发其初生分生组织的亚组的终止。然而，通过在初始sd信号之后将这些植物返回到非诱导性生长条件(例如，对于sd植物的长日照)，可保存植物的剩余分生组织储量并且/或者可延长或维持营养和/或开花持续时间，从而使每个苤节(和/或每株植物)在生殖阶段期间成功发育更多数量的生产性花、豆荚和/或种子。在早期成花诱导的情况下，也可以在植物的生殖发育与营养生长之间产生较大的重叠，这可进一步促进延长的生殖和/或开花持续时间或与其一致。出于本发明的目的，“生殖持续时间”是指从开花开始直至种子/豆荚发育和/或填充结束为止的时间长度，而“开花
持续时间”或“开花的持续时间”是指从第一朵开放的花出现直至最后一朵开放的花完结为止的时间长度。通过在早期成花诱导之后返回到非诱导性生长条件，更多丰富的资源可以是可用的并且针对每株植物增加的数量的成功的(即，非中断的)花、豆荚和/或种子的产生，这与短日照植物的正常花发育不同，所述正常花发育由于植物的分生组织生长和成熟终止而可与下降的植物资源一致。
64.然而，除早期开花之外，成花诱导信号(例如，早期短日照条件)也引起植物的早期终止。因此，提出可能需要成花诱导信号的最佳剂量和时间，以通过使(i)早期营养至生殖转变和/或开花与早期成花诱导信号的同步(导致在植物的每个苤节处的潜在产量增加)相对于(ii)较早生长终止(引起较小的植物，每株植物具有较少节间、较少分枝和较少苤节和/或花)平衡来使产量最大化。认为成花诱导信号的较低剂量可能足以诱导开花，同时使植物的较早终止减少或最小化，使得产生较大植物，每个苤节(和/或每株植物)的花、豆荚和/或种子数量增加。在另一方面，成花诱导信号的较高剂量可能引起植物的早期终止(除早期开花之外)以产生较小植物，其由于较小植物大小、每株植物具有较少节间和/或分枝而具有相对较少数量的花、豆荚和/或种子，虽然在正常生长条件下相对于野生型或对照植物可能在每个苤节(和/或每株植物)中具有更大数量的花、豆荚和/或种子。如以上所陈述的，异位ft表达的这些效应还可包括根据具体植物物种，增加每个苤节(和/或每株植物)的棉铃、长角果、果实、坚果、块茎等的数量。
65.如以上所提及的，大豆的短日照诱导表型用于通过转录作图筛选在这些植物中具有改变的表达的基因。这些研究实现对响应于短日照诱导处理而具有增加的表达的内源性ft基因gm.ft2a的识别。因此，现在提出促花ft转基因的表达可用作成花诱导信号以引起早期开花和相对于不具有ft转基因的野生型或对照植物增加的每个苤节(和/或每株植物)的花、豆荚和/或种子。根据本发明的实施方案，促花ft表达在发育的营养阶段期间的时间、位置和剂量的适当控制可用于诱导开花并且产生相对于不具有ft转基因的野生型或对照植物的每个苤节具有增加的花、豆荚和/或种子的植物。不尝试瞬时表达ft并且概括说明esdi处理的时间，而是提出ft可在营养分生组织中微弱地表达以提供早期成花诱导信号。因此，选择来自在发育的营养阶段期间具有弱分生组织表达的erecta基因(perecta或per)的启动子用于gm.ft2a转基因的初始测试。然而，鉴于先前研究显示组成型ft表达产生具有严重的早期终止表型的植物，并且另外，在外周产生并从叶中移位的ft的作用位点是在分生组织中，因此可能的是，ft的直接分生组织表达可能产生相对于组成型ft表达甚至更强效且严重的表型(和/或不能生育植物)。
66.gm.ft2a过表达的效应立即可见于r0转化的大豆植物中，所述大豆植物具有早期开花、减少的种子产量(例如，仅约8个种子/植物)和非常早的终止，从而表明成花诱导与成花抑制/营养生长之间的平衡极大地有利于开花和早期终止。然而，从这些植物挽回了足够的r1种子以允许进行另外的实验。提出，在温室中在长日照(成花抑制性)光周期条件下生长r1大豆种子可使在r0植物中观察到的早期开花和终止表型延迟。鉴于理论剂量响应，还提出分离的ft2a纯合的、半合子的和无转基因的大豆植物可一起在温室中进行测试以评估由ft过表达引起的剂量响应。在这些实验(如以下进一步描述的)中，观察到分离的植物确实具有不同的表型：无转基因植物在植物构造和每个苤节(和每株植物)的豆荚方面与野生型植物类似，而纯合植物以严重的矮化表型早期地终止(虽然可能每个苤节的豆荚数量增
加)。然而，半合子植物与无转基因或野生型植物几乎一样大，但是表现出高度开花表型和增加的每个苤节(和/或每株植物)的豆荚数量。这些发现显示促花ft转基因的营养阶段和/或分生组织表达可用于产生高产植物(与esdi处理相似)，并且ft表达的效应是剂量依赖性的，因为在弱分生组织启动子控制下对于ft2a转基因是半合子的大豆植物显示出增加的每个苤节的豆荚的高产表型，而没有使用纯合ft2a植物在长日照(营养)条件下生长时观察到较严重的早期终止和短植物高度表型。
67.然而，有趣的是，每个苤节的豆荚数量增加经常在温室条件下独立于生殖(r1-r7)持续时间而观察到，并且在所测试的ft转基因中与早期开花不完全相关，虽然可能的是，即使总生殖持续时间相对于对照植物并未显著地改变，开花的持续时间在一些情况下(至少在一个或多个生殖阶段期间)仍可能延长。在不受任何理论约束的情况下，认为转基因ft植物中每个苤节的豆荚数量增加可至少部分地由在每个受影响苤节处从营养枝顶端和腋生分生组织诱导的花序和花分生组织的数量的增加而引起，这可在这些苤节处产生更大数量的花和/或释放的花总状花序。响应于ft过表达而在植物的每个苤节处诱导的花分生组织数量的此增加可通过一种或多种机制或途径来起作用，所述一种或多种机制或途径可独立于开花时间和/或生殖持续时间。然而，分生组织变化最初可能是微观的，并且因此通过简单视觉检验并未观察到在此阶段引起“早期开花”，即使分生组织的生殖变化可能已经开始发生。
68.在不受任何理论约束的情况下，早期营养ft表达可在转基因植物的一个或多个苤节处引起更多生殖分生组织比正常组织更早地形成和发育。这些生殖分生组织然后可允许或引起更大数量的花总状花序在开花的情况下在每个苤节处形成和伸长。在另一方面，另外在理论上，ft在生殖阶段期间的晚期表达可起作用来抑制在每个苤节处的进一步的花发育。因此，在相应总状花序内的晚期发育的花可终止，并且因此更多植物资源可引导到总状花序内的早期发育的花以更有效地产生全尺寸的豆荚。因此，预期通过(i)经由早期ft诱导在每个苤节处形成更大数量的花序和花分生组织，并且然后(ii)经由使晚期发育的花终止将更多的植物资源引导到每个总状花序内的较早期的、发育更多的花，可实现增加的花发育同步，植物的每个苤节形成更大数量的成熟豆荚。
69.根据本发明的实施方案，提供一种重组dna分子，其包含可操作性地连接到营养阶段启动子的ft编码序列，所述启动子还可以是分生组织优选和/或分生组织特异性启动子。例如，启动子可包括来自拟南芥的pat.erecta启动子(seq id no:21)或其功能性片段或部分。根据本发明的pat.erecta启动子的截短部分的两个实例提供为seq id no：22和seq id no：38。参见，例如，yokoyama，r.等人，“the arabidopsis erecta gene is expressed in the shoot apical meristem and organ primordia,”the plant journal 15(3)：301-310(1998)。pat.erecta是营养阶段启动子的实例，所述营养阶段启动子也是分生组织优选的。其他营养阶段启动子、分生组织优选启动子或分生组织特异性启动子已基于其特征性表达谱(参见，例如，以下实施例4和实施例7)来识别，所述启动子也可用于根据本发明的实施方案驱动ft表达。例如，识别以下大豆受体样激酶(rlk)基因，其可用作营养阶段、分生组织优选启动子：glyma10g38730(seq id no：23)、glyma09g27950(seq id no：24)、glyma06g05900(seq id no：25)、以及glyma17g34380(seq id no：26)。根据本发明的实施方案的营养阶段、分生组织优选启动子还可包括来自马铃薯的受体样激酶(rlk)基因启动
子：pgsc0003dmp400032802(seq id no：27)和pgsc0003dmp400054040(seq id no：28)。鉴于驱动ft表达的pat.erecta启动子的本文所提供的特征和针对其他rlk(erecta或erecta样(erl)基因)识别的相似表达谱，本发明的营养阶段启动子、分生组织优选启动子或分生组织特异性启动子还可包括来自其他双子叶物种的在植物分生组织中具有营养阶段表达模式的rlk(erecta和erecta样基因)的任何已知的或随后识别的启动子序列。
70.营养阶段启动子、分生组织优选启动子或分生组织特异性启动子的额外实例可包括来自以下拟南芥基因的那些启动子：pinhead(at.pnh)(seq id no：29)、狭叶龙舌兰(angustifolia)3或at.an3(seq id no：30)、at.myb17(at.lmi2或晚期分生组织同一性(late meristem identity)2；at3g61250)(seq id no：31)、驱动蛋白样基因(at5g55520)(seq id no：32)、ap2/b3样基因(包括at.rem17(seq id no：33)或at.rem19)、以及erecta样1基因和erecta样2基因(at.erl1(seq id no：34)和at.erl2(seq id no：35))、以及其功能性部分。这些启动子(或其功能性片段)的多核苷酸序列也可具有不严格的序列同一性，同时仍然维持可操作地连接到所述启动子的相关基因或转基因的相似或相同的表达模式。例如，启动子可包含与选自以下的多核苷酸序列或其功能性部分至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多核苷酸序列：seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、或seq id no:35。已知的或所提供的启动子序列的“功能性部分”定义为已知的或所提供的启动子序列的一个或多个连续或不连续部分，其可以与已知的或所提供的启动子序列相同或相似的方式功能性地驱动、引起、促进等其相关基因(或转基因)表达。基于本公开，本领域技术人员将能够确定包含已知的或所提供的启动子序列的一个或多个部分和/或具有相对于已知的或所提供的启动子序列的更短序列和/或更不严格序列同一性的启动子在其相关ft转基因在植物中表达时是否引起与已知的或所提供的启动子序列相比相似的表达模式和/或相似的表型或效应。
71.如以上所陈述的，本发明的重组dna分子可通常包含ft转基因或表达盒，其包含可操作性地连接到营养阶段启动子的编码ft蛋白质的多核苷酸序列，所述营养阶段启动子也可以是分生组织优选启动子或分生组织特异性启动子。ft转基因或表达盒的多核苷酸编码序列还可以可操作地连接到一种或多种额外调控元件，诸如增强子、前导序列、转录起始位点(tss)、接头、5’和3’非翻译区、内含子、聚腺苷酸化信号、终止区域或序列等，所述调控元件对于调节或允许ft转基因或盒的表达以在植物细胞中有效地产生ft蛋白是合适的或必要的。此类额外调控元件可以是任选的并且用于增强或优化转基因的表达。出于本发明的目的，“增强子”与“启动子”的区别可在于增强子通常缺少转录起始位点、tata盒或等效序列并且因此不足以单独驱动转录。如本文所用，术语“前导序列”可通常定义为基因(或转基因)在转录起始位点(tss)与蛋白质编码序列起始位点之间的非翻译5
′
区域(5
′
utr)的dna序列。
72.根据本发明的实施方案，关于dna分子、构建体、载体等的术语“重组”是指在自然界中不存在和/或在自然界中不存在的环境中出现的dna分子或序列，其包括含有在无人为干预的情况下将不连续地或一起邻近地天然存在的dna序列的组合的dna分子、构建体等和/或含有彼此异源的至少两个dna序列的dna分子、构建体等。重组dna分子、构建体等可包
含一个或多个dna序列，所述一个或多个dna序列与在自然界中与此类dna序列邻近地存在的其他多核苷酸序列分开；和/或与彼此未自然地邻近的其他多核苷酸序列相邻(或与其相邻)的dna序列。重组dna分子、构建体等还可以是指在细胞外进行基因工程化并构造的dna分子或序列。例如，重组dna分子可包括任何合适的质粒、载体等，并且可包括线性或环状dna分子。此类质粒、载体等可含有各种维护元件(包括原核生物复制起点和选择性标记)以及可能除植物可选择性标记基因之外的ft表达转基因或表达盒等。
73.如以上所介绍的，ft表达的促花效应可被植物分生组织中的各种其他抗促花(或非促花)蛋白(诸如顶生花(tfl)基因)的活性抵抗。开花时间和持续时间可因此视为存在于植物分生组织内的促花信号与抗促花信号之间的平衡。因此，进一步提出，植物的开花时间可通过在发育的营养阶段期间抑制一个或多个抗促花基因以使营养分生组织更易响应于促花信号来改变或诱导。例如，在大豆中，与拟南芥tfl1相关的基因主要在花分生组织中表达，在所述花分生组织中，所述基因抵抗促花信号调节发育决定像茎生长习性的作用。具体地，大豆中的tfl1样基因(tfl1a和tfl1b)在枝顶端分生组织中表达，并且tfl1b的等位基因多样性主要负责导致确定或不确定生长的大豆茎生长习性变化。参见，例如，liu，b.等人，“the soybean stem growth habit gene dt1 is an ortholog of arabidopsis terminal flower1,”plant physiol 153(1):198-210(2010)。因此，抑制tfl或另一种抗促花蛋白在双子叶植物的分生组织中的表达可导致这些分生组织对促花信号(诸如ft)的敏感性增加，从而导致早期开花和每个苤节的豆荚增加，这与ft在这些组织中的过表达相似。
74.因此，预期本发明的重组dna分子还可包含具有可操作性地连接到营养阶段启动子的可转录dna序列的抑制构建体，所述营养阶段启动子还可以是分生组织优选启动子或分生组织特异性启动子，其中所述可转录dna序列编码引起内源性抗促花基因(诸如tfl基因)的靶向抑制的rna分子。用于抑制内源性基因的表达的各种方法是本领域中已知的。
75.根据本发明的另一个广泛方面，提供用于使用包含ft转基因或表达盒的重组dna分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体以产生转基因植物的方法。用于使用重组dna分子转化植物细胞中的染色体的多种方法是本领域中已知的，所述方法可根据本发明的方法用于产生转基因植物细胞和植物。本领域中已知的用于转化植物细胞的任何合适的方法或技术可根据本发明的方法使用。用于转化植物的有效方法包括细菌介导的转化(诸如土壤杆菌介导的或根瘤菌介导的转化)和微粒轰击介导的转化。用于通过细菌介导的转化或微粒轰击使用转化载体转化外植体并且随后培养等这些外植体以使转基因植物再生或发育的各种方法是本领域中已知的。用于植物转化的其他方法也是本领域中已知的，诸如显微注射、电穿孔、真空渗入、加压、超声处理、碳化硅纤维搅动、peg介导的转化等。通过这些转化方法产生的转基因植物根据所使用的方法和外植体对于转化事件可以是嵌合的或非嵌合的。还提供用于在营养阶段启动子控制下在一个或多个植物细胞或组织中表达ft转基因的方法，所述营养阶段启动子还可以是分生组织优选启动子或分生组织特异性启动子。此类方法可用于改变植物的开花时间和/或相对于不具有ft转基因的野生型或对照植物的植物的每个苤节的生产性或成功性花、果实、豆荚和/或种子的数量。实际上，本发明的方法可用于改变转基因植物的生殖或产量相关表型或性状。
76.靶植物材料或外植体的转化可在营养培养基(例如，允许细胞在体外生长的营养物的混合物)上的组织培养物中进行实践。受体细胞靶标或外植体可包括但不限于分生组
织、枝尖端、原生质体、下胚轴、愈伤组织、未成熟或成熟胚芽、枝、芽、苤节部分、叶、配子细胞(诸如小孢子)、花粉、精子和卵细胞等或其任何合适的部分。预期任何可转化的细胞或组织(可育植物可由其再生或生长/发育)可用作用于转化的靶标。转化的外植体、细胞或组织可经受另外的培养步骤，诸如愈伤组织诱导、选择、再生等，如本领域中已知的。含有重组dna插入物的转化的细胞、组织或外植体可根据本领域中已知的方法在培养物、岩颈(plug)或土壤中生长、发育或再生成转基因植物。转基因植物还可与自身或其他植物杂交以产生转基因种子和子代。转基因植物还可通过将包含重组dna序列或转化事件的第一植物与缺少插入物的第二植物杂交来制备。例如，可将重组dna序列引入到可经受转化的第一植物品系中，所述第一植物品系然后可与第二植物品系杂交以使重组dna序列渗入到第二植物品系中。这些杂交种的子代还可多次(诸如6至8代或逆交)回交成更合需要的品系，以产生具有与原始亲本品系基本上相同的基因型但引入了重组dna序列的子代植物。
77.本发明的重组dna分子或构建体可包含在dna转化载体内以用于在靶植物细胞、组织或外植体的转化中使用。本发明的此转化载体可大体上包含除ft表达转基因或表达盒之外对于有效转化所必要或有益的序列或元件。对于土壤杆菌介导的转化，转化载体可包含具有两个边缘序列(左边缘(lb)和右边缘(rb))的工程化转移dna(或t-dna)片段或区域，所述两个边缘序列侧接至少ft表达转基因或表达盒，使得t-dna到植物基因组中的插入将产生ft转基因或表达盒的转化事件。换言之，ft转基因或表达盒可能与另外的转基因或表达盒一起位于t-dna的左边缘与右边缘之间，所述另外的转基因或表达基因诸如可将具有农学意义的性状或表型赋予到植物的植物可选择性标记转基因和/或具有农学意义的其他基因。除蛋白质编码序列之外，具有农学意义的基因还可包含编码rna抑制元件的多核苷酸序列。根据替代性实施方案，ft转基因或表达盒和植物可选择性标记转基因(或具有农学意义的其他基因)可存在于相同的或不同的重组dna分子上的单独t-dna片段中，诸如用于共转化。转化载体或构建体还可包含原核生物维护元件，用于土壤杆菌介导的转化的所述维护元件可位于t-dna区域外侧的载体骨架中。
78.在本发明的转化载体或构建体中的植物可选择性标记转基因由于选择剂(诸如抗生素或除草剂)的存在而可用于协助选择转化的细胞或组织，其中植物可选择性标记转基因提供对于选择剂的耐受性或抗性。因此，选择剂可促成或有利于表达植物可选择性标记基因的转化的细胞的存活、发育、生长、增殖等，诸如以增加r0植物中的转化的细胞或组织的比例。常用植物可选择性标记基因包括例如赋予对抗生素的耐受性或抗性的标记基因或赋予对除草剂的耐受性或抗性的标记基因，所述抗生素诸如卡那霉素和巴龙霉素(nptii)、潮霉素b(aph iv)、链霉素或壮观霉素(aada)和庆大霉素(aac3和aacc4)，所述除草剂诸如草铵膦(bar或pat)、麦草畏(dmo)和草甘膦(aroa或epsps)。还可使用植物可筛选性标记基因，其提供视觉地筛选转化体的能力，诸如荧光素酶或绿荧光蛋白(gfp)、或表达β葡糖醛酸酶的基因或对于其各种生色底物已知的uida基因(gus)。
79.根据本发明的实施方案，用于使用重组dna分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体的方法还可包括定点整合或靶向整合。根据这些方法，重组dna供体模板分子(即，插入序列)的一部分可插入或整合在植物基因组内的所需位点或基因座处。供体模板的插入序列可包括转基因或构建体，诸如包含可操作性地连接到营养阶段启动子的编码促花ft蛋白的多核苷酸序列的ft转基因或构建体，所述营养阶段启动子还可以是分生组织优选启动子
或分生组织特异性启动子。供体模板还可具有一个或两个同源臂，其侧接插入序列以通过同源重组和/或同源定向修复促进靶向插入事件。因此，本发明的重组dna分子还可包含用于将转基因或构建体(诸如ft转基因或构建体)定点或靶向整合到植物的基因组中的供体模板。
80.可潜在地选择植物的基因组内的任何位点或基因座以用于将本发明的转基因或构建体定点整合。针对定点整合，首先使用位点特异性核酸酶在所选择的基因组基因座处形成双链断裂(dsb)或缺口，所述核酸酶例如像锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、tale-内切核酸酶、或rna引导的内切核酸酶(例如，cas9或cpf1)。可使用本领域中已知的用于定点整合的任何方法。在供体模板分子存在下，然后可通过在供体模板的同源臂与植物基因组之间进行同源重组或通过非同源末端连接(nhej)来修复dsb或缺口，从而导致插入序列定点整合到植物基因组中以在dsb或缺口的位点处形成靶向插入事件。因此，可实现转基因或构建体的位点特异性插入或整合。
81.根据本发明的实施方案，可使用包含ft转基因的重组dna分子或转化载体转化的植物可包括各种开花植物或被子植物，其可进一步定义为包括各种双子叶的(双子叶)植物物种，诸如大豆、棉花、苜蓿、油菜、糖用甜菜、苜蓿以及其他豆科植物。双子叶植物可以是以下各项中的一员：芸苔属某种(例如，油菜、芜菁、芥菜)(尤其是可用作种子油的来源的芸苔属)、苜蓿(紫花苜蓿)、向日葵(向日葵(helianthus annuus))、红花(红花(carthamus tinctorius))、油棕(油棕属某些种(elaeis spp.))、芝麻(芝麻属某些种(sesamum spp.))、椰子(椰子属某些种(cocos spp.))、大豆(大豆(glycine max))、烟草(烟草(nicotiana tabacum))、马铃薯(马铃薯(solanum tuberosum))、花生(落花生(arachis hypogaea))、棉花(海岛棉(gossypium barbadense)、陆地棉(gossypium hirsutum))、甘薯(番薯(ipomoea batatus))、木薯(木薯(manihot esculenta))、咖啡(咖啡属某些种(coffea spp.))、茶(山茶属某些种(camellia spp.))、果树(诸如苹果(苹果属某些种(malus spp.))、李属某些种(诸如李子、杏、桃、樱桃等)、梨(梨属)、五花果(无花果(ficus casica))、香蕉(芭蕉属某些种(musa spp))等)、柑橘树(柑橘属某些种(citrus spp.))、可可(可可树(theobroma cacao))、鳄梨(鳄梨(persea americana))、橄榄(油橄榄(olea europaea))、杏仁(巴旦杏(prunus amygdalus))、胡桃(胡桃属某些种(juglans spp.))、草莓(草莓属(fragaria spp.))、西瓜(西瓜(citrullus lanatus))、辣椒(辣椒属某些种(capsicum spp.))、糖用甜菜(甜菜(beta vulgaris))、葡萄(葡萄属(vitis)、圆叶葡萄(muscadinia))、番茄(番茄(lycopersicon esculentum)、番茄(solanum lycopersicum))、以及黄瓜(黄瓜(cucumis sativis))。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括例如瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、以及鹰嘴豆。鉴于本发明可适用于广泛范围的植物物种，所以本发明也适用于与豆科植物的豆荚类似的其他植物结构，诸如棉铃、长角果、果实、坚果、块茎等。根据本发明的实施方案并且根据所转化的具体植物物种，异位地表达促花ft序列的植物可相对于不具有ft转基因的野生型或对照植物在植物的每个苤节、主茎和/或分枝中具有改变的或更大数量的棉铃、长角果、果实、坚果、块茎等和/或在每株植物中具有改变的或更大数量的棉铃、长角果、果实、坚果、块茎等。
82.根据本发明的另一个广泛方面，提供转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，其包含进入其至少一个植物细胞的基因组中的转化事件或插入物，所述转化事件或插入物包
括含有开花基因座t(ft)转基因或表达盒的重组dna序列、构建体或多核苷酸，其中ft转基因或表达盒还包含可操作地连接到营养阶段启动子的编码ft蛋白的多核苷酸序列，所述营养阶段启动子还可以是分生组织优选启动子或分生组织特异性启动子。由多核苷酸序列编码的ft蛋白可以是使用多核苷酸序列转化的转基因植物原有的或者与转基因植物原有的ft蛋白同源的或在其他方面类似的(即，不是转基因植物原有的)。此转基因植物可通过任何合适的转化方法产生，这之后可按期望或按需要进行选择、培养、再生、发育等以产生转基因r0植物，所述转基因r0植物然后可自交或与其他植物杂交以生成r1种子并且通过另外的杂交生成后续的子代和种子等。相似地，本发明的实施方案还包括植物细胞、组织、外植体等，其包含具有包括ft转基因的重组dna或多核苷酸序列的转化事件或基因组插入物的一个或多个转基因细胞。
83.本发明的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分对于ft转基因或表达盒到至少一个植物细胞的基因组中的转基因事件或插入物而言可以是纯合的或半合子的，或者可含有包含ft转基因或表达盒的转基因事件或插入物的任何数量的拷贝。ft转基因或表达盒的表达剂量或量可通过其接合性和/或拷贝的数量来改变，所述接合性和/或拷贝的数量可影响转基因植物中表型变化的程度或范围等。根据一些实施方案，包含ft转基因的转基因植物还可表征为具有一种或多种改变的开花或生殖表型或性状，所述改变的表型或性状可包括改变的产量相关的表型或性状，诸如相对于不具有ft转基因的野生型或对照植物增加每株植物(和/或植物的每个苤节)的花、豆荚等和/或种子的数量。由于相对于野生型或对照植物改变的植物高度、分枝模式、花苤节的数量等，此转基因植物还可表征为具有改变的结构、形态和/或构造。实际上，由转基因植物的ft过表达改变的产量相关表型或性状可包括：与不具有ft转基因的野生型或对照植物相比的开花时间、生殖持续时间、开花持续时间、花、豆荚、长角果、棉铃、果实、坚果等脱落的量或时间、每个苤节的花的数量、每个苤节的总状花序的数量、分枝的数量、每株植物的苤节的数量、主茎上的苤节的数量、分枝上的苤节的数量、每株植物的豆荚、棉铃、长角果、果实、坚果等的数量、每个苤节的豆荚、棉铃、长角果、果实、坚果等的数量、主茎上的苤节的数量、分枝上的豆荚、棉铃、长角果、果实、坚果等的数量、1000个种子的重量、每株植物的种子的数量、每个苤节的种子的数量、和/或改变的植物构造。
84.出于本发明的目的，“植物”可包括处于再生或发育的任何阶段的外植体、幼苗、小植株或全株植物。如本文所用，“转基因植物”是指其基因组通过重组dna分子、构建体或序列的整合或插入而改变的植物。转基因植物包括从初始转化的植物细胞发育或再生的r0植物、以及来自r0转基因植物的较晚世代或杂交种的子代转基因植物。如本文所用，“植物部分”可是指植物的任何器官或完整组织，诸如分生组织、枝器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花或花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(例如，胚芽、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟子房)、繁殖体、或其他植物组织(例如，维管组织、基本组织等)、或其任何部分。本发明的植物部分可以是能存活的、不能存活的、可再生的和/或不可再生的。“繁殖体”可包括能够生长为全株植物的任何植物部分。出于本发明的目的，根据本发明的实施方案使用ft转基因转化的植物细胞可包括能够胜任转化的任何植物细胞，如本领域中基于转化方法所理解的，所述植物细胞诸如分生组织细胞、胚细胞、愈伤组织细胞等。如本文所用，“转基因植物细胞”仅是指使用稳定整合的重组dna分子或序列转化的任何
植物细胞。转基因植物细胞可包括初始转化的植物细胞、再生或发育的r0植物的转基因植物细胞、或来自转化的r0植物的任何子代植物或后代的转基因植物细胞(包括植物种子或胚芽的细胞)或培养的植物或愈伤组织细胞等。
85.本发明的实施方案还可包括用于诸如通过转化、杂交等制备或产生具有改变的生殖和/或产量相关性状或表型的转基因植物的方法，其中所述方法包括将包含ft转基因的重组dna分子或序列引入到植物细胞中、以及然后使转基因植物由转化的植物细胞再生或发育，这可在有利于转基因事件的选择压力下进行。此类方法可包括使用包含ft转基因的重组dna分子或序列转化植物细胞、以及选择具有一种或多种改变的表型或性状的植物，所述表型或性状诸如以下中的一种或多种：与不具有ft转基因的野生型或对照植物相比的开花时间、生殖持续时间、开花持续时间、花、豆荚、棉铃、长角果、果实、坚果等脱落的量或时间、每个苤节的花的数量、每个苤节的总状花序的数量、分枝的数量、每株植物的苤节的数量、主茎上的苤节的数量、分枝上的苤节的数量、每株植物的豆荚、棉铃、长角果、果实、或坚果的数量、每个苤节的豆荚、棉铃、长角果、果实、坚果等的数量、主茎上的豆荚、棉铃、长角果、果实、坚果等的数量、分枝上的豆荚、棉铃、长角果、果实、坚果等的数量、1000个种子的重量、每株植物的种子的数量、每个苤节的种子的数量、以及改变的植物构造。例如，本发明的实施方案可包括用于产生每株植物具有增加的数量的花、豆荚和/或种子(和/或在植物的每个苤节中增加的数量的花、豆荚和/或种子)的转基因植物的方法，其中所述方法包括将包含ft转基因的重组dna分子引入到植物细胞中、以及然后使转基因植物由植物细胞再生或发育。
86.根据本发明的另一个广泛方面，提供用于在田间以正常或高密度种植本发明的转基因植物的方法。根据一些实施方案，每英亩(或每土地面积)的作物的产量可通过在田间以较高密度种植本发明的转基因植物来增加。如本文所述，在发育的营养阶段期间表达促花ft蛋白的本发明的转基因植物可表现出每个苤节(具体地在主茎上)上增加的豆荚，但是也可具有分枝减少且每个分枝的苤节较少的改变的植物构造。因此，提出可在田间以较高密度种植本发明的转基因植物以增加每英亩的产量。对于行播作物，较高密度可通过每行长度种植较大数量的种子/植物和/或通过减小各行之间的间距来实现。根据一些实施方案，本发明的转基因作物可在田间以一定密度(每土地/田地面积的植物)下种植，所述密度高于根据标准农学实践的作物的正常种植密度的至少5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％或250％。
87.对于大豆，典型的种植密度的范围是每英亩约100,000至150,000个种子，并且典型的行间距的范围是约26至约40英寸，诸如30英寸或36英寸的行间距。在给定行内，通常每英尺可种植约6-8个大豆种子。相比之下，大豆的高种植密度范围可包括每英亩大约150,000至250,000个种子，并且行间距的范围可以是约10英寸或更小至约25英寸，诸如10英寸、15英寸或20英寸的行间距。对于高密度种植，可在每行内每英尺种植大约9-12个大豆种子，可能结合较窄的行间距。然而，高作物密度可在未增加每行内的种植密度的情况下通过窄行间距来实现。
88.对于棉花，典型的种植密度的范围是每英亩约28,000至45,000个种子，并且典型的行间距的范围是约38至约40英寸，诸如38英寸或40英寸的行间距。在给定行内，通常每英尺可种植约2-3个棉花种子。相比之下，大豆的高密度种植可包括每英亩大约48,000至60,
000个种子的范围，并且行间距的范围可以是约30英寸或更小至约36英寸。对于高密度种植，可在每行内每英尺种植大约3-5个棉花种子，可能结合较窄的行间距。然而，棉花的高作物密度可在未增加每行内的种植密度的情况下通过窄行间距来实现。
89.对于油菜，典型的种植密度的范围是每英亩约360,000至550,000个种子，并且开沟器之间的典型行间距的范围是约6英寸至约16英寸行间距。在给定行内，通常每英尺可种植约8-12个油菜种子。相比之下，大豆的高密度种植可包括每英亩大约450,000至680,000个种子的范围，并且行间距的范围可以是约5英寸或更小至约10英寸。对于高密度种植，可在每行内每英尺种植大约10-16个油菜种子，可能结合较窄的行间距。然而，油菜的高作物密度可在未增加每行内的种植密度的情况下通过窄行间距来实现。
实施例
90.实施例1.大豆短日照诱导处理和转录作图对开花基因座t(ft)基因的识别。
91.用于光周期光照处理(即，植物的开花的短日照诱导)在美国专利号8,935,880和美国专利申请公布号2014/0259905中进行描述，其以引用的方式整体并入本文。如其中进一步描述的，早期短日照诱导处理产生具有改变的生殖性状(包括每株植物增加的数量的豆荚/种子)的大豆植物。使用基因表达微阵列进行转录作图实验，以便确定具体的转录在这些光照诱导的植物中是否上调，以识别可负责介导短日照诱导表型的基因。在这些实验中，对在1、3和5天之后从接受短日照诱导性光照处理(短日照)的植物采集的大豆叶和花顶端组织执行转录分析，与来自未接受诱导性处理(长日照)的植物的组织进行比较。
92.如图2所示，与取自(i)相同的短日照诱导植物的花顶端组织或(ii)相反地接受长日照处理的大豆植物的叶组织和花顶端组织的样本相比，在早期短日照诱导(esdi)处理3天和5天之后收获的叶组织中观察到具体的开花基因座t基因gm.ft2a(seq id no:1)的转录的积累增加。这些数据支持gm.ft2a表达在经历esdi处理的植物的叶组织中得到诱导的结论，所述表达在长日照条件下生长的植物中不可见。在esdi处理的植物的花顶端也未观察到gm.ft2a表达，这与响应于诱导性光周期条件而在外围叶组织中被诱导并且然后迁移到其在分生组织中的作用位点以诱导开花的ft蛋白表达模型一致。然而，使用更敏感的rna测序转录分析的其他实验显示在枝顶端和腋芽中响应于esdi处理的某一gm.ft2a诱导(数据未示出)。
93.实施例2.大豆中的pat.erecta启动子表达模式的表征。
94.通过转基因方法实现合乎需要的性状或表型可能需要控制异位ft基因表达的时间和空间模式。识别短日照诱导处理之后的营养组织中的gm.ft2a表达的大豆生理学实验(见图2)指示，实现产量阳性性状可依赖于营养阶段期间的早期ft表达。在另一方面，虽然在营养顶端中未检测到ft转录，但是已经显示ft蛋白从叶到顶端组织长距离移动，在所述顶端组织处，所述ft蛋白触发营养至生殖转变。参见，例如，lifschitz，e.等人(2006)，同上；以及corbeiser，l.等人，“ft protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of arabidopsis”，science 316：1030-1033(2007)。因此，根据观察，提出使用在分生组织中有活性的营养阶段启动子来控制植物中的异位ft表达。通过在期望的发育阶段直接在分生组织中表达形态生成ft信号，可绕过或避免多个内源性途径和调节反馈(例如，控制叶中的ft转导和ft信号的长距离移位)。使用短日照诱导
处理的先前实验(在以上实施例1中进行描述)揭示了gm.erecta基因在大豆植物的分生组织中的上调。已经显示来自拟南芥的perecta启动子(seq id no:21)在发育的营养阶段期间在植物的分生组织中具有弱表达。因此，选择pat.erecta启动子用于初始ft表达实验。
95.进行另外的实验以进一步表征融合到gus报道基因的pat.erecta在营养和花分生组织中的表达模式。在大豆幼苗发育期间的gus表达模式的分析指示pat.erecta启动子在发育的营养阶段期间优选地在分生组织中表现出时间和空间表达模式。图3和图4以及图5和图6包括示出gus染色模式的两组图像。图3和图5提供染色组织的黑白图像，并且图4和图6提供分别对应于图3和图5、但是经过颜色过滤以示出蓝色gus染色的模式和强度的黑白图像。因此，表达的gus染色模式可使用这些黑白图像通过比较图3和图4或图5和图6的对应图像来查看。如图3和图4所示，在播种/发芽之后三天在大豆未成熟单叶型叶片和叶柄(图4a和图4b)中检测到gus染色。在此早期营养阶段，在三叶型原基、枝顶端分生组织(sam)和腋生分生组织位点中也广泛地检测到pat.erecta:gus表达(图4c)。在发芽或种植之后十天在完全展开的单叶型和三叶型叶中未检测到gus活性(图4d和图4e)。然而，在未成熟、未展开但是完全发育的三叶型叶片的近侧部分处和在叶柄的近轴侧处检测到gus活性(图4f)。对发育的顶端组织的详细观察显示，在发育的未成熟叶原基、腋生分生组织和枝顶端分生组织中中保持广泛的表达(图4g-图4i)。
96.在早期生殖阶段，pat.erecta启动子活性在成熟叶片中未检测到并且在发育的叶原基中减小。一旦枝顶端分生组织(sam)或腋生分生组织(am)开始形成花序，在枝顶端分生组织(sam)处的不确定营养顶端中或在腋生分生组织(am)中就未检测到gus信号(图4j-图4l)。在所有晚期阶段中，在顶端中或在腋片或花原基中未能检测到任何另外的分生组织活性。然而，gus表达在叶柄的近轴侧和未成熟叶片的近侧部分中继续进行(图4m和图4n)，但是在完全展开的叶片中未继续进行(图4o)。还在发育的晚期r1阶段(发芽之后35-40天)分析使用pat.erecta启动子的gus表达模式。与发育的早期阶段相似，在成熟的叶或茎中未检测到表达。然而，在花序茎(图5a和图6a；参见箭头)和花梗(图5b和图6b；参见箭头)中检测到强烈的启动子活性。在两个组织中，均在维管细胞和薄壁细胞(图5c和图6c)中检测到表达。在此阶段，在雄蕊花丝(图5d和图6d；参见箭头)中和在未授粉胚珠(图5e、图5f、图6e和图6f；参见图6f中的箭头)中也检测到表达。
97.先前，pat.erecta启动子在拟南芥中得到表征。有趣的是，拟南芥中的pat.erecta表达模式相当于在营养阶段期间而非晚期生殖阶段期间在大豆中观察到的模式。相比之下，大豆中的pat.erecta表达模式在早期生殖组织中减弱，但是在一些晚期生殖器官和组织(包括花序茎和花梗)中重新出现。参见，例如，chen，m-k等人，febs letters588：3912-17(2014)；yokoyama，r等人；shpak，ed等人，science309：290-293(2005)；yokoyama，r等人，plant j 15(3)：301-310(1998)，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。因此，pat.erecta启动子在大豆中提供新型表达模式。
98.实施例3.在pat.erecta启动子控制下的开花基因座t基因gm.ft2a的表达改变大豆的开花时间和每个苤节的豆荚。
99.经由土壤杆菌介导的转化通过使用包含可操作地连接到gm.ft2a基因的pat.erecta启动子的重组dna分子(即，t-dna转化载体)转化大豆外植体来产生转基因大豆植物，以生成继续用于进一步测试的四个perecta::gm.ft2a事件。ft2a过表达的效应立即
可见于r0植物中，所述r0植物具有非常早的开花和终止以及种子产量降低(例如，仅约8个种子/植物)。这些转基因gm.ft2a植物还具有短植物高度和非常少的(如果有的话)分枝。分离的r1植物及其子代随后在长日照条件下在温室中生长以用于初始研究和表征。通过在长日照条件下生长这些植物，使用gm.ft2a转基因r0植物观察到的严重矮化表型得到改进。在这些实验中，在16小时长日照条件(即，16/8小时的白昼/夜晚光周期)下在温室中生长的纯合植物和半合子植物两者均比野生型无转基因分离子更早开花。gm.ft2a转基因植物在种植或接种之后约19-22天开花。(参见，例如，图9)。在这些生长条件下，表达gm.ft2a的转基因大豆植物与野生型对照物相比在主茎上也具有每个苤节增加的数量的豆荚(参见，例如，图10和图11，在以下进一步讨论)。
100.通过扫描电子显微镜分析(esem)进一步分析在受控环境条件下生长的含有per::gm.ft2a转基因事件之一(事件1)的植物。对这些转基因植物(在种植之后7天采集)的枝顶端分生组织(sam)进行的分析显示出sam早期转变成花序分生组织(im)和花分生组织(fm)(图7)。相比之下，野生型大豆植物的sam在此生长阶段没有分化成im。相似地，ft2a转化体(在种植之后9天采集)的腋生分生组织的成像指示休眠花序分生组织(dim)(或侧生原始总状花序)发育成im和fm(图8)，从而在这些转基因植物中引起每个苤节的更多较早发育的花分枝(总状花序)。另外的表型表征显示出表达gm.ft2a的大豆植物中在v1阶段早期开花，这正好在无转基因分离植物中发生花转变之前出现(图9)。这些数据与以上所述的pat.erecta:gus表达模式组合指示，早期开花并且更具体地为花序和花分生组织的形成通过在营养阶段期间gm.ft2a在幼苗的叶原基和枝顶端分生组织和腋生分生组织中的异位表达诱导。认为较高数量的花序和花分生组织的形成也引起次级总状花序和三级总状花序的较早释放和伸长，从而引起每个苤节形成较大数量的生产性花和豆荚。
101.不仅gm.ft2a转基因大豆植物经历较早开花并在主茎上在每个苤节中产生更多的豆荚(相对于分离的无转基因植物)，而且还发现转基因植物中的异位gm.ft2a表达的效应是剂量依赖性的。虽然纯合植物和半合子植物两者均具有减小的高度和较少的分枝，但是对于gm.ft2a转基因是纯合的植物比半合子植物受到更严重的影响，据推测这是因为与半合子植物中仅一个拷贝(即，较低剂量)不同，纯合植物包含转基因的两个拷贝(即，较高剂量)。在长日照生长条件下，与对于转基因是半合子的植物相比，纯合植物更早地终止并且具有更短的总体高度和主茎上更少的苤节和分枝(图10)。与表现出多种亚最佳矮化表型(包括主茎上非常少的(如果有的话)分枝)的纯合植物不同，半合子植物相对于野生型植物和纯合植物在其营养生长、植物高度以及存在于主茎上的苤节的数量方面具有中间表型。在16小时长日照条件下，半合子植物相对于纯合植物具有一定分枝度的更正常的植物高度和更加延长的开花持续时间(图10)。半合子植物在r1启动之后还开花40-64天，而纯合植物由于其更早的终止而仅开花16-24天。
102.在长日照(16小时)受控环境条件中使用以gm.ft2a构建体(3个事件)转化的植物实施另外的实验，以进一步表征半合子植物与纯合植物之间的剂量响应。对于三个纯合事件(纯合-事件2、纯合-事件3、纯合-事件4)和三个半合子事件(半合子-事件2、半合子-事件3、半合子-事件4)，主茎和分枝上的苤节和豆荚的数量的差异以及每个苤节的豆荚的平均数量和每株植物的平均高度示出在表1中。这些事件区别于以上事件1。
103.表1.纯合和半合子gm.ft2a转基因植物的事件水平数据。
[0104][0105][0106]
如表1所示，半合子植物比纯合植物在主茎(ms)和分枝(br)上具有更高数量的苤节并且具有更大的植物高度。因此，半合子植物通常比纯合植物更少受到影响并且更像野生型植物。相对于纯合植物，半合子植物也在每个苤节中具有增加的数量的豆荚并且在主茎和分枝上具有更高数量的豆荚。因此，半合子植物通常具有更接近于正常的植物构造并且在每个苤节(和每株植物)中具有更大数量的豆荚，据推测这是由于其更低的gm.ft2a转基因剂量引起。还通过另外的实验确认基于转基因接合性的gm.ft2a的相对剂量水平，所述实验显示gm.ft2a转录水平在来自纯合植物的组织中比在来自半合子植物的组织中更高(数据未示出)。
[0107]
这些gm.ft2a转基因植物中开花的早期诱导与半合子植物和纯合植物两者的主茎上的每个苤节的更多豆荚(和种子)相关联。与野生型分离子相比，含有gm.ft2a转基因的纯合植物和半合子植物各自在植物的主茎上在每个苤节中具有增加的数量的豆荚/种子(图11)。还发现豆荚在主茎上的分布在ft2a转基因植物与野生型无转基因植物之间是不同的。发现与野生型无转基因植物相比，在长日照条件下生长的纯合植物和半合子植物两者在主茎的至少下苤节上具有更多的豆荚并且平均每个苤节具有更多的豆荚(数据未示出)。对于gm.ft2a转基因是半合子的植物在主茎的长度上在每个苤节中包含更高数量的豆荚。然而，这些效应取决于包括白昼长度等在内的具体生长条件。一般来说，在长日照条件下使用大豆进行的实验倾向于在转基因植物与无转基因植物之间产生较大差异。
[0108]
在田间试验实验中也观察到转基因gm.ft2a表达的剂量依赖性效应。在2014年的田间试验中，对于两个gm.ft2a事件(以上事件1和事件2)是半合子的大豆植物在主茎上的每个苤节显示平均约2.68个豆荚，并且对于这些事件是纯合的植物在每个苤节中具有平均约1.40个豆荚，而无转基因分离植物在每个苤节中具有约1.63个豆荚。然而，在2013年的田间试验中，发现与纯合植物的每个苤节平均约3.05个豆荚和无转基因分离植物的每个苤节
平均约2.19个豆荚相比，对于转基因gm.ft2a(事件2)是半合子的植物在每个苤节中具有平均约3.21个豆荚的数量。在不同的田地位置处实施的另一个2013年微区实验中，发现与对于gm.ft2a转基因(事件2)是纯合的植物的每个苤节平均约2.05个豆荚和无转基因分离植物的每个苤节平均约1.30个豆荚相比，对于gm.ft2a转基因(事件1)是半合子的植物在每个苤节中具有平均约2.17个豆荚。因此，在含有gm.ft2a转基因的植物上每个苤节的豆荚的数量可取决于各种因素，包括ft转基因的剂量、环境和田地条件、以及可能在农学实践中的差异。然而，与在温室中生长的转基因gm.ft2a植物非常类似，在田地条件下生长的纯合和半合子gm.ft2a转基因植物经常在主茎上具有较少的苤节、具有较短的整体植物高度和/或在转基因植物中具有减少的分枝。实际上，野生型植物通常比半合子和纯合gm.ft2a植物具有更多分枝和每株植物更大数量的总苤节。
[0109]
从在14小时长日照条件下在温室中生长的纯合gm.ft2a转基因植物和野生型(wt)对照植物采集另外的生理数据(参见表2)。这些数据提供从针对每个事件的六株gm.ft2a转基因植物或从八株野生型植物获取的测量值的平均值。针对这些植物的表型表征采集以下矩阵：r1开花的天数(dofr1)；r7的天数(dor7)；从r1到r7的按天数计的生殖持续时间(pdr1r7)；每株植物的分枝数量(brpp)；分枝上的总可育苤节(fnbr)；每株植物的总可育苤节(fnlp)；主茎上的总可育苤节(fnst)；分枝上的苤节数量(ndbr)；主茎上的苤节数量(ndms)；苤节的数量/植物(ndpl)；分枝上的可育苤节百分比(pfnb)；总可育苤节半分比(pfnn)；主茎上的可育苤节百分比(pfns)；每株植物的豆荚数量(pdpp)；主茎上的豆荚数量(podms)；分枝上的豆荚数量(podbr)；豆荚的数量/苤节；在r8时每株植物的种子(sdppr8)；以及1000个种子的重量(sw1000)。除非指定另一个时间点，否则在收获时获取这些测量值中的每一个。
[0110]
表2.转基因纯合gm.ft2a植物和wt植物的构建体水平表型数据。
[0111][0112]
与以上指出的观察一致，纯合gm.ft2a转基因植物经历比wt植物更早的成花诱导(在种植之后约21天的dofr1，而非野生型植物的约33-34天)。这些测量值还显示分枝的数量(和与分枝相关的其他测量值，诸如分枝上的苤节或豆荚的数量)极大地减小。由于转基因植物具有较短的高度和非常少的分枝，每株植物的苤节或豆荚的总数量也极大地减小。然而，主茎上每个苤节的豆荚的数量在转基因植物中(例如，平均约3.8个豆荚/苤节)相对于野生型无转基因植物(例如，约2.4个豆荚/苤节)有所增加。
[0113]
在不受任何理论约束的情况下，使用在发育的营养阶段期间在分生组织中表达ft2a的转基因大豆植物观察到的每个苤节的较大数量的豆荚可至少部分通过早期开花与早期次级和/或三级总状花序释放的同步和/或每个苤节产生更多产豆荚花的更好资源利用引起。分生组织中的早期ft表达(参见，例如，图3和图4)可引起休眠花序分生组织的早期释放以在植物的每个苤节中产生较大数量的总状花序，使得较大数量的总状花序在每个苤节处产生成熟的花和完全发育的豆荚。然而，在生殖组织中的后续ft表达(参见，例如，图5和图6)可使每个苤节处的晚期发育花的花发育终止，从而使资源更有效地分配于较早发育的总状花序、花和豆荚。在野生型大豆植物中，相对于初级总状花序低得多的次级和三级总状花序百分比产生花和完全发育的豆荚，并且初级总状花序的晚期发育的花通常在脱落之前不产生成熟的花和/或全尺寸的豆荚。因此，理论上，可通过使在植物的一个或多个苤节处的早期花发育与侧生总状花序的早期释放同步来在营养分生组织中表达ft蛋白的植物中生成每个苤节更多的豆荚。在使用至少驱动ft表达的pat.erecta启动子的情况下，也可通过ft的晚期生殖阶段表达来使晚期发育的花(可能未另外产生完全发育的或全尺寸的豆荚)终止以将资源引导到较早发育的花。
[0114]
实施例4.在大豆中在替代性营养阶段启动子控制下开花基因座t基因gm.ft2a的
表达。
[0115]
基于前述实施例3中观察到的表型，还提出驱动gm.ft2a转基因表达的两种启动子，所述两种启动子被认为是营养阶段启动子、叶优选启动子：pat.bls(seq id no：36)和pat.almt6(seq id no：37)。如本文所用，“叶优选”启动子是指在叶组织中相对于其他植物组织优先地启动其相关基因的转录的启动子。因为认为ft充当可移动的促花素，所以在营养阶段期间在外围组织中(诸如在叶中)使用叶优选启动子或叶特异性启动子进行的早期ft表达可引起与分生组织优选pat.erecta:gm.ft2a表达相似的表型。另外在理论上，使用营养叶启动子进行的ft表达也可使成花诱导信号衰减，并且因此减弱在分生组织中在纯合ft表达的情况下观察到的早期终止表型，并且增加植物高度和分枝。
[0116]
在这些实验中，pat.almt6::gm.ft2a和pat.bls::gm.ft2a的转化载体被构建并用于通过土壤杆菌介导的转化转化大豆品系。已显示使用pat.bls启动子进行的表达在叶原基编号5(p5)中开始并且仅在源叶脉中表达，直至转变到开花为止，并且pat.almt6启动子也是营养叶启动子，相对于pat.bls在更晚发育阶段表达。参见，例如，efroni等人，“a protracted and dynamic maturation schedule underlies arabidopsis leaf development,”the plant cell 20(9)：2293-2306(2008)；以及shani等人，“stage-specific regulation of solanum lycopersicum leaf maturation by class 1knotted1-like homeobox proteins,”the plant cell 21(10)：3078-3092(2009)。针对这些载体构建体中的每一个产生转基因大豆植物并且针对在生长室中在14小时光周期条件下的表型进行表征，与野生型植物进行比较。对于pat.bls构建体中的每一个，测试六个转基因事件(每个事件5株植物)，并且对于pat.almt6启动子，测试七个转基因事件(每个事件5株植物)。对于这些构建体中的每一个，从五株野生型植物采集对照数据。
[0117]
对于这些转基因植物的表型表征采集以下矩阵(表3和表4)。单个测量值如以上定义，并且在对于转基因是纯合的植物上进行表型表征。
[0118]
表3.palmt6::gm.ft2a植物和wt植物的构建体水平表型数据。
[0119]
[0120][0121]
表4.pbls::gm.ft2a植物和wt植物的构建体水平表型数据。
[0122] wtpbls::ft2adofr131.335.2dor778.182.6pdr1r746.947.5brpp7.58.8fnbr65.781.2fnlp80.594.0fnst14.912.7ndbr72.295.6ndms21.922.3ndpl94.0117.9pdpp137.0148.1pfnb92.385.3pfnn87.480.1pfns68.157.3podbr100.9123.4podms36.124.8豆荚/苤节1.71.3
[0123]
在替代性pat.almt6和pat.bls启动子控制下表达gm.ft2a的转基因植物在表型上相比于pat.erecta::gm.ft2a转基因植物与野生型(wt)植物更相似。使用pat.almt6::gm.ft2a和pat.bls::gm.ft2a构建体转化的植物具有与野生型对照植物相似的开花时间和营养生长，与野生型植物相比可能在分枝上具有稍微增加的数量的苤节(表3和表4)。这些数据可解释为指示转基因ft表达的时间和位置两者对于产生与野生型植物不同的生殖和产量相关性状或表型均是重要的。在发育的早期营养阶段(例如，在叶组织中)仅表达ft转基因可能不足以改变植物的生殖或产量相关表型(例如，每个苤节的豆荚)。因此，根据本发明的实施方案，可操作地连接到促花ft转基因的启动子除了在植物发育的营养阶段期间驱动表达之外还可优选地是分生组织特异性启动子或分生组织优选启动子。然而，当在大豆
植物中测试以上两种叶优选启动子的表达谱时，在使用pat.bls启动子的发育的叶中未观察到gus染色，并且pat.almt6启动子在叶中没有产生可检测的gus表达，直至晚期营养阶段，在早期生殖阶段期间具有高得多的表达。因此，仍然可能的是，在早期营养阶段期间使用不同组织特异性启动子进行的ft转基因在外围(叶)组织中的表达在一些情况下可能足以诱导早期开花和/或引起其他生殖或产量相关性状或表型，所述性状或表型还可取决于所测试的具体植物物种。
[0124]
实施例5.通过pfam分析进行的对ft同源物的蛋白质结构域的识别。
[0125]
gm.ft2a直系同源物通过序列分析和文献综述进行识别，并且这些ft同源物的一些实例与gm.ft2a一起列出在表5中。这些同源物包括其他大豆ft基因以及来自其他植物物种的几种ft基因。分析这些ft蛋白的氨基酸序列以使用hmmer软件和pfam数据库(版本27.0)识别任何pfam蛋白质结构域。发现这些ft蛋白质序列(seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10和seq id no:12)具有相同的识别为磷脂酰乙醇胺结合结构域蛋白(pebp)的pfam结构域，其具有“pbp_n”的pfam结构域名称和pf01161的pfam登录号。pbp_n结构域在这些ft蛋白质序列中的每一个中的位置也列出在表5中。pbp_n结构域在其他ft蛋白中的位置可通过序列比对来确定。因此预期编码包含pbp_n结构域的至少ft蛋白的任何dna序列可用于本发明的重组dna分子中，只要对应的ft蛋白当在植物的分生组织中异位地表达时具有促花活性即可。
[0126]
表5.pbp_n(pfam)结构域在ft蛋白质序列中的位置。
[0127][0128]
实施例6.在大豆中在pat.erecta启动子控制下ft同源物的表达。
[0129]
在pat.erecta启动子控制下包含其他ft同源物的另外的转化载体(表6)被构造并用于通过土壤杆菌介导的转化转化大豆。对由这些事件生成的转基因植物在温室中在使用14至14.5小时自然光照光周期的情况下的表型进行表征。对于每个构建体，测试六个事件(每个事件6株植物)。还对于野生型(wt)对照植物的六株植物进行测试和取平均值。如表6所示使用单独野生型对照物实施不同组的实验(a-e)。
[0130]
表6.某一gm.ft2a及其同源物的构建体与其蛋白质序列的列表。
[0131][0132]
除对于以上所述的gm.ft2a构建体所采集的数据之外，对于使用表6中所列出的用于使用pat.erecta启动子表达其他ft同源物的每个构建体转化的植物的表型表征采集以下矩阵。如以上定义各个测量值，并且在对于转基因是纯合的植物上进行转化体的表型表征。
[0133]
对于在pat.erecta启动子控制下表达zm.zcn8和nt.ft样转基因的植物采集表型数据(参见表7和表8)。表7和表8中的每个事件的性状值是含有所述事件的所有测试植物的平均值。有一列还提供每种性状的事件值的平均值。
[0134]
表7.zm.zcn8植物和wt植物的构建体和事件水平表型数据。
[0135][0136]
表8.nt.ft样植物和wt植物的构建体和事件水平表型数据。
[0137][0138][0139]
表达zm.zcn8蛋白和nt.ft样蛋白的转基因大豆植物比野生型对照植物更早开花，并且在每个苤节中具有增加的数量的豆荚(与表达gm.ft2a转基因的植物相似)。实际上，表达zm.zcn8转基因和nt.ft样转基因的大豆植物具有与gm.ft2a转基因植物相似的若干表型，包括相对于野生型对照物，开花的天数(dofr1)减少、分枝数量(brpp)减少、每株植物的苤节(ndpl)更少、分枝上的苤节(ndbr)更少、每株植物的豆荚数量(pdpp)减少、以及分枝上的豆荚(podbr)更少、连同每个苤节的豆荚的数量增加和每株植物的种子数量降低(表7和表8)。然而，在纯合gm.ft2a植物中观察到的若干阴性表型在表达zm.zcn8和nt.ft样的转基因植物中不太明显。总体而言，表达zm.zcn8转基因的植物具有更短的植物高度和更少的分枝，但是在主茎上的每个苤节中具有更多的豆荚(图12a和图12b)。相似地，表达nt.ft样转基因的植物相对于野生型对照植物具有更短的植物高度、减少的分枝和主茎上的每个苤节中增加的豆荚(图13a和图13b)。
[0140]
还在2015田间试验中在两个不同位置处测试来自以上的两个转基因zm.zcn8事件和四个nt.ft样事件。对于在pat.erecta启动子控制下表达zm.zcn8和nt.ft样转基因的植物采集表型数据(表9和表10)。相应地，表9中的事件1和事件2对应于表7中的事件2和事件3，并且表10中的事件1-4对应于表8中的事件1-4。除r1开花的天数(dofr1)和从r1到r8的按天数计的生殖持续时间(pdr1r8)以外，所有的表型测量值均基于从两个位置采集的数据得出。与在温室中的观察相似，表达zm.zcn8蛋白和nt.ft样蛋白的转基因大豆植物在田间也比野生型对照植物更早开花。在田间试验中，zm.zcn8转基因植物在每个苤节中具有增加的数量的豆荚，而nt.ft样植物没有清楚地显示每个苤节的豆荚增加。
[0141]
表9.来自2015年田间试验的zm.zcn8植物和wt植物的表型数据。
[0142][0143]
(*-单个位置数据)
[0144]
表10.来自2015年田间试验的nt.ft样植物和wt植物的表型数据。
[0145][0146]
(*-单个位置数据)
[0147]
对于在pat.erecta启动子控制下表达gm.ft2b转基因的植物采集另外的表型数据(表11)。
[0148]
表11.gm.ft2b植物和wt植物的构建体和事件水平表型数据。
[0149][0150]
表达gm.ft2b转基因的转基因大豆植物比野生型对照植物更早开花并且具有更少的分枝。表达gm.ft2b的大豆植物的开花的天数(dofr1)减少、分枝的数量(brpp)减少、每株植物的苤节(ndpl)更少、分枝上的苤节(ndbr)更少、每株植物的豆荚数量(pdpp)减少并且分枝上的豆荚(podbr)更少(表9)。然而，转基因gm.ft2b植物没有显示每个苤节中的豆荚数量增加。总体而言，表达gm.ft2b转基因的植物相对于野生型对照植物具有更短的植物高度和更少的分枝(图14)。也在2015年田间试验中也测试表达gm.ft2b转基因的四个不同事件的转基因大豆植物。对于在pat.erecta启动子控制下表达gm.ft2b转基因的植物采集表型数据(表12)。表11中的事件1-4分别对应于表12中的事件3、事件2、事件1和事件4。与在温室中的观察相似，表达gm.ft2b的大豆植物在田间显示开花的天数(dofr1)减少。其他表型测量值也相对于野生型对照植物表现出与在温室中观察到的相似的性状。
[0151]
表12.来自2015年田间试验的gm.ft2b植物和wt植物的表型数据。
[0152][0153]
从在pat.erecta启动子控制下表达的le.sft转基因的植物采集另外的表型数据(表13)。
[0154]
表13.le.sft植物和wt植物的构建体和事件水平表型数据。
[0155][0156]
总体而言，表达le.sft转基因的大豆植物相对于野生型植物具有更短的植物高度和更少的分枝(图15)，并且具有平均每个苤节增加的数量的豆荚(表13)。然而，这些效应是可变的并且是事件特异性的。例如，事件1、事件3和事件4显示出早期开花(dofr1)，而其他事件是无倾向性的或者实际上具有延迟开花。此外，一些le.sft转基因事件在不同程度上显示平均每个苤节的豆荚增加，而几个所述事件在每个苤节的豆荚的平均数量方面是无倾向性的。有趣的是，两个事件(事件5和事件6)具有平均每个苤节最大数量的豆荚，尽管具有开花延迟。
[0157]
从在pat.erecta启动子控制下表达gm.ft5a转基因的植物采集另外的表型数据(表14)。
[0158]
表14.gm.ft5a植物和wt植物的构建体和事件水平表型数据。
[0159][0160]
表达gm.ft5a转基因的转基因大豆植物比野生型对照植物显著开花地更早，并且在每个苤节中具有增加的数量的豆荚(与表达gm.ft2a转基因的植物相似)。实际上，表达gm.ft5a转基因的大豆植物具有若干表型(与gm.ft2a转基因植物相似)，包括开花的天数(dofr1)减少、分枝的数量(brpp)减少、每株植物的苤节(ndpl)更少、分枝上的苤节(ndbr)更少、每株植物的豆荚数量(pdpp)减少、以及分枝上的豆荚(podbr)更少、连同每个苤节的豆荚的数量增加和每株植物的种子数量降低(表14)。总体而言，表达gm.ft2a转基因的植物相对于野生型对照植物具有更短的植物高度和更少的分枝，但是在每个苤节中(具体地在主茎上)具有更多的豆荚(图16)。
[0161]
在不受任何理论约束的情况下，这些数据支持以剂量依赖性方式起作用的ft过表达模型，其中相关表型(例如，早期开花、每个苤节的豆荚增加和改变的植物构造)的程度或范围取决于(i)ft表达的水平和时间、(ii)ft表达的组织特异性、以及(iii)所表达的具体ft蛋白的相对活性和靶特异性。例如，来自其他植物物种的ft蛋白直系同源物在大豆中的表达可在大豆中产生相对于内源性ft蛋白(gm.ft2a)的过表达更加减弱的效应，这可能由在大豆中具有较低活性的非天然ft蛋白同源物导致。然而，如果一些天然ft蛋白在其天然状态或环境中具有不同的或专门的作用，则它们的表达可能不产生显著的表型效应。不同的ft蛋白也可作用于不同的组织靶标和受体上，并且因此对于各种植物构造和开花性状和表型具有不同的效应。
[0162]
无论具体的ft同源物的活性水平如何，改变的生殖和植物构造表型似乎与ft表达的时间和位置相关。ft转基因的生殖阶段表达对于诱导早期开花和/或引起植物每个苤节的花分生组织、花、豆荚等的数量增加可能是必要的。实际上，在适当剂量的ft转基因的情况下，显示在发育的营养阶段期间在分生组织中的ft表达引起植物的生殖变化，从而引起
每个苤节的花、豆荚和/或种子的数量增加。相比之下，在叶优选启动子控制下的gm.ft2a转基因的表达相对于野生型植物产生非常少(如果有的话)的表型变化。这些数据指示ft表达的时间和组织特异性(或组织偏好)是影响转基因植物的生殖和/或产量相关表型变化的重要因素。
[0163]
呈现的数据表明尽管使用相同的perecta启动子表达，但是不同的ft蛋白可具有不同的活性水平和/或靶特异性。虽然表达gm.ft2a、zm.zcn8、nt.ft样和gm.ft5a的若干构建体各自引起早期开花和终止以及每个苤节的豆荚数量增加，但是表达gm.ft2b和le.sft的其他构建体对开花具有不同的相关效应。gm.ft2b的表达确实引起植物的早期开花和终止，但是每个苤节的豆荚数量没有显著增加。在另一方面，le.sft表达显示每个苤节的豆荚增加和早期终止，尽管出现开花延迟。有趣的是，转基因ft植物中每个苤节的豆荚数量增加与延长的生殖持续时间(pdr1r7)不相关，并且与以上指出的早期开花(dofr1)并不总是一致。这些数据表明响应于ft蛋白在分生组织中的营养阶段表达的生殖变化可通过一种或多种独立的机制或途径起作用。转基因ft植物中每个苤节的豆荚数量增加可取决于在每个苤节处由营养分生组织诱导的花序和花分生组织的数量，这可独立于开花时间和/或生殖持续时间而发生。然而，如以上所指出的，生殖持续时间可能不必与开花的持续时间相关。
[0164]
实施例7.另外的营养阶段分生组织启动子的识别。
[0165]
已经观察到在营养阶段、分生组织优选启动子pat.erecta控制下gm.ft2a的表达的情况下的表型效应，预期其他营养阶段、分生组织优选(或分生组织特异性)启动子可用于驱动ft蛋白的表达，以引起植物的生殖或产量相关性状或表型，诸如每个苤节(和/或每株植物或每个主茎)的豆荚数量增加。使用pat.erecta启动子的表征的表达模式(参见实施例2)，识别来自大豆、番茄和拟南芥的其他营养阶段、分生组织优选(或分生组织特异性)启动子。使用两种生物信息学方法识别来自其他双子叶物种(包括例如拟南芥、大豆、苜蓿、马铃薯和番茄)的候选基因，其具有与pat.erecta相似的表达谱：bar espressolog和expression angler。参见，例如，“bar expressolog identification：expression profile similarity ranking of homologous genes in plant species,”plant j 71(6)：1038-50(2012)；以及toufighi，k等人，“the botany array resource：e-northerns，expression angling，and promoter analyses,”plant j 43(1)：153-163(2005)。因此，提出将来自这些基因的启动子序列用于表达根据本发明的实施方案的ft转基因。
[0166]
通过此分析识别的基因启动子的实例包括以下各项：来自大豆的四种受体样激酶(rlk)基因，包括glyma10g38730(seq id no：23)、glyma09g27950(seq id no：24)、glyma06g05900(seq id no：25)、以及glyma17g34380(seq id no：26)。另外的实例包括来自马铃薯的受体样激酶(rlk)基因启动子，pgsc0003dmp400032802(seq id no：27)和pgsc0003dmp400054040(seq id no：28)。可能的是，这些rlk基因可能在结构上和/或功能上与来自拟南芥和其他物种的erecta和erecta样基因是相关的，因为它们也是rlk基因。来自拟南芥基因的其他营养阶段、分生组织优选启动子包括以下各项：at.myb17(at.lmi2；at3g61250)(seq id no：31)、驱动蛋白样基因(at5g55520)(seq id no：32)、ap2/b3样基因(包括at.rem17(seq id no：33)或at.rem19)、以及erecta样1基因和erecta样2基因(at.erl1(seq id no：34)和at.erl2(seq id no：35))。这些启动子和相似的功能性序列各自可操作性地连接到ft基因，以引起ft基因至少在发育的营养阶段期间在植物的一个或多
个分生组织中异位地表达。
[0167]
关于at.myb17(at.lmi2)基因，参见pastore，jl等人，“late meristem identity 2acts together with leafy to activate apetala1,”development 138：3189-3198(2011)，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。关于驱动蛋白样基因，参见fleury，d等人，“the arabidopsis thaliana homolog of yeast bre1 has a function in cell cycle regulation during early leaf and root growth,”plant cell，19(2)：417-432(2007)，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。关于rem17和rem19拟南芥基因，参见mantegazza，o等人，“analysis of the arabidopsis rem gene family predicts functions during flower development,”ann bot 114(7)：1507-1515(2014)，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。另外，关于at.erl2基因，参见“special issue：receptor-like kinases,”jipb 55(12)：1181-1286(2013)，以及具体地shpak，e.，“diverse roles of erecta family genes in plant development,”jipb55(12)：1251-1263(2013)，所述文献的全部内容和公开内容以引用的方式并入本文。
[0168]
实施例8.在pat.erl1启动子控制下开花基因座t基因gm.ft2a的表达改变大豆的开花时间和每个苤节的豆荚。
[0169]
含有在营养阶段、分生组织优选pat.erl1启动子(seq id no:34)控制下的gm.ft2a的转化载体被构造并用于通过土壤杆菌介导的转化转化大豆。对由这些事件生成的转基因植物在温室中在使用14至14.5小时自然光照光周期的情况下的表型进行表征。对于每个pat.erl1:gm.ft2a构建体，测试六个事件(每个事件6株植物)。还对于野生型(wt)对照植物的六株植物进行测试和取平均值。对于这些植物的表型表征采集以下矩阵并且将其表示为每个事件以及野生型植物的平均值(参见表15)。还提供为每种性状提供所有事件的平均值的列。
[0170]
表15.pbls::gm.ft2a植物和wt植物的表型数据。
[0171][0172]
表达pat.erl1::gm.ft2a构建体的转基因大豆植物比野生型对照植物更早开花，并且在每个苤节中具有增加的数量的豆荚(与在pat.erecta启动子控制下表达gm.ft2a转
基因的植物相似)。实际上，表达pat.erl1:gm.ft2a的大豆植物具有与pat.erecta:gm.ft2a转基因植物相似的若干表型，包括相对于野生型对照植物，开花的天数(dofr1)减少、r7的天数(dor7)减少、分枝的数量(brpp)减少、每株植物的苤节(ndpl)更少、每株植物的豆荚数量(pdpp)减少、连同每个苤节的豆荚的数量增加(表15)。然而，在pat.erecta::gm.ft2a植物中观察到的若干表型(诸如主茎上的豆荚数量(podms)、分枝上的豆荚数量(podbr)和1000个种子的重量(sw1000))在表达pat.erl1::gm.ft2a的转基因植物中不太明显。
[0173]
如通过gus染色测量的拟南芥erecta样1启动子(pat.erl1)在大豆中的表达模式比如以上所述的pat.erecta在大豆中的表达模式更受限制。pat.erl1在营养腋生分生组织中和在来源于腋生组织的早期花分生组织中驱动gus表达。然而，gus染色未在任何阶段在枝顶端分生组织中观察到，在所述枝顶端分生组织中，所述gus染色可区别于发育的植物的其他分生组织。在pat.erl1启动子控制下的gus报道基因的表达未在任何阶段在叶组织、茎或根中观察到(数据未示出)。鉴于在pat.erecta或pat.erl1启动子控制下进行的ft表达诱导早期开花和每个苤节增加的豆荚，ft转基因在植物分生组织处或附近的营养性表达通常可足以诱导这些生殖和产量相关表型或性状。
[0174]
通过详细描述本公开，显而易见的是，在不脱离如在本文中和在所附权利要求书中描述的本公开的精神和范围的情况下可能有改进、变化和等效实施方案。另外，应理解，在本公开中的所有实施例均作为非限制性实施例提供。