一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法与流程

1.本发明涉及基因工程和代谢工程领域，具体涉及一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌及其制备方法。


背景技术：

2.伯克氏菌目属于细菌中变形菌门的β-变形菌纲，被发现能够存在于水和土壤等多种生态环境中，包括具有致病性的一属和环境友好型的一属。据统计，伯克氏菌能够分泌包括各种具有蛋白水解活性和溶血活性的胞外酶在内的多种次级代谢产物。伯克氏菌中聚酮合酶途径和非核糖体多肽途径的总量只低于放线菌，伯克氏菌目前成为继放线菌之后的天然产物来源的第二大类细菌，然而其中大部分生物合成基因簇为未开发或者沉默的，想要对这些未知基因簇加以开发和利用，则必须借助有效的基因操作工具和表达宿主实现未知基因簇的原位激活和异源表达。
3.申请人前期的专利申请，公开号为cn109234211a的发明申请公开了一株伯克霍尔德氏菌jp2-270(保藏编号为cctcc no：m 2018703)，是一株分离自水稻根系的革兰氏阴性生防细菌，其对水稻纹枯病、稻瘟病和恶苗病具有抑菌作用，具有一定的防治效果。jp2-270属于洋葱伯克霍尔德氏菌群(burkholderiacepacia complex，bcc)，该菌群是一组表型相近但基因型不同的复合物。
4.2020年，hertweck和challis课题组在确认戊二酰亚胺单元的核心生物合成基因后，先后通过基因组挖掘的手段，从伯克霍尔德氏菌中鉴定出新型戊二酰亚胺类天然产物剑兰制霉菌素(genomics-driven discovery of a novel glutarimide antibiotic from burkholderia gladioli reveals an unusual polyketide synthase chain release mechanism,angewandte chemie international edition,2020)。剑兰制霉菌素对几种人类癌细胞系具有良好的活性并抑制肿瘤细胞迁移，它含有一种不寻常的2-酰基-4-羟基-3-甲基丁烯内酯。聚酮合酶的c端的afsa-样结构域被证明可以催化3-酮硫酯与磷酸二羟基丙酮的缩合，因此表明它在聚酮链释放和丁烯内酯形成中起关键作用。
5.随着公共基因组信息的倍数增加，利用基因组挖掘策略，有望发现更多具有新颖结构和良好活性的戊二酰亚胺类天然产物。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种用于生产双氢剑兰制霉菌素(dihydrogladiostatin)的伯克霍尔德氏菌(burkholderia)及其制备方法。
7.本发明提供了一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，命名为伯克霍尔德氏菌jp2-270δ38940，由伯克霍尔德氏菌jp2-270敲除了dm992_38940基因得到，双氢剑兰制霉菌素的化学结构式如如图11所示。优选的，dm992_38940基因的dna序列如seq id no.1所示。
8.具体的，将基因序列如seq id no.3所示的插入基因片段38940up和基因序列如seq id no.4所示的插入基因片段38940dw同时连接至制备的线性化pk18mobsacb载体上，制备用于dm992_38940基因敲除质粒pk18-38940，将质粒pk18-38940转入伯克霍尔德氏菌jp2-270感受态细胞，筛选获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，其中质粒pk18-38940的基因序列如seq id no.5所示。
9.本发明还提供了用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌在制备双氢剑兰制霉菌素中的应用。
10.本发明还提供了一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌的制备方法，方法如下：将伯克霍尔德氏菌jp2-270中dm992_38940基因敲除，获得用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌。具体的，基因敲除的具体步骤如下：基因敲除时，将基因序列如seq id no.3所示的插入基因片段38940up和基因序列如seq id no.4所示的插入基因片段38940dw同时连接到制备的线性化pk18mobsacb载体上，制备用于基因敲除的质粒pk18-38940，将质粒pk18-38940转入伯克霍尔德氏菌jp2-270感受态细胞，筛选得到用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌。优选的，采用电转化法，将质粒pk18-38940转入伯克霍尔德氏菌jp2-270感受态细胞。
11.本发明提供了一种用于制备双氢剑兰制霉菌素的方法，方法如下：发酵培养用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌后，将获得的发酵液采用乙酸乙酯抽提，抽提液进行旋转蒸发并收集沉淀物，沉淀物用甲醇溶液溶解后得到粗提物；粗提物依次经sephadex lh-20色谱柱分离和ods柱纯化得到双氢剑兰制霉菌素。具体的，所述粗提物经sephadex lh-20色谱柱分离，用无水甲醇洗脱，得到10个馏分；将第5馏分进一步用ods柱进行纯化，用80％的甲醇洗脱，得到12个馏分，在第5个馏分中得到双氢剑兰制霉菌素。
12.本发明还提供了一种抗肿瘤化合物，命名为双氢剑兰制霉菌素，其化学结构式如图11所示。
13.本发明还提供了所述的抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，肿瘤类型为胶质瘤。
14.本发明的有益效果在于：本发明提供一种用于生产双氢剑兰制霉菌素的伯克霍尔德氏菌，且其制备方法简单便捷。伯克霍尔德氏菌jp2-270产剑兰制霉菌素而基本不产双氢剑兰制霉菌素，或产生的双氢剑兰制霉菌素量少不足以检测到。本技术研究发现将该菌株的dm992_38940基因敲除后，得到的基因敲除菌株伯克霍尔德氏菌jp2-270δ38940能够产双氢剑兰制霉菌素，产生的双氢剑兰制霉菌素量大，且该双氢剑兰制霉菌素具有更好的抗肿瘤作用，特别是对胶质瘤具有更好的活性，在制备治疗肿瘤疾病药物方面具有潜在价值。
附图说明
15.图1为jp2-270(a)和jp2-270δ38940(b)代谢粗提物hplc分析图。
16.图2为剑兰制霉菌素(a)和双氢剑兰制霉菌素(b)高分辨率质谱图。
17.图3为剑兰制霉菌素(a)和双氢剑兰制霉菌素(b)1h谱图。
18.图4为剑兰制霉菌素(a)和双氢剑兰制霉菌素(b)
13
c谱图。
19.图5为剑兰制霉菌素hmqc谱图。
20.图6为双氢剑兰制霉菌素hmqc谱图。
21.图7为剑兰制霉菌素hmbc谱图。
22.图8为双氢剑兰制霉菌素hmbc谱图。
23.图9为剑兰制霉菌素cosy谱图。
24.图10为双氢剑兰制霉菌素cosy谱图。
25.图11为双氢剑兰制霉菌素结构式图。
26.图12为剑兰制霉菌素(1)和双氢剑兰制霉菌素(2)hmbc、cosy示意图。
具体实施方式
27.实施例1
28.质粒提取、载体制备及基因克隆与纯化。
29.1.质粒提取步骤如下：
30.伯克霍尔德氏菌jp2-270及其衍生菌株最适生长条件为：luria-bertani培养基(lb培养基)，28℃。lb液体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl 10g，h2o 1000ml，ph为7.2，常规灭菌后使用。若为固体培养基，在灭菌前向其中添加琼脂15g/l。接一新鲜单克隆伯克霍尔德氏菌jp2-270于3ml lb液体中过夜培养，菌悬浮液保藏于20％甘油中，于-80℃冰箱冻存。每次活化伯克霍尔德氏菌jp2-270均从-80℃冰箱中取出，用无菌接种环挑取适量于lb固体培养基表面划线。
31.将含有pk18mobsacb质粒(为本课题实验室保藏质粒)的e.coli dh5α菌株划线接种至lb固体平板上(含km)，于37℃培养箱中培养12h。从平板上挑取单菌落接种至20ml灭菌的lb液体培养基中(含km)，37℃，200rpm，摇晃培养过夜。然后收集菌体，用质粒提取试剂盒axygen(ap-mn-p-250)提取质粒，具体操作步骤按说明书操作。
32.2.线性线性化载体制备
33.提取的pk18mobsacb质粒按照(10
×
buffer：10μl，质粒：10μl-20μl，酶1(ecori)：1μl，酶2(sali)：1μl，ddh2o补足100μl)配制双酶切反应体系，将配制好的酶切反应体系于37℃恒温静置30min进行酶切反应。酶切反应结束后，将酶切反应混合液在0.8％的琼脂糖凝胶电泳上分离，用axgen dna胶回收试剂盒(ap-gx-50)对大片段(5.7bp)进行回收，立即使用或于-20℃保存备用。
34.3.dm992_38940基因上下游同源臂基因克隆和纯化
35.dm992_38940基因的dna和氨基酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。使用在线引物设计软件primer 3，根据伯克霍尔德氏菌jp2-270基因组中dm992_38940基因及其上下游序列，设计dm992_38940框内基因缺失引物，为了不引起下游基因的移码突变，上游臂扩增引物反向引物序列的3’端最后一个碱基应位于dm992_38940起始密码atg开始的3n处(n为自然数，3n代表碱基数量)。同理，下游臂扩增引物正向引物序列的5’端最后一个碱基应位于dm992_38940终止密码子taa上游3n处。使用引物38940upf和38940upr扩增dm992_38940基因上游序列，使用引物38940dwf和38940dwr扩增dm992_38940基因下游序列。引物列表如表1所示。
36.表1引物列表
37.引物名称序列(5
’‑3’
)38940upfctatgacatgattacgaattccactgaaatctgtcgcggaga
38940uprtgaccgttgtacatgtacggatcgaggctcag38940dwfccgtacatgtacaacggtcaggcgattcc38940dwrcttgcatgcctgcaggtcgactacgccagctacaaggaccgm13fcgccagggttttcccagtcacgacm13ragcggataacaatttcacacagga
38.pcr反应体系：2
×
kod one pcr master mix 25μl，正向引物(10mm)：1μl，反向引物(10mm)：1μl，模板0.5μl(约50ng dna)，ddh2o补足50μl。
39.pcr反应程序如下：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸5s，此过程进行35个循环；之后终延伸10min。
40.pcr反应结束后，将pcr产物分别经1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，在紫外光下分别切下所扩增的目的条带，用axygen dna凝胶回收试剂盒(ap-gx-50)进行胶回收处理，纯化后的基因片段(片段38940up(序列如seq id no.3所示)、38940dw(序列如seq id no.4所示))可以立即使用或于-20℃保存备用。
41.实施例2
42.1.重组质粒的构建
43.根据同源重组的原理，用clonexpress ii one step cloning kit(c112-01)试剂盒，将纯化后的基因片段38940up和38940dw两个插入片段同时连接至制备的线性化pk18mobsacb载体上。按照说明书配制连接反应体系，将配好的连接反应体系轻轻混匀，37℃反应30min。反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒。之后可将重组产物保存于-20℃备用或直接用于转化。
44.上述重组反应产物转化到e.coli dh5α感受态细胞。采用热激法转化，从转化筛选平板上随机挑取若干单菌落作为模板，以载体上的引物m13f和m13r做菌落pcr，验证两个插入片段是否同时插入到线性化的pk18mobsacb载体中。将pcr扩增结果为阳性的单菌落接种至含km抗生素的lb液体培养基中，于37℃摇床中200rpm培养过夜，提取质粒送测序公司测序，将序列完全正确的质粒定名为pk18-38940(seq id no.5)保存进行下一步操作。
45.2.伯克霍尔德氏菌jp2-270同源重组双交换突变株的获得
46.采用电转化法，将pk18-38940转入伯克霍尔德氏菌jp2-270感受态细胞。通过km抗性的筛选获得成功转入的单交换突变株，经过再次抗性验证后进行无抗性的松弛培养，吸取传6-8代后的菌液100μl，加入到900μl的lb液体培养基中稀释，连续稀释至10-8倍，后涂铺于无抗生素的lb平板上。待单克隆长出后，用牙签挑取单克隆同时划线接种于含km抗性的lb平板和无抗性平板上(两个板上的克隆要一一对应)。28℃培养48h，挑取在km平板上不生长而无抗性平板上生长的菌落进行菌落pcr验证，引物使用38940upf/38940dwr。以重组质粒载体和伯克霍尔德氏菌jp2-270基因组分别为阳性和阴性对照，扩增片段大小与重组质粒载体扩增片段大小一致的为正确的双交换突变株，而扩增片段大小与伯克霍尔德氏菌jp2-270基因组大小一致的为回复突变株。获得的双交换突变株定名为伯克霍尔德氏菌jp2-270δ38940。
47.实施例3
48.伯克霍尔德氏菌jp2-270和伯克霍尔德氏菌jp2-270δ38940比较代谢物差异分析。
49.使用pda液体培养基对伯克霍尔德氏菌jp2-270和伯克霍尔德氏菌jp2-270δ38940进行发酵，全细胞发酵液采用乙酸乙酯抽提，抽提液进行旋转蒸发，沉淀物用甲醇溶液溶解后进行高效液相色谱分析。色谱条件：安捷伦色谱柱agilent zorbax sb-c18，250
×
9.2mm，5μm，流速：1ml/min，流动相从90％水和10％甲醇开始，30min内流动相梯度升至100％甲醇，检测波长210nm左右。
50.如图1所示，jp2-270δ38940和jp2-270的代谢物谱具有明显不同，jp2-270在24.611min有一个明显的特征峰，而jp2-270δ38940在相同的时间段没有明显的对应峰。但是，jp2-270δ38940在23.756min处有一明显的特征峰，在同样的时间段jp2-270却没有对应峰。表明dm992_38940基因的缺失导致了jp2-270中代谢物合成产生了明显差异。
51.实施例4
52.伯克霍尔德氏菌jp2-270和伯克霍尔德氏菌jp2-270δ38940差异代谢物的结构鉴定。
53.为了确定dm992_38940基因突变所产生的新的液相峰是何种物质，我们对jp2-270在24.611min和jp2-270δ38940在23.756min的液相峰进行了分离纯化和结构鉴定。
54.分离纯化：使用pda液体培养基对jp2-270和jp2-270δ38940进行发酵，发酵液采用乙酸乙酯抽提，抽提液进行旋转蒸发，沉淀物用甲醇溶液溶解后得到粗提物，粗提物经sephadex lh-20(1g：50g)色谱柱分离，用100％甲醇洗脱，得到10个馏分(每个20ml)。第5馏分进一步用ods(1g：50g)柱进行纯化，用80％的甲醇洗脱，得到12个馏分(每个20ml)，目标化合物在第5个馏分中纯化得到。得到的化合物经高效液相色谱分析(安捷伦1260型高效液相色谱仪，安捷伦色谱柱zorbax sb-c18，250
×
9.2mm，5μm，流速：1ml/min；紫外波长：210nm)表明该化合物纯度大于92％。
55.实施例5
56.伯克霍尔德氏菌jp2-270和伯克霍尔德氏菌jp2-270δ38940化合物结构鉴定。
57.化合物的结构是根据其紫外光谱、红外光谱、一维和二维核磁共振(nmr)光谱、高分辨质谱(hresims)数据和单晶x-射线衍射等方法相结合而确定。
58.jp2-270在24.611min产生的代谢物分子式c
27h39
no8；[α]d
20
88.2(c 0.50，meoh)；紫外光谱：uv(meoh)λ
max
(logε)203(4.21)nm；红外光谱：ir(meoh)ν
max
2926，2855，1767，1692，1378，1263，1184，1151，1031，965cm
–1；高分辨质谱(附图2)：hresims m/z[m h]

506.2747(计算值c
27h40
no
8 506.2754)，[m na]

528.2567(计算值c
27h39
nnao
8 528.2573)。通过化合物的1h谱(附图3)、
13
c谱(附图4)、hmqc谱(附图5)、hmbc谱(附图7)和cosy谱(附图9)分析，确定了化学结构，为剑兰制霉菌素，其
13
c和1h核磁共振信号归属见表2。它的hmbc、cosy相关示意图见附图12。
[0059]
表2剑兰制霉菌素和双氢剑兰制霉菌素
13
c和1h nmr数据
[0060][0061][0062]
a,b,c
标有相同字母a，b和c的
13
c和1h nmr数据可能会互换。
[0063]
jp2-270δ38940在23.756min产生的代谢物分子式c
27h37
no8；[α]d
20
74.2(c 0.50，meoh)；紫外光谱：uv(meoh)λ
max
(logε)203(4.20)nm；红外光谱：ir(meoh)ν
max
2927，2853，1767，1692，1378，1263，1186，1149，1035，967cm
–1；高分辨质谱(附图2)：hresims m/z[m na]

526.2410(计算值c
27h37
nnao
8 526.2410)。通过化合物的1h谱(附图3)、
13
c谱(附图4)、hmqc谱(附图6)、hmbc谱(附图8)和cosy谱(附图10)分析，确定了化学结构，为剑兰制霉菌素的双氢衍生物，我们命名为双氢剑兰制霉菌素(图11)，其
13
c和1h核磁共振信号归属见表2。它的hmbc和cosy相关示意图见附图12。
[0064]
dm992_38940基因突变后jp2-270产生的物质双氢剑兰制霉菌素比剑兰制霉菌素少了两个氢原子，双氢剑兰制霉菌素在c11和c12位是一双键，说明dm992_38940基因的功能是负责c11-c12位双键还原的。本技术提出了一种新的nadp(h)氧化还原酶，其在剑兰制霉菌素的合成过程中负责c11-c12位双键还原，在双氢剑兰制霉菌素转变成剑兰制霉菌素过
程中起关键作用。该氧化还原酶具有双键还原作用，具有良好的应用潜力。
[0065]
实施例6
[0066]
化合物双氢剑兰制霉菌素在抗胶质瘤细胞u87mg和u251增殖方面的活性优于化合物剑兰制霉菌素(表3)。在制备治疗肿瘤疾病药物方面具有潜在价值。
[0067]
表3剑兰制霉菌素和双氢剑兰制霉菌素对肿瘤细胞增殖的抑制活性
[0068][0069][0070]
dox：阿霉素(doxorubicin)。