使用M13噬菌体优化环状单链DNA的制作方法

使用m13噬菌体优化环状单链dna
1.相关申请
2.根据35 u.s.c.
§
119(e)，本技术要求于2019年5月15日提交的题为“optimization of circular single stranded dna using m13 phage”的美国临时申请号62/848,449的优先权，出于所有目的将该申请通过引用全部并入本文。
3.发明背景
4.单链dna(ssdna)可用于各种生物技术应用包括基因组编辑、基因合成、基因治疗和药物递送。常规方法产生具有各种长度的ssdna，然后将其纯化以获得单分散长度的ssdna。因此，产生具有均一长度的ssdna的方法可以消除对劳动密集型和昂贵的纯化步骤的需要。
5.发明概述
6.本文提供了用于产生具有均一长度的单链dna(ssdna)的组合物和方法，其是快速且成本有效的。在一些实施方案中，使用来自丝状噬菌体的工程化起始子序列和工程化终止子序列实现产生均一长度的ssdna。
7.因此，本公开内容的一个方面提供了包含来自丝状噬菌体的工程化起始子序列和工程化终止子序列的工程化核酸；和目的dna序列，其中所述目的dna序列位于所述工程化起始子序列的3'和所述工程化终止子序列的5'。
8.在一些实施方案中，工程化核酸还包含选择性标记。在一些实施方案中，工程化核酸是单链的。在一些实施方案中，工程化核酸是双链的。在一些实施方案中，工程化核酸是线性的。在一些实施方案中，工程化核酸是环状的。在一些实施方案中，工程化核酸是环状和双链的。
9.在一些实施方案中，工程化起始子序列包含与seq id no:1具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，工程化起始子序列包含与seq id no:2具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，工程化起始子序列包含与seq id no:2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，工程化起始子序列包含seq id no:2。在一些实施方案中，工程化终止子序列包含与seq id no:1具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，工程化终止子序列包含seq id no:3。在一些实施方案中，工程化终止子序列包含与seq id no:3具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
10.在一些实施方案中，目的dna序列的长度为100至20000个核苷酸。
11.在一些实施方案中，本公开内容的方面提供了宿主细胞，其包含(a)包含来自丝状噬菌体的工程化起始子序列和工程化终止子序列的工程化核酸；和目的dna序列，其中目的dna序列位于工程化起始子序列的3'和工程化终止子序列的5'，和(b)核酸辅助质粒，其用于表达能够将单链dna(ssdna)组装成噬菌体的多种噬菌体蛋白。
12.在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，多种噬菌体蛋白包括p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9、p10和p11。
13.在一些实施方案中，本公开内容的方面提供了一种用于产生具有均一长度的单链dna(ssdna)的方法，其包含(a)在适于从工程化核酸中的目的dna序列产生ssdna和从核酸辅助质粒产生多种噬菌体蛋白的条件下培养本文提供的宿主细胞；(b)允许ssdna和多种噬菌体蛋白组装成工程化噬菌体；和(c)收集所述工程化噬菌体。
14.在一些实施方案中，本文提供的方法还包括从工程化噬菌体中提取ssdna。在一些实施方案中，至少90％的ssdna与目的dna序列长度相同。在一些实施方案中，至少95％的ssdna与目的dna序列长度相同。在一些实施方案中，ssdna的长度为100至20000个核苷酸。在一些实施方案中，ssdna是环状的。
15.本发明的若干实施方案的细节在所附实施例、附图和详细描述中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从以下描述和权利要求中显而易见。
附图说明
16.图1显示了长度可控的工程化噬菌体产生的示意图。当与在大肠杆菌中表达m13噬菌体蛋白的m13-f1辅助质粒共转化时，inho质粒产生特定长度的环状单链dna(ssdna)。ssdna用五种衣壳蛋白包装，并且组装的工程化噬菌体从细胞中挤出。
17.图2显示了原始和工程化m13核心起点的dna序列(用于dna复制)。(顶框)核心起点作为起始子以及终止子通过滚环机制进行( )链复制。α序列是dna复制终止所必需的，而δ序列是启动dna复制所必需的。(左框)为了消除完成dna复制的能力，去除核心起点中的α序列。该工程化起始子用于启动dna复制。(右框)没有δ序列的核心起点用于终止dna复制。
18.图3a显示了用于产生具有475bp ssdna的工程化噬菌体的inho质粒图谱。构建inho质粒，使得在工程化起始子和工程化终止子之间插入475bp。
19.图3b显示了根据本文描述的技术的一些实施方案产生的具有475bp ssdna的工程化噬菌体的大小分布图。
20.图3c显示了从根据本文描述的技术的一些实施方案产生的具有475bp ssdna的工程化噬菌体中提取的ssdna的凝胶电泳的琼脂糖凝胶的图片。
21.图4a显示了inho质粒图谱，其说明通过在工程化起始子和工程化终止子之间缺失或插入任意大小的dna序列来控制工程化噬菌体的大小。
22.图4b显示了根据本文描述的技术的一些实施方案产生的具有475、2064、3504、6600和9900bp ssdna的工程化噬菌体的大小分布图。
23.图4c显示了根据本文描述的技术的一些实施方案产生的具有475、2064、3504、6600和9900bp ssdna的工程化噬菌体的tem图像。比例尺为50nm。
24.图5显示了相对于dna长度(bp)绘制的工程化噬菌体长度(nm)的图。噬菌体的大小与dna长度成线性比例。圆圈表示野生型m13噬菌体。
25.发明详述
26.噬菌体f1的dna复制起点含有用于病毒链合成的起始和终止的核苷酸序列。本公开提供了用于起始或终止的dna复制起点的核苷酸序列的修饰形式。这些修饰形式，称为工程化的起始子和终止子序列，提供对位于它们之间的任何dna序列的严格且可重复的转录控制，从而能够产生具有均一长度的单链dna(ssdna)。这些工程化的起始子和终止子序列严格调节所产生的dna的大小的能力是相当令人惊讶的。先前对这些序列进行工程化的尝
press)。在一些实施方案中，使用gibson克隆产生工程化核酸(参见，例如，gibson，d.g.等人，nature methods，343-345，2009；和gibson，d.g.等人，nature methods，901-903，2010，其各自通过引用并入本文)。gibson通常在单管反应中使用三种酶促活性：5'核酸外切酶活性，dna聚合酶的3'延伸活性和dna连接酶活性。所述5'核酸外切酶活性回嚼(chew back)核酸序列的5'末端并暴露互补序列用于退火。然后聚合酶活性填充退火结构域上的间隙。然后dna连接酶密封切口并将dna片段共价连接在一起。相邻片段的重叠序列比golden gate assembly中使用的那些长得多，因此导致正确组装的百分比更高。产生工程化核酸的其他方法是本领域已知的，并且可以根据本公开内容使用。
38.工程化的起始子和终止子序列
39.工程化起始子序列是来自噬菌体的核酸序列，其已被修饰以消除终止子功能并维持起始子功能以产生具有均一长度的单链dna(ssdna)。工程化终止子序列是来自噬菌体的核酸序列，其已被修饰以维持终止子功能并消除起始子功能以产生具有均一长度的单链dna(ssdna)。因此，工程化起始子序列和工程化终止子序列不同于噬菌体的dna复制起点的天然存在的核酸序列。
40.在一些实施方案中，工程化起始子序列包含噬菌体的dna复制起点的修饰的核酸序列。在一些实施方案中，工程化起始子序列包含丝状噬菌体的dna复制起点的修饰的核酸序列。在一些实施方案中，工程化起始子序列包含噬菌体f1的dna复制起点的修饰的核酸序列。在一些实施方案中，工程化起始子序列包含噬菌体m13的dna复制起点的修饰的核酸序列。在一些实施方案中，工程化起始子序列包含噬菌体fd的dna复制起点的修饰的核酸序列。
41.在一些实施方案中，工程化终止子序列包含噬菌体的dna复制起点的修饰的核酸序列。在一些实施方案中，工程化终止子序列包含丝状噬菌体的dna复制起点的修饰的核酸序列。在一些实施方案中，工程化终止子序列包含噬菌体f1的dna复制起点的修饰的核酸序列。在一些实施方案中，工程化终止子序列包含噬菌体m13的dna复制起点的修饰的核酸序列。在一些实施方案中，工程化终止子序列包含噬菌体fd的dna复制起点的修饰的核酸序列。
42.在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化起始子序列包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化终止子序列包含至少一个修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的非限制性实例包括缺失、插入和一个核苷酸(例如腺苷)对另一个核苷酸(例如胞嘧啶)的取代。修饰的核酸序列与相应的天然核酸序列相差至少1个核苷酸。
43.在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化起始子序列包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个、至少十四个、至少十五个、至少二十个或至少二十五个修饰的核苷酸。
44.在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化终止子序列包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个、至少十四个、至少十五个、至少二十个或
至少二十五个修饰的核苷酸。
45.在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化起始子序列包含插入。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化起始子序列包含缺失。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化起始子序列包含取代。
46.在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化终止子序列包含插入。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化终止子序列包含缺失。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化终止子序列包含取代。
47.在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化起始子序列包含修饰的组合(例如，缺失和取代)。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化起始子序列包含缺失和取代。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化起始子序列包含插入和取代。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化起始子序列包含插入和缺失。
48.在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化终止子序列包含修饰的组合(例如，缺失和取代)。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化的终止子序列包含缺失和取代。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化终止子序列包含插入和取代。在一些实施方案中，与噬菌体的dna复制起点的核酸序列相比，工程化终止子序列包含插入和缺失。
49.表1提供了来自噬菌体f1的工程化起始子序列和工程化终止子序列的实例。
50.表1.来自噬菌体f1的工程化起始子和终止子序列的实例。
[0051][0052][0053]
在一些实施方案中，工程化起始子序列包含与seq id no:1中提供的噬菌体的dna复制起点的核酸序列具有至少75％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，工程化起始子序列包含与seq id no:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
[0054]
在一些实施方案中，工程化终止子序列包含与seq id no:1中提供的噬菌体的dna复制起点的核酸序列具有至少75％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，工程化终止子序列包含与seq id no:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
[0055]
在一些实施方案中，工程化起始子序列包含与seq id no:2具有至少75％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，工程化起始子序列包含与seq id no:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，工程化起始子序列包含seq id no:2。在一些实施方案中，工程化起始子序列由seq id no:2组成。在一些实施方案中，工程化起始子序列为seq id no:2。
[0056]
在一些实施方案中，工程化终止子序列包含与seq id no:3具有至少75％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，工程化终止子序列包含与seq id no:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，工程化终止子序列包含seq id no:3。在一些实施方案中，工程化终止子序列由seq id no:3组成。在一些实施方案中，工程化终止子序列为seq id no:3。
[0057]
目的dna序列
[0058]
本公开的方法和组合物涵盖任何目的dna序列。在一些实施方案中，目的dna序列包含基因组dna序列。在一些实施方案中，目的dna序列包含编码dna序列(例如，蛋白质编码序列)。在一些实施方案中，目的dna序列包含非编码dna序列(例如，非蛋白质编码dna序列)。
[0059]
本文提供的目的dna序列可以包含任何长度的序列。在一些实施方案中，目的dna序列具有100个核苷酸至20000个核苷酸或更多个核苷酸的长度。例如，目的dna序列可以具有100至19000个核苷酸、100至18000个核苷酸、100至17000个核苷酸、100至16000个核苷酸、100至15000个核苷酸、100至14000个核苷酸、100至13000个核苷酸、100至12000个核苷酸、100至11000个核苷酸、100至10000个核苷酸、100至9000个核苷酸、100至8000个核苷酸、100至7000个核苷酸、100至6000个核苷酸、100至5000个核苷酸、100至4000个核苷酸、100至3000个核苷酸、100至2000个核苷酸或100至1000个核苷酸的长度。在一些实施方案中，目的dna序列具有1000至19000个核苷酸、1000至18000个核苷酸、1000至17000个核苷酸、1000至16000个核苷酸、1000至15000个核苷酸、1000至14000个核苷酸、1000至13000个核苷酸、1000至12000个核苷酸、1000至11000个核苷酸、1000至10000个核苷酸、1000至9000个核苷酸、1000至8000个核苷酸、1000至7000个核苷酸、1000至6000个核苷酸、1000至5000个核苷酸、1000至4000个核苷酸、1000至3000个核苷酸、1000至2000个核苷酸、2000至10000个核苷酸、2000至9000个核苷酸、2000至8000个核苷酸、2000至7000个核苷酸、2000至6000个核苷酸、2000至5000个核苷酸、2000至4000个核苷酸或2000至3000个核苷酸的长度。在一些实施方案中，目的dna序列可具有至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000、至少2100、至少2200、至少2300、至少2400、至少2500、至少2600、至少2700、至少2800、至少2900、至少3100、至少3200、至少3300、至少3400、至少3500、至少3600、至少3700、至少3800、至少3900、至少4100、至少4200、至少4300、至少4400、至少4500、至少4600、至少4700、至少4800、至少4900、至少5100、至少5200、至少5300、至少5400、至少5500、至少5600、至少5700、至少5800、至少5900、至少6600、至少6200、至少6300、至少6400、至少6500、至少6600、至少6700、至少6800、至少6900、至少7100、至少7200、至少7300、至少7400、至少7500、至少7600、至少7700、至少7800、至少7900、至少8100、至少8200、至少8300、至少8400、至少8500、至少8600、至少8700、至少8800、
至少8900、至少9100、至少9200、至少9300、至少9400、至少9500、至少9600、至少9700、至少9800、至少9900、至少10000、至少10100、至少10200、至少10300、至少10400、至少10500、至少10600、至少10700、至少10800、至少10900、至少11000；至少11100、至少11200、至少11300、至少11400、至少11500、至少11600、至少11700、至少11800、至少11900、至少12000、至少12100、至少12200、至少12300、至少12400、至少12500、至少12600、至少12700、至少12800、至少12900、至少13000、至少13100、至少13200、至少13300、至少13400、至少13500、至少13600、至少13700、至少13800、至少13900、至少14000、至少14100、至少14200；至少14300、至少14400、至少14500、至少14600、至少14700、至少14800、至少14900、至少15000、至少15100、至少15200、至少15300、至少15400、至少15500、至少15600、至少15700、至少15800、至少15900、至少16000、至少16100、至少16200、至少16300、至少16400、至少16500、至少16600、至少16700、至少16800、至少16900、至少17000、至少17100、至少17200、至少17300、至少17400、至少17500；至少17600、至少17700、至少17800、至少17900、至少18000、至少18100、至少18200、至少18300、至少18400、至少18500、至少18600、至少18700、至少18800、至少18900、至少19000、至少19100、至少19200、至少19300、至少19400、至少19500、至少19600、至少19700、至少19800、至少19900或至少20000个核苷酸，并且各自具有任选的10100个核苷酸的上限。
[0060]
宿主细胞
[0061]
在一些实施方案中，本公开的宿主细胞使用本文所述的工程化核酸可用于产生具有均一长度的ssdna序列。因此，本文提供的宿主细胞包含至少一种工程化核酸，并因此在结构上和/或功能上与其天然存在的对应物不同。在一些实施方案中，宿主细胞包含工程化核酸。
[0062]
如果在细胞中产生由核酸(例如，工程化核酸)编码的产物，则宿主细胞“表达”产物(例如，ssdna)。本领域已知的是，基因表达是指使用核酸形式的遗传指令来合成产物(例如ssdna或蛋白质)的过程。
[0063]
在一些实施方案中，宿主细胞还包含核酸辅助质粒。核酸辅助质粒是指在宿主细胞中表达至少一种噬菌体蛋白的质粒。在一些实施方式中，核酸辅助质粒表达至少一种能够包封ssdna的噬菌体蛋白。在一些实施方案中，核酸辅助质粒表达至少一种能够从宿主细胞挤出包封的ssdna的噬菌体蛋白。本文所述的核酸辅助质粒可表达多种噬菌体蛋白质。在一些实施方案中，多种噬菌体蛋白包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或至少十一种噬菌体蛋白。在一些实施方案中，多种噬菌体蛋白选自由p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9、p10和p11组成的组。在一些实施方案中，所述多种蛋白质包括p3、p6、p7、p8和p9。
[0064]
如本文所述的核酸辅助质粒可以包含或不包含包装信号。在一些实施方案中，核酸辅助质粒包含包装信号。在一些实施方案中，核酸辅助质粒缺乏包装信号。
[0065]
在一些实施方式中，核酸辅助质粒包含至少一种可以掺入目的ssdna中或其上的额外的功能元件。在一些实施方案中，工程化核酸包含至少一种可掺入目的ssdna中或其上的额外的功能元件。所述至少一种额外的功能元件可以是例如单向导rna或crispr-rna(sgrna或crrna)、反义dna、反义rna、至少一种蛋白质或其组合。反义rna可以是例如rnai、mirna、pirna或sirna。所述至少一种蛋白质可以是治疗性的、非治疗性的或其组合。在一些
实施方案中，所述至少一种蛋白质包含cas蛋白、tal效应蛋白或锌指蛋白。在一些实施方案中，宿主细胞还表达单独的或与cas蛋白组合的单向导rna或crispr-rna(sgrna或crrna)。因此，本文提供的组合物和方法可用于将包括crispr/cas系统的基因编辑组合物包装到ssdna中。
[0066]
在一些实施方案中，宿主细胞表达选择性标记。选择标记通常用于选择在转染细胞后(或在用于将外源核酸引入细胞的其他程序后)已经摄取并表达工程化核酸的宿主细胞。
[0067]
宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其他类型的细胞。
[0068]
本公开的细菌细胞包括但不限于埃希氏菌属(escherichia spp.)、链霉菌属(streptomyces spp.)、发酵单胞菌属(zymomonas spp.)、醋酸杆菌属(acetobacter spp.)、柠檬酸菌属(citrobacter spp.)、集胞藻属(synechocystis spp.)、根瘤菌属(rhizobium spp.)、梭菌属(clostridium spp.)、棒状杆菌(corynebacterium spp.)、链球菌属(streptococcus spp.)、黄单胞菌属(xanthomonas spp.)、乳酸杆菌属(lactobacillus spp.)、乳球菌属(lactococcus spp.)、芽孢杆菌属(bacillus spp.)、产碱杆菌属(alcaligenes spp.)、假单胞菌属(pseudomonas spp.)、气单胞菌属(aeromonas spp.)、固氮菌属(azotobacter spp.)、毛单胞菌属(comamonas spp.)、分枝杆菌属(mycobacterium spp.)、红球菌属(rhodococcus spp.)、葡糖杆菌属(gluconobacter spp.)、罗尔斯通菌属(ralstonia spp.)、嗜酸硫杆菌属(acidithiobacillus spp.)、小月菌属(microlunatus spp.)、地杆菌属(geobacter spp.)、地芽孢杆菌属(geobacillus spp.)、节杆菌属(arthrobacter spp.)、黄杆菌属(flavobacterium spp.)、沙雷氏菌属(serratia spp.)、糖多孢菌属(saccharopolyspora spp.)、栖热菌属(thermus spp.)、窄食单胞菌属(stenotrophomonas spp.)、色杆菌属(chromobacterium spp.)、中华根瘤菌属(sinorhizobium spp.)、糖多孢菌属(saccharopolyspora spp.)、农杆菌属(agrobacterium spp.)和泛菌属(pantoea spp.)。在一些实施方案中，本公开的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
[0069]
产生单链dna(ssdna)的方法
[0070]
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物提供各自包含基本上相同长度的ssdna的工程化噬菌体。从工程化噬菌体中提取ssdna产生具有均一长度的ssdna。如本文所用，“具有均一长度的ssdna”是指长度基本上相同的ssdna。
[0071]
在一些实施方案中，产生具有均一长度的ssdna的方法包括(a)在适于产生由工程化核酸中的目的dna序列编码的ssdna和适于从核酸辅助质粒产生多种噬菌体蛋白的条件下培养本文提供的宿主细胞，(b)允许ssdna和多种噬菌体蛋白组装成工程化噬菌体；和(c)收集所述工程化噬菌体。
[0072]“培养”是指宿主细胞在受控条件下(通常在其天然环境之外)生长的过程。例如，宿主细胞，如包含工程化核酸的宿主细胞，可以在液体营养肉汤(也称为液体“培养基”)中作为细胞悬浮液生长。
[0073]
常用的细菌大肠杆菌生长培养基的实例包括但不限于lb(lysogeny broth)miller肉汤(1％nacl)：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％nacl；lb(lysogeny broth)
lennox肉汤(0.5％nacl)：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％nacl；sob培养基(super optimal broth)：2％蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mm nacl、2.5mm kcl、10mm mgcl2、10mm mgso4；soc培养基(super optimal broth with catabolic repressor)：sob 20mm葡萄糖；2
×
yt肉汤(2
×
酵母提取物和胰蛋白胨)：1.6％蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％nacl；tb(terrific broth)培养基：1.2％蛋白胨、2.4％酵母提取物、72mm k2hpo4、17mm kh2po4和0.4％甘油；和sb(super broth)培养基：3.2％蛋白胨、2％酵母提取物和0.5％nacl和/或korz培养基(korz,dj等人，1995)。高密度细菌大肠杆菌生长培养基的实例包括但不限于dnagro
tm
培养基、progro
tm
培养基、autox
tm
培养基、detox
tm
培养基、indux
tm
培养基和secpro
tm
培养基。
[0074]
在一些实施方案中，在导致ssdna表达的条件下培养宿主细胞。这样的培养条件可取决于所表达的特定ssdna和产生的ssdna的所需量。
[0075]
在一些实施方案中，宿主细胞在30℃至40℃的温度下培养。例如，宿主细胞可以在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃的温度下培养。通常，宿主细胞，例如包含本文提供的工程化核酸的大肠杆菌细胞，在37℃的温度下培养。
[0076]
在一些实施方案中，将宿主细胞培养12小时至72小时或更长的时间段。例如，可以将宿主细胞培养12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72小时。通常，将宿主细胞，例如包含本文提供的工程化核酸的大肠杆菌细胞，培养12至24小时的时间段。在一些实施方案中，工程化细胞在37℃的温度下培养12至24小时。
[0077]
在一些实施方案中，将宿主细胞培养(例如，在液体细胞培养基中)至在600nm波长(od
600
)下测量为5至200的光密度。在一些实施方案中，将宿主细胞培养至od
600
为5、10、15、20、25、50、75、100、150或200。在一些实施方案中，将宿主细胞培养至在600nm波长(od
600
)下测量为0.1至5的光密度。在一些实施方案中，将宿主细胞培养至od
600
为0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5。
[0078]
在一些实施方案中，将宿主细胞培养至密度为1
×
108(od《1)至2
×
10
11
(od～200)个活细胞/ml细胞培养基。在一些实施方案中，将宿主细胞培养至密度为1
×
108、2
×
108、3
×
108、4
×
108、5
×
108、6
×
108、7
×
108、8
×
108、9
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7x
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、1
×
10
11
或2
×
10
11
个活细胞/ml。(转换因子：od 1＝8
×
108个细胞/ml)。
[0079]
在一些实施方案中，在生物反应器中培养宿主细胞。生物反应器是指在其中培养细胞的容器，例如培养瓶、皿或袋，其可以是单次使用的(一次性的)、可高压灭菌的或可灭菌的。生物反应器可以由玻璃制成，或者它可以是基于聚合物的，或者它可以由其他材料制成。
[0080]
本公开的方法包括ssdna的大规模生产。对于大规模生产方法，宿主细胞可以在体积为5升(l)至250000l或更大的液体培养基中生长。在一些实施方案中，宿主细胞可以在体积大于(或等于)10l、100l、1000l、10000l或100000l的液体培养基中生长。在一些实施方案中，宿主细胞在体积为5l、10l、15l、20l、25l、30l、35l、40l、45l、50l、100l、500l、1000l、5000l、10000l、100000l、150000l、200000l、250000l或更大的液体培养基中生长。在一些实施方案中，宿主细胞可以在体积为5l至10l、5l至15l、5l至20l、5l至25l、5l至30l、5l至35l、
5l至40l、5l至45l、10l至15l、10l至20l、10l至25l、20l至30l、10l至35l、10l至40l、10l至45l、10l至50l、15l至20l、15l至25l、15l至30l、15l至35l、15l至40l、15l至45l或15l至50l的液体培养基中生长。在一些实施方案中，宿主细胞可以在体积为100l至300000l、100l至200000l或100l至100000l的液体培养基中生长。
[0081]
通常，培养宿主细胞之后收集包含ssdna的工程化噬菌体。在一些实施方案中，收集工程化噬菌体包括收集包含所述工程化噬菌体的上清液。在一些实施方案中，使用离心收集包含工程化噬菌体的上清液。在一些实施方案中，使用切向流过滤收集包含工程化噬菌体的上清液。
[0082]
本文提供的方法包括从工程化噬菌体中提取ssdna。在一些实施方案中，从工程化噬菌体中提取ssdna包括聚乙二醇(peg)提取。在一些实施方案中，从工程化噬菌体中提取ssdna包括苯酚-氯仿提取。在一些实施方案中，从工程化噬菌体提取ssdna包括异丙醇提取。
[0083]
在一些实施方案中，本文提供的方法产生浓度为1-50g/l的ssdna。在一些实施方案中，本文提供的方法产生浓度为5-50g/l、10-50g/l、15-50g/l、20-50g/l、25-50g/l、30-50g/l、35-50g/l、40-50g/l或45-50g/l的ssdna。在一些实施方案中，本文提供的方法产生浓度为1-45g/l、1-40g/l、1-35g/l、1-30g/l、1-25g/l、1-20g/l、1-15g/l、1-10g/l或1-5g/l的ssdna。
[0084]
在一些实施方案中，本文提供的方法从位于工程化核酸中的工程化起始子序列和工程化终止子序列之间的目的dna序列产生ssdna。在一些实施方案中，至少80％的由目的dna产生的ssdna具有与目的dna序列相同的长度。在一些实施方案中，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的由目的dna序列产生的ssdna具有与目的dna序列相同的长度。
[0085]
本文提供的方法包括产生具有任何序列的ssdna。在一些实施方案中，ssdna包含基因组dna序列。在一些实施方案中，ssdna包含编码dna序列。在一些实施方案中，ssdna包含非编码dna序列。
[0086]
本文提供的方法包括产生具有任何长度的ssdna。在一些实施方案中，ssdna具有100个核苷酸至20000个核苷酸或更多个核苷酸的长度。例如，ssdna可以具有100至19000个核苷酸、100至18000个核苷酸、100至17000个核苷酸、100至16000个核苷酸、100至15000个核苷酸、100至14000个核苷酸、100至13000个核苷酸、100至12000个核苷酸、100至11000个核苷酸、100至10000个核苷酸、100至9000个核苷酸、100至8000个核苷酸、100至7000个核苷酸、100至6000个核苷酸、100至5000个核苷酸、100至4000个核苷酸、100至3000个核苷酸、100至2000个核苷酸或100至1000个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ssdna具有1000至10000个核苷酸、1000至9000个核苷酸、1000至8000个核苷酸、1000至7000个核苷酸、1000至6000个核苷酸、1000至5000个核苷酸、1000至4000个核苷酸、1000至3000个核苷酸、1000至2000个核苷酸、2000至10000个核苷酸、2000至9000个核苷酸、2000至8000个核苷酸、2000至7000个核苷酸、2000至6000个核苷酸、2000至5000个核苷酸、2000至4000个核苷酸或2000至3000个核苷酸的长度。
[0087]
在一些实施方案中，ssdna可具有至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、
至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000、至少2100、至少2200、至少2300、至少2400、至少2500、至少2600、至少2700、至少2800、至少2900、至少3100、至少3200、至少3300、至少3400、至少3500、至少3600、至少3700、至少3800、至少3900、至少4100、至少4200、至少4300、至少4400、至少4500、至少4600、至少4700、至少4800、至少4900、至少5100、至少5200、至少5300、至少5400、至少5500、至少5600、至少5700、至少5800、至少5900、至少6600、至少6200、至少6300、至少6400、至少6500、至少6600、至少6700、至少6800、至少6900、至少7100、至少7200、至少7300、至少7400、至少7500、至少7600、至少7700、至少7800、至少7900、至少8100、至少8200、至少8300、至少8400、至少8500、至少8600、至少8700、至少8800、至少8900、至少9100、至少9200、至少9300、至少9400、至少9500、至少9600、至少9700、至少9800、至少9900、至少10000至少10100、至少10200、至少10300、至少10400、至少10500、至少10600、至少10700、至少10800、至少10900、至少11000、至少11100、至少11200、至少11300、至少11400、至少11500至少11600、至少11700、至少11800、至少11900、至少12000、至少12100、至少12200、至少12300、至少12400、至少12500、至少12600、至少12700、至少12800、至少12900、至少13000、至少13100、至少13200、至少13300、至少13400、至少13500、至少13600、至少13700、至少13800、至少13900、至少14000、至少14100、至少14200、至少14300、至少14400、至少14500、至少14600、至少14700、至少14800、至少14900、至少15000、至少15100、至少15200、至少15300、至少15400、至少15500、至少15600、至少15700、至少15800、至少15900、至少16000、至少16100、至少16200、至少16300、至少16400、至少16500、至少16600、至少16700、至少16800、至少16900、至少17000、至少17100、至少17200、至少17300、至少17400、至少17500、至少17600、至少17700、至少17800、至少17900、至少18000、至少18100、至少18200、至少18300、至少18400、至少18500、至少18600、至少18700、至少18800、至少18900、至少19000、至少19100、至少19200、至少19300、至少19400、至少19500、至少19600、至少19700、至少19800、至少19900或至少20000个核苷酸。
[0088]
一旦在细胞中产生ssdna寡核苷酸，它就可以在细胞中使用或从细胞中分离。从细胞分离的ssdna寡核苷酸可用于任何使用ssdna寡核苷酸的目的。例如，它们可以是治疗性寡核苷酸，其可以施用于其他细胞或体内施用于受试者如动物或人。或者，它们可以用于研究或构建诸如纳米结构的结构或用于dna折纸(origami)方法。
[0089]
应当理解，本文所述的ssdna寡核苷酸可以被设计为产生任何基于核酸的纳米结构的物质。另外，该系统产生独特的元件，包括可用于开发新结构元件的dna/rna杂合体。
[0090]
本公开内容的方面涉及通过在细胞中合成一种或多种ssdna寡核苷酸并使ssdna寡核苷酸经受促进dna引导的自组装以产生核酸纳米结构的条件来制备核酸纳米结构的方法。在一些实施方案中，通过使用本文公开的工程化分子用至少一种第一核酸转化细胞，并用至少一种第二核酸转化细胞，在细胞中合成一组寡核苷酸。在一些实施方案中，将ssdna寡核苷酸从细胞中分离并纯化。
[0091]
dna纳米结构是由一种或多种核酸(包括寡核苷酸和更长的核酸及其组合)使用核酸的一个或多个粘性末端以组装由程序化碱基配对驱动的三维结构而制成的结构。术语“程序化碱基配对”表示不同核酸的粘性末端被设计成确保特定核酸通过其互补粘性末端的相互作用，从而对核酸在结构内的位置进行编程。预定位置表示结构中每个核酸的最终位置基于其粘性末端的序列和位置以及结构中其他核酸结构单元的粘性末端的序列和位
置，使得多个核酸只能以一种特定方式组装。
[0092]
本发明的方法可用于(分离的或在其产生的细胞内)复杂结构和有用装置的纳米制造，基本上具有任何形状、结构或尺寸。
[0093]
用于产生纳米结构的核酸通常具有用于构建结构的核心和粘性末端。核心可包括例如4个臂分支接头、3个臂分支接头、双交叉、三交叉、平行四边形、8个螺旋束、6管结构和使用在较小辅助链的帮助下折叠的一条或多条长核酸链组装的结构。核心还可以包括蛋白质特异性结合位点或其他调节或非调节元件。选择使用哪种类型的核酸在本领域技术人员的水平内。
[0094]
纳米结构可以例如通过本领域公知的dna折纸技术制备。本发明还包括根据本发明制备的纳米结构。纳米结构可具有任何已知纳米结构的形状尺寸、一致性、组分，但它们是由体内合成的ssdna寡核苷酸制成。纳米结构也可以是纳米机器人，其可以在细胞内执行各种功能。
[0095]
本发明的一些方面涉及通过在细胞中合成dna寡核苷酸来调节细胞中基因表达的方法，其中dna寡核苷酸是调节性寡核苷酸，并使细胞用dna寡核苷酸调节基因表达。在一些实施方案中，dna寡核苷酸是反义寡核苷酸。
实施例
[0096]
为了可以更全面地理解本文所述的本发明，阐述了以下实施例。提供本技术中描述的实施例以说明本文提供的方法和组合物，并且不应以任何方式解释为限制其范围。
[0097]
实施例1：材料和方法。
[0098]
菌株和培养基
[0099]
大肠杆菌xll-blue(agilent technologies，santa clara，ca，usa)用于所有分子克隆和m13噬菌体培养。lb-miller培养基(bd，franklin lakes，nj，usa)和lb 1.5％琼脂(bd，franklin lakes，nj，usa)平板用于分子克隆和m13噬菌体培养。soc生长培养基(new england biolabs，ipswich，ma，usa)用于转化恢复。
[0100]
工程化m13噬菌体的产生
[0101]
基因工程化的inho和m13-f1质粒在大肠杆菌xll-blue中共转化，并在含有氨苄青霉素(100mg/l)和卡那霉素(50mg/l)的lb-琼脂平板上培养过夜。挑取生长的单菌落并在70ml含有氨苄青霉素和卡那霉素的lb培养基中培养过夜。将培养物在4℃下以10000g离心30分钟，并收集含有工程化噬菌体的上清液。为了进行噬菌体纯化，将20ml 50％peg8000(sigma aldrich，st.louis，mo，usa)(w/v)和10ml 5m nacl溶液混合。将混合物在4℃下孵育24小时，然后在4℃下以20000g离心30分钟。去除上清液，并将噬菌体沉淀重悬于2ml 1xtae缓冲液中。
[0102]
从工程化m13噬菌体中提取ssdna
[0103]
将1μl dnase i溶液(2500u/ml，thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)加入噬菌体溶液中，伴有50mm mgcl2和13mm cacl2，并在37℃下孵育10分钟以去除所有不需要的dna。为了灭活dnase i，将噬菌体混合物在65℃下加热10分钟。在dnase i处理后，可以使用qiaprep spin m13试剂盒(qiagen，germantown，md，usa)或其他标准乙醇沉淀方案从工程化噬菌体中分离ssdna。
[0104]
工程化噬菌体的tem表征
[0105]
通过jeol 2010 advanced high performance tem测量工程化噬菌体的大小，加速电压为200kv。将10μl噬菌体溶液沉积在具有碳薄膜的tem铜网格上并孵育3分钟。将10μl 10倍稀释的乙酸双氧铀替代溶液(ted pella，redding，ca，usa)沉积在样品上并孵育20分钟。在表征之前浸泡过量的溶液。通过imagej分析tem图像中工程化噬菌体的大小。
[0106]
实施例2：用于产生具有均一长度的ssdna的工程化噬菌体的系统。
[0107]
丝状m13噬菌体是含有ssdna的病毒家族，其仅感染革兰氏阴性细菌。在感染大肠杆菌后，由于f1复制起点(f1-ori)的存在，表达m13噬菌体蛋白的m13单链基因组以滚环方式通过正( )链复制而合成。复制的ssdna在细胞膜中与衣壳蛋白组装，并且噬菌体颗粒从宿主细胞中挤出。在本文提供的系统中，m13噬菌体基因组的功能分为两种质粒-inho噬菌粒和m13-f1辅助质粒。如图1所示，inho噬菌粒在m13噬菌体蛋白存在下产生环状ssdna，并且m13-f1辅助质粒表达用于m13噬菌体组装和dna复制的所有噬菌体蛋白。inho质粒中有两个工程化的f1-ori序列(正方形)，并且两个f1-ori序列之间的线成为单链基因组，其决定了工程化噬菌体的大小。产生的ssdna基因组被主要外壳蛋白(p8)和次要外壳蛋白(p3、p6、p7、p9)包封并从细菌体挤出。
[0108]
从大肠杆菌培养基中纯化后，获得单分散的工程化m13噬菌体颗粒。这些噬菌体的长度与包封的ssdna的大小直接相关，所述包封的ssdna根据需要通过inho噬菌粒工程化。因此，本文所述的系统提供了对随后可以从收集的工程化噬菌体中提取的ssdna的碱基和长度的不受限制的灵活性。
[0109]
设计inho质粒以确保最小化外来碱基对掺入最终噬菌体ssdna，从而消除不需要的ssdna副产物。对于丝状m13噬菌体复制，单链噬菌体dna在感染时进入细胞质并通过宿主酶转化为双链复制形式(rf)。噬菌体复制蛋白(p2)与( )链起点结合，并且在特定的单链位点处发生切口。( )链的复制以滚环方式在切口位点处起始，并通过切割和环化复制的ssdna在相同位点处终止。因此，图2(顶框)中( )链合成的核心起始序列具有起始和终止ssdna复制的作用。
[0110]
在本文所述的系统中，( )链复制的核心f1-ori被基因改造以分离其功能，以便开发不同的起始子和终止子。先前报道α序列仅是复制终止所需的(dotto等，pnas，1982)。敲除来自核心起点的序列以去除其终止dna复制的能力，这产生仅作为起始子起作用的工程化f1-ori序列(图2(左框))。为了制备终止子，扰动核心起点的p2结合位点之一。当p2结合位点中的一个(
‘
δ’序列)从f1-ori中消除时，工程化的f1-ori序列不能启动( )链合成的复制。结果，没有δ序列的工程化f1-ori用作f1-ori终止子(图2(右框))。
[0111]
实施例3：产生具有均一长度的ssdna的工程化噬菌体。
[0112]
起始子和终止子f1-ori序列位于inho噬菌粒中，并且起始子和终止子之间的dna序列(由图1中inho质粒外的双侧箭头表示)在宿主细胞中产生。如图3a所示，构建了在f1-ori起始子和终止子之间具有475个碱基的inho475mδ噬菌粒。inho475mδ噬菌粒与m13-f1质粒共转化产生了具有475bp ssdna的工程化噬菌体(ep475mδ)。使用tem测量ep475mδ的大小分布。培养的工程化噬菌体显示约97.5％的均一长度，为95.0
±
3.2nm(图3b)。将dnase i加入纯化的工程化噬菌体溶液以去除任何不需要的外部dna链。从溶液中灭活和去除dnase i后，如本文所述分离来自er475mδ的环状ssdna。提取的ssdna通过凝胶电泳显示出显著的单
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[0126]
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[0127]
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