冻干粉制备的制作方法

冻干粉制备
1.领域
2.本公开大体上涉及制剂领域，更具体地，本公开涉及冻干粉。
3.背景
4.胶原蛋白是一组由多种糖蛋白分子组成的大家族，结缔组织的主要蛋白质成分，约占人体总蛋白的25％。到目前为止，发现了至少30余种胶原蛋白链的编码基因，这些不同的胶原蛋白链，以不同的方式组合，可以至少形成16种以上的胶原蛋白分子。16种不同类型的胶原蛋白分子大多是由3条α链绞合而成，形似棒状。其中有的由3条相同的α链如[α1]3组成均相三聚体，也有的由3条不同的α链如[α1]2α2或α1α2α3组成异相三聚体。α链的大小一般在600至1000个氨基酸间变化。新的胶原蛋白链以及胶原蛋白类型正在不断地被发现。在分子结构上，每条胶原肽链主要由gly-x-y(x、y是gly之外的任何氨基酸残基)三联体重复构成，这种独特的结构是形成胶原纤维高级结构所必需的，它决定了胶原蛋白优良的生物相容性和低免疫原性，已广泛应用于医药、保健品及化妆品行业中。
[0005]
生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。利用基因工程技术，选用各种宿主细胞，如转基因动物、转基因植物、昆虫细胞、细菌、酵母等生产重组人胶原蛋白和明胶，产品具有安全性好、重现性好、质量稳定等优点，解决了传统提取方法存在的诸如疯牛病病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等性能。未来重组胶原蛋白产品应用也会逐步取代动物源胶原蛋白，尤其在高端领域的应用上。
[0006]
概述
[0007]
一方面，本公开涉及冻干粉，其包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇，其中所述蔗糖占所述冻干粉的1.0％至2.0％重量比，以及所述甘露醇占所述冻干粉的1.0％至2.0％重量比。
[0008]
另一方面，本公开涉及制备冻干粉的冻干方法，其包括：
[0009]
在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇的溶液降温至-35℃至-45℃，从而得到固体；
[0010]
在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-5℃至5℃，从而得到粉末；以及
[0011]
在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度升高至20℃至30℃，从而得到所述冻干粉，
[0012]
其中所述冻干粉包括重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇。
[0013]
再一方面，本公开涉及冻干粉，所述冻干粉由包括如下步骤的冻干方法制备得到：
[0014]
在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇的溶液降温至-35℃至-45℃，从而得到固体；
[0015]
在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-5℃至5℃，从而得到粉末；以及
[0016]
在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度升高至20℃至30℃，从而得到所述冻干粉，
[0017]
其中所述冻干粉包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇。
[0018]
附图简要说明
[0019]
图1示出了本公开实施例17中重组iii型人源化胶原蛋白冻干前后的sds-page图。
[0020]
详述
[0021]
在以下的说明中，包括某些具体的细节以对各个公开的实施方案提供全面的理解。然而，相关领域的技术人员会认识到，不采用一个或多个这些具体的细节，而采用其它方法、部件、材料等的情况下仍实现实施方案。
[0022]
除非本技术中另有要求，在整个说明书和所附的权利要求书中，词语“包括”、“包含”、“含有”和“具有”应解释为开放式的、含括式的意义，即“包括但不限于”。
[0023]
在本公开和所附权利要求书中使用时，除非上下文另有明确规定，否则不带数量指示的单数指称物包括复数指称物。
[0024]
在整个说明书中提到的“一实施方案”、“实施方案”、“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”意指在至少一实施方案中包括与该实施方案所述的相关的具体参考要素、结构或特征。因此，在整个说明书中不同位置出现的短语“在一实施方案中”或“在实施方案中”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”不必全部指同一实施方案。此外，具体要素、结构或特征可以任何适当的方式在一个或多个实施方案中结合。
[0025]
应当理解，在本公开的说明书和所附的权利要求书中用到的单数形式的冠词“一”(对应于英文“a”、“an”和“the”)包括复数的对象，除非文中另外明确地规定。因此，例如提到的包含“重组人源化胶原蛋白”的冻干粉包括一种重组人源化胶原蛋白，或两种或多种重组人源化胶原蛋白。
[0026]
定义
[0027]
在本公开中，术语“重组人源化胶原蛋白”系指由dna重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。
[0028]
在本公开中，术语“iii型”系指基于胶原蛋白col3a1基因或部分基因编码的重组胶原蛋白。
[0029]
在本公开中，术语“蔗糖”系指由一分子葡萄糖的半缩醛羟基与一分子果糖的半缩醛羟基彼此缩合脱水而成并具有如下结构的物质
[0030][0031]
在本公开中，术语“海藻糖”系指由由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成并
其具有如下的结构的物质：
[0032][0033]
在本公开中，术语“甘露醇”系指具有如下结构的物质：
[0034][0035]
在本公开中，术语“磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,pbs)”系指主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl的缓冲液。
[0036]
在某些实施方案中，术语“共晶点温度”系指物料中水分完全冻结成冰晶时的温度。
[0037]
在本公开中，术语“再分散性”系指完全复溶时间。
[0038]
在本公开中，术语“冻干”，即真空冷冻干燥，系指先将物料冻结到共晶点温度以下，使物料中的水分变成固态的冰，然后在适当的真空度下，使冰直接升华为水蒸汽，再用真空系统中的水汽凝结器将水蒸汽冷凝，从而获得干燥制品的技术。
具体实施方式
[0039]
一方面，本公开涉及冻干粉，其包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇，其中所述蔗糖占所述冻干粉的约1.0％至约2.0％重量比，以及所述甘露醇占所述冻干粉的约1.0％至约2.0％重量比。
[0040]
在某些实施方案中，所述蔗糖占所述冻干粉的1.0％至2.0％重量比。
[0041]
在某些实施方案中，所述蔗糖占所述冻干粉的约1.5％重量比。
[0042]
在某些实施方案中，所述甘露醇占所述冻干粉的1.0％至2.0％重量比。
[0043]
在某些实施方案中，所述甘露醇占所述冻干粉的约1.5％重量比。
[0044]
在某些实施方案中，所述蔗糖占所述冻干粉的约1.5％重量比，以及所述甘露醇占所述冻干粉的约1.5％重量比。
[0045]
在某些实施方案中，水占所述冻干粉的约4％至6％重量比。
[0046]
在某些实施方案中，水占所述冻干粉的4％至6％重量比。
[0047]
在某些实施方案中，水占所述冻干粉的5％重量比。
[0048]
在某些实施方案中，冻干粉基本上由重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇组成，其中所述蔗糖占所述冻干粉的约1.0％至约2.0％重量比，以及所述甘露醇占所述冻干粉的约1.0％至约2.0％重量比。
[0049]
在某些实施方案中，冻干粉由重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖、甘露醇和其他不可避免的杂质组成，其中所述蔗糖占所述冻干粉的约1.0％至约2.0％重量比，以及所述甘露醇占所述冻干粉的约1.0％至约2.0％重量比。
[0050]
在某些实施方案中，重组iii型人源化胶原蛋白冻干后质量标准与冻干前一致。
[0051]
在某些实施方案中，本公开的冻干粉中水分含量低，具有较高的稳定性。
[0052]
在某些实施方案中，本公开的冻干粉适合贮藏和运输。
[0053]
另一方面，本公开涉及制备冻干粉的冻干方法，其包括：
[0054]
在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇的溶液降温约至-35℃至约-45℃，从而得到固体；
[0055]
在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至约-5℃至约5℃，从而得到粉末；以及
[0056]
在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度升高至约20℃至约30℃，从而得到所述冻干粉，
[0057]
其中所述冻干粉包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇。
[0058]
在某些实施方案中，在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至约-15℃至约-25℃，然后升高至约-10℃至约-15℃，最后再升高至约-5℃至约5℃。
[0059]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃至-25℃，然后升高至-10℃至-15℃，最后再升高至-5℃至5℃。
[0060]
在某些实施方案中，在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后升高至-10℃，最后再升高至0℃。
[0061]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度在1至2小时内升高至-15℃至-25℃。
[0062]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度在2小时内升高至-15℃。
[0063]
在某些实施方案中，在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度在约1至约2小时内升高至约-15℃至约-25℃，维持约12至约15小时。
[0064]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度在1至2小时内升高至-15℃至-25℃，维持12至15小时。
[0065]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，维持15小时。
[0066]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度在2小时内升高至-15℃，维持15小时。
[0067]
在某些实施方案中，在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至约-15℃，然后在约0.5至约1小时内升高至约-10℃至约-15℃。
[0068]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后在0.5至1小时内升高至-10℃至-15℃。
[0069]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后在0.5小时内升高至-10℃。
[0070]
在某些实施方案中，在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至
约-15℃，然后在约0.5至约1小时内升高至约-10℃至约-15℃，维持约10至约12小时。
[0071]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后在0.5至1小时内升高至-10℃至-15℃，维持约10至约12小时。
[0072]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后升高至-10℃，维持12小时。
[0073]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后在0.5小时内升高至-10℃，维持12小时。
[0074]
在某些实施方案中，在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至约-15℃，然后升高至约-10℃，最后在约1至约2小时内再升高至约-5℃至约5℃。
[0075]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后升高至-10℃，最后在1至2小时内再升高至-5℃至5℃。
[0076]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后升高至-10℃，最后在2小时内再升高至0℃。
[0077]
在某些实施方案中，在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至约-15℃，然后升高至约-10℃，最后在约1至约2小时内再升高至约-5℃至约5℃，维持约2至约5小时。
[0078]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后升高至-10℃，最后在1至2小时内再升高至-5℃至5℃，维持2至5小时。
[0079]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后升高至-10℃，最后再升高至0℃，维持2小时。
[0080]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至-15℃，然后升高至-10℃，最后在2小时内再升高至0℃，维持2小时。
[0081]
在某些实施方案中，在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度在约0.5至约1.5小时升高至约20℃至约30℃。
[0082]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度在0.5至1.5小时升高至20℃至30℃。
[0083]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度在1小时内升高至25℃。
[0084]
在某些实施方案中，在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度在约0.5至约1.5小时升高至约20℃至约30℃，维持约5至约8小时。
[0085]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度在0.5至1.5小时升高至20℃至30℃，维持5至8小时。
[0086]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度升高至25℃，维持7小时。
[0087]
在某些实施方案中，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度在1小时内升高至25℃，维持7小时。
[0088]
在某些实施方案中，包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇的溶液的共晶点温度约为-15℃至-8℃。
[0089]
在某些实施方案中，包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇的溶液的ph约
为6.0
±
0.1。
[0090]
在某些实施方案中，包含重组iii型人源化胶原蛋白溶液中含约20mmol/l的磷酸盐缓冲盐溶液。
[0091]
在某些实施方案中，重组iii型人源化胶原蛋白在包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇的溶液中的含量约为20至50g/l。
[0092]
在某些实施方案中，将包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇的溶液预冷至5℃至-5℃，在真空度为0.20
±
0.05mbar下，将包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇的溶液降温至-35℃至-45℃，从而得到固体。
[0093]
在某些实施方案中，将包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇的溶液以2ml/瓶的规格灌装于西林瓶中进行冻干。
[0094]
在某些实施方案中，本公开的方法适合大规模生产。
[0095]
在某些实施方案中，使用本公开的冻干方法，重组iii型人源化胶原蛋白冻干后质量标准与冻干前一致。
[0096]
再一方面，本公开涉及由冻干方法制备得到的冻干粉，所述冻干方法包括：
[0097]
在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将包含重组iii型人源化胶原蛋白、蔗糖和甘露醇的溶液降温约至-35℃至约-45℃，从而得到固体；
[0098]
在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述固体的温度升高至约-5℃至约5℃，从而得到粉末；以及
[0099]
在真空度约为0.20
±
0.05mbar下，将所述粉末的温度升高至约20℃至约30℃，从而得到所述冻干粉，
[0100]
在某些实施方案中，使用本公开的方法得到的冻干粉中重组iii型人源化胶原蛋白冻干后质量标准与冻干前一致。
[0101]
在某些实施方案中，使用本公开的方法得到的冻干粉中水分含量低，具有较高的稳定性。
[0102]
在某些实施方案中，使用本公开的方法得到的冻干粉适合贮藏和运输。
[0103]
下文中，本公开将通过如下实施例进行详细解释以便更好地理解本技术的各个方面及其优点。然而，应当理解，以下的实施例是非限制性的而且仅用于说明本公开的某些实施方案。
[0104]
实施例
[0105]
本公开的实施例中使用的试剂和设备均为常规的并且可商购的。
[0106]
例如：
[0107]
重组iii型人源化胶原蛋白，华北制药股份有限公司生物技术分公司；20200302批次
[0108]
蔗糖，湖南九典制药股份有限公司；cas号：57-50-1
[0109]
甘露醇，湖南九典制药股份有限公司；cas号：887-78-5
[0110]
na2hpo4，国药化学试剂；cas号：7558-79-4
[0111]
nah2po4，国药化学试剂；cas号：10049-21-5
[0112]
nacl，山东肥城精制盐厂有限公司；cas号：7647-14-5
[0113]
精密分析天平(瑞士mettler toledo al104-ic)、ph计(雷磁phs-25)、电磁搅拌器
(德国ika公司ets-d4)、冻干机(北京四环起航科技有限公司lgj-s30)、电泳仪(bio-rad)、紫外分光光度计(上海欣茂仪器有限公司uv-7540)
[0114]
制备实施例
[0115]
实施例1
[0116]
称取1.0g蔗糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0117]
(1)预冻：预冻温度为0℃，真空度为0.15mbar，用1.5h降温至-40℃，维持2h；
[0118]
(2)升华干燥：保持真空度为0.15mbar，1.5h升温到-15℃，维持12h；0.5h升温到-10℃，维持10h；2h升温到5℃，维持2h。
[0119]
(3)解析干燥：调节真空度为0.20mbar,1h升温到20℃，维持8h，得到所述的冻干粉。
[0120]
实施例2
[0121]
称取1.5g蔗糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0122]
(1)预冻：预冻温度为5℃，真空度为0.2mbar，用1h降温至-45℃，维持2h；
[0123]
(2)升华干燥：调节真空度为0.15mbar，1.5h升温到-15℃，维持12h；0.5h升温到-10℃，维持10h；2h升温到5℃，维持2h；以及
[0124]
(3)解析干燥：保持真空度为0.15mbar,1.5h升温到25℃，维持7h，得到所述的冻干粉。
[0125]
实施例3
[0126]
称取2.5g蔗糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0127]
(1)预冻：预冻温度为-5℃，真空度为0.25mbar，用0.5h降温至-35℃，维持3h；
[0128]
(2)升华干燥：调节真空度为0.15mbar，2h升温到-20℃，维持14h；1h升温到-15℃，维持12h；1.5h升温到0℃，维持3h；以及
[0129]
(3)解析干燥：调节真空度为0.20mbar,1h升温到30℃，维持5h，得到所述的冻干粉。
[0130]
实施例4
[0131]
称取10g蔗糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0132]
(1)预冻：预冻温度为-10℃，真空度为0.20mbar，用1h降温至-40℃，维持2h；
[0133]
(2)升华干燥：调节真空度为0.25mbar，1h升温到-25℃，维持12h；1h升温到-15℃，维持10h；1h升温到5℃，维持5h；以及
[0134]
(3)解析干燥：调节真空度为0.20mbar,0.5h升温到25℃，维持7h，得到所述的冻干粉。
[0135]
实施例5
[0136]
称取1.0g海藻糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0137]
(1)预冻：预冻温度为0℃，真空度为0.15mbar，用2h降温至-35℃，维持2h；
[0138]
(2)升华干燥：保持真空度为0.15mbar，1h升温到-20℃，维持14h；0.5h升温到-10℃，维持12h；2h升温到5℃，维持4h；以及
[0139]
(3)解析干燥：调节真空度为0.20mbar,1h升温到20℃，维持8h，得到所述的冻干粉。
[0140]
实施例6
[0141]
称取1.5g海藻糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0142]
(1)预冻：预冻温度为-10℃，真空度为0.25mbar，用1h降温至-45℃，维持3h；
[0143]
(2)升华干燥：保持真空度为0.25mbar，1h升温到-15℃，维持13h；0.5h升温到-15℃，维持10h；2h升温到0℃，维持2h；以及
[0144]
(3)解析干燥：调节真空度为0.20mbar,0.5h升温到25℃，维持7h，得到所述的冻干粉。
[0145]
实施例7
[0146]
称取2.5g海藻糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0147]
(1)预冻：预冻温度为-5℃，真空度为0.20mbar，用1.5h降温至-35℃，维持2.5h；
[0148]
(2)升华干燥：调节真空度为0.25mbar，0.5h升温到-20℃，维持15h；0.5h升温到-10℃，维持12h；1h升温到5℃，维持5h；以及
[0149]
(3)解析干燥：保持真空度为0.25mbar,1h升温到30℃，维持6h，得到所述的冻干粉。
[0150]
实施例8
[0151]
称取10g海藻糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0152]
(1)预冻：预冻温度为5℃，真空度为0.25mbar，用1.5h降温至-35℃，维持3h；
[0153]
(2)升华干燥：调节真空度为0.20mbar，2h升温到-25℃，维持15h；0.5h升温到-15℃，维持12h；1h升温到0℃，维持3h；以及
[0154]
(3)解析干燥：调节真空度为0.25mbar,1h升温到30℃，维持5h，得到所述的冻干粉。
[0155]
实施例9
[0156]
称取1.0g甘露醇于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶
的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0157]
(1)预冻：预冻温度为0℃，真空度为0.15mbar，用2h降温至-40℃，维持2h；
[0158]
(2)升华干燥：调节真空度为0.20mbar，2h升温到-15℃，维持15h；1h升温到-10℃，维持12h；2h升温到0℃，维持5h；以及
[0159]
(3)解析干燥：保持真空度为0.20mbar,0.5h升温到25℃，维持8h，得到所述的冻干粉。
[0160]
实施例10
[0161]
称取1.5g甘露醇于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0162]
(1)预冻：预冻温度为-10℃，真空度为0.25mbar，用0.5h降温至-35℃，维持3h；
[0163]
(2)升华干燥：保持真空度为0.25mbar，2h升温到-20℃，维持13h；0.5h升温到-15℃，维持10h；1h升温到-5℃，维持3h；以及
[0164]
(3)解析干燥：保持真空度为0.25mbar,0.5h升温到30℃，维持7h，得到所述的冻干粉。
[0165]
实施例11
[0166]
称取2.5g甘露醇于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0167]
(1)预冻：预冻温度为0℃，真空度为0.20mbar，用1h降温至-45℃，维持2h；
[0168]
(2)升华干燥：调节真空度为0.25mbar，2h升温到-25℃，维持14h；0.5h升温到-10℃，维持12h；1h升温到0℃，维持4h；以及
[0169]
(3)解析干燥：保持真空度为0.25mbar,1h升温到20℃，维持6h，得到所述的冻干粉。
[0170]
实施例12
[0171]
称取10g甘露醇于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0172]
(1)预冻：预冻温度为-5℃，真空度为0.20mbar，用0.5h降温至-35℃，维持2h；
[0173]
(2)升华干燥：保持真空度为0.20mbar，1h升温到-15℃，维持15h；1h升温到-10℃，维持11h；1h升温到-5℃，维持5h；以及
[0174]
(3)解析干燥：调节真空度为0.15mbar,1.5h升温到30℃，维持5h，得到所述的冻干粉。
[0175]
实施例13
[0176]
称取100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0177]
(1)预冻：预冻温度为5℃，真空度为0.15mbar，用2h降温至-40℃，维持2h；
[0178]
(2)升华干燥：保持真空度为0.15mbar，1.5h升温到-20℃，维持12h；1h升温到-10
℃，维持11h；1h升温到0℃，维持2h；以及
[0179]
(3)解析干燥：调节真空度为0.20mbar,1h升温到25℃，维持7h，得到所述的冻干粉。
[0180]
实施例14
[0181]
称取1.5g蔗糖、1.5g甘露醇、1.5g海藻糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0182]
(1)预冻：预冻温度为0℃，真空度为0.15mbar，用1h降温至-35℃，维持3h；
[0183]
(2)升华干燥：保持真空度为0.15mbar，2h升温到-15℃，维持15h；0.5h升温到-10℃，维持12h；2h升温到0℃，维持2h；以及
[0184]
(3)解析干燥：保持真空度为0.20mbar,1h升温到30℃，维持8h，得到所述的冻干粉。
[0185]
实施例15
[0186]
称取1.5g蔗糖、1.5g海藻糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0187]
(1)预冻：预冻温度为5℃，真空度为0.25mbar，用1h降温至-35℃，维持2h；
[0188]
(2)升华干燥：调节真空度为0.15mbar，1.5h升温到-20℃，维持15h；1h升温到-15℃，维持10h；2h升温到-5℃，维持4h；以及
[0189]
(3)解析干燥：保持真空度为0.15mbar,0.5h升温到20℃，维持8h，得到所述的冻干粉。
[0190]
实施例16
[0191]
称取1.5g甘露醇、1.5g海藻糖于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0192]
(1)预冻：预冻温度为-10℃，真空度为0.20mbar，用2h降温至-35℃，维持2h；
[0193]
(2)升华干燥：保持真空度为0.2mbar，2h升温到-20℃，维持13h；0.5h升温到-10℃，维持12h；2h升温到5℃，维持5h；以及
[0194]
(3)解析干燥：调节真空度为0.25mbar,1.5h升温到30℃，维持5h，得到所述的冻干粉。
[0195]
实施例17
[0196]
称取1.5g蔗糖、1.5g甘露醇于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0197]
(1)预冻：预冻温度为5℃，真空度为0.20mbar，用2h降温至-40℃，维持2h；
[0198]
(2)升华干燥：保持真空度为0.2mbar，1h升温到-15℃，维持15h；0.5h升温到-10℃，维持12h；2h升温到0℃，维持2h；以及
[0199]
(3)解析干燥：保持真空度为0.2mbar,1h升温到25℃，维持7h，得到所述的冻干粉。
[0200]
实施例18
[0201]
称取1.0g蔗糖、1.0g甘露醇于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0202]
(1)预冻：预冻温度为0℃，真空度为0.15mbar，用1h降温至-35℃，维持2h；
[0203]
(2)升华干燥：调节真空度为0.2mbar，1h升温到-25℃，维持15h；0.5h升温到-15℃，维持10h；2h升温到-5℃，维持5h；以及
[0204]
(3)解析干燥：保持真空度为0.2mbar,0.5h升温到20℃，维持6h，得到所述的冻干粉。
[0205]
实施例19
[0206]
称取2.0g蔗糖、2.0g甘露醇于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0207]
(1)预冻：预冻温度为-5℃，真空度为0.25mbar，用0.5h降温至-35℃，维持3h；
[0208]
(2)升华干燥：调节真空度为0.2mbar，2h升温到-15℃，维持12h；1h升温到-10℃，维持12h；1h升温到5℃，维持2h；以及
[0209]
(3)解析干燥：调节真空度为0.15mbar,1.5h升温到25℃，维持8h，得到所述的冻干粉。
[0210]
实施例20
[0211]
称取1.0g蔗糖、2.0g甘露醇于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0212]
(1)预冻：预冻温度为-10℃，真空度为0.20mbar，用1h降温至-40℃，维持2h；
[0213]
(2)升华干燥：调节真空度为0.25mbar，1h升温到-15℃，维持12h；1h升温到-10℃，维持12h；2h升温到0℃，维持2h；以及
[0214]
(3)解析干燥：调节真空度为0.15mbar,1.5h升温到20℃，维持6h，得到所述的冻干粉。
[0215]
实施例21
[0216]
称取2.0g蔗糖、1.0g甘露醇于100ml重组iii型人源化胶原蛋白溶液(蛋白含量20-50g/l、缓冲液为20mmol/lpbs，ph6.0
±
0.1)中，搅拌混匀，至完全溶解，0.22μm过滤除菌后按2ml/瓶的规格分装至灭菌的西林瓶中，冷冻干燥，得到冻干粉。具体冷冻步骤如下：
[0217]
(1)预冻：预冻温度为0℃，真空度为0.15mbar，用2h降温至-45℃，维持2h；
[0218]
(2)升华干燥：调节真空度为0.25mbar，2h升温到-15℃，维持15h；0.5h升温到-10℃，维持10h；1h升温到0℃，维持5h；以及
[0219]
(3)解析干燥：调节真空度为0.20mbar,1h升温到25℃，维持7h，得到所述的冻干粉。
[0220]
效果实施例
[0221]
1.外观：目视观察，冻干粉外表是否平整、饱满，无明显塌陷、萎缩。
[0222]
2.色泽：目视观察，冻干粉是否颜色均匀，无分层和色差。
[0223]
3.再分散性：取冻干粉用2ml纯化水复溶，目视观察，记录完全复溶的时间。
[0224]
表1.配方评价指标
[0225][0226]
依据上述标准，对各个实施例进行评分分析，结果见表2。
[0227]
表2.实施例1至21的冻干粉的评分结果
[0228]
[0229][0230]
复溶实施例
[0231]
冻干品复溶后进行蛋白含量、纯度(酶解法)和sds-page检测，对各实施例比冻干前后重组iii型人源化胶原蛋白质量变化。
[0232]
选取实施例17的冻干粉，打开西林瓶盖，取2ml纯化水加入，记录加入时间a，自然溶解，目视观察，记录完全溶解时间b，复溶时间即为c＝b-a。
[0233]
取完全复溶的溶液，用紫外分光光度计在562nm处测定吸光度值，并以纯胶原标准品配制6管试液，分别测定吸光度，做标准曲线，以吸光度为纵坐标，计算样品的蛋白含量值。
[0234]
取完全复溶的溶液，用sds-page法测定，主峰面积百分比与标准品比对，计算样品的纯度。
[0235]
表3.冻干前后结果
[0236][0237]
实施例18至实施例21的冻干粉具有与实施例17类似的性质。
[0238]
在本公开中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。
[0239]
从前述中可以理解，尽管为了示例性说明的目的描述了本公开的具体实施方案，但是在不偏离本公开的精神和范围的条件下，本领域所述技术人员可以作出各种变形或改进。这些变形或修改都应落入本公开所附权利要求的范围。