一种特异性识别IYVLVMLVL肽段的荧光PCR引物组及其应用的制作方法

一种特异性识别iyvlvmlvl肽段的荧光pcr引物组及其应用
1.本发明要求申请号为202110687266.8，申请日为2021年06月21日，发明名称为“一种特异性识别iyvlvmlvl肽段的荧光pcr引物组及其应用”的中国专利的优选权。
技术领域
2.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种特异性识别iyvlvmlvl肽段的荧光pcr引物组及其应用。


背景技术：

3.ebv是可以感染人类的疱疹病毒家族的一员。ebv感染与某些类型的癌症有关。这些因ebv病毒感染所导致的癌症患者有望在tcr-t细胞治疗中获益。
4.tcr-t细胞治疗是有望治疗实体肿瘤的新一代免疫细胞疗法。在tcr-t细胞治疗的过程中，需要不断监测被输注到病人体内的药用tcr-t细胞的生长和续存的情况。能实现此目的技术手段中，荧光定量pcr(qpcr)是检测灵敏度很高的技术手段。利用qpcr监测tcr-t细胞，需要针对tcr-t细胞的特定tcr基因序列设计qpcr引物。然而现有技术并未发现针对tcr基因序列所设计的qpcr引物组应用于检测tcr-t细胞在病人体内生长和续存状况中。


技术实现要素：

5.针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种特异灵敏的追踪tcr-t细胞药物的引物组，尤其涉及一种特异性识别iyvlvmlvl肽段的荧光pcr引物组及其应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种tcr引物组，包括位点为l24-2和/或l24-49的引物对。
8.作为优选，所述引物组依据hlaa24分型，ebv病毒抗原肽段iyvlvmlvl的tcr设计。
9.作为优选，位点为l24-2的tcr引物对的序列如seq id no.1～2所示；
10.位点为l24-49的tcr引物对的序列如seq id no.3～4所示。
11.作为优选，位点为l24-2的tcr引物对的序列还如seq id no.6～7所示；
12.位点为l24-49的tcr引物对的序列还如seq id no.8～9所示。
13.本发明还提供了所述的引物组在制备特异性检测hlaa24分型患者体内ebv病毒抗原肽段iyvlvmlvl的tcr产品中的应用。
14.作为优选，所述产品为试剂盒产品。
15.作为优选，所述试剂盒为荧光定量pcr试剂盒。
16.本发明提供了一种特异性识别iyvlvmlvl肽段的荧光pcr引物组及其应用。本技术的引物组是根据hlaa24分型，ebv病毒抗原肽段iyvlvmlvl的tcr设计的。将本技术的引物组制备成荧光定量pcr试剂盒，追踪患者体内tcr-t细胞药物时，能特异的检测到药物的灵敏度为27个拷贝数的基因片段。
附图说明
17.图1为l24-2位点质粒dna标准品的扩增曲线(从左到右质粒dna标准品的稀释度分别为108拷贝、107拷贝、106拷贝、105拷贝、104拷贝、103拷贝、102拷贝、101拷贝的基因片段)。
18.图2为l24-2位点质粒dna标准品扩增产物的电泳图(从左到右质粒dna标准品的稀释度分别108拷贝、107拷贝、106拷贝、105拷贝、104拷贝、103拷贝、102拷贝、101拷贝的基因片段)。
19.图3为l24-2位点质粒dna标准品的标准曲线图。
20.图4为l24-2位点的tcr-t细胞药的基因组dna的扩增曲线(从左到右，基因组dna的稀释度分别为原液、10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释、10000倍稀释)。
21.图5为l24-2位点的tcr-t细胞药的基因组dna扩增产物的电泳图(从左到右基因组dna的稀释度分别为原液、10倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释、10000倍稀释)。
具体实施方式
22.在本发明中，所述位点为l24-2的tcr引物对的模板序列如seq id no.10所示；
23.所述位点为l24-49的tcr引物对的模板序列如seq id no.11所示。
24.本发明实施例中所述的tcr质粒标准品的构建方法为：
25.(1)将每个位点对应的tcr基因片段克隆至seq id no.5所示的质粒载体中，得到含有特定tcr基因片段的质粒载体；
26.(2)将含有特定tcr基因片段的质粒载体在大肠杆菌内扩增，提纯质粒dna，得到相应位点的tcr质粒标准品。
27.在本发明实施例中以l24-2位点为例设计方案，其余位点的检测方法与之相同。
28.在本发明实施例中所述的tcr-t细胞药的基因组dna为从相应的tcr-t药物细胞中提取的基因组dna。
29.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
30.实施例1引物设计
31.根据hlaa24分型，ebv病毒抗原肽段iyvlvmlvl的l24-2和l24-49位点设计得到的tcr引物。得到的引物的序列如seq id no.1～4和seq id no.6～9所示。
32.实施例2标准曲线建立
33.以tcr的l24-2位点为例设计方案。
34.取l24-2位点的质粒dna标准品的108个拷贝数稀释液、107个拷贝数稀释液、106个拷贝数稀释液、105个拷贝数稀释液、104个拷贝数稀释液、103个拷贝数稀释液、102个拷贝数稀释液、101个拷贝数稀释液，按照下述的反应体系和反应程序设置实时荧光pcr。
35.反应体系：pcr预混液10μl；正向引物0.4μl，引物浓度：10μm/μl；反向引物0.4μl，引物浓度：10μm/μl；rox reference dye(50
×
)0.2μl；tcr-t细胞药的基因组dna2μl，浓度50ng/μl，或tcr的质粒标准品dna2μl；nuclease-free water 7μl；总反应体系共20μl。
36.pcr反应程序：95℃，30s；(95℃，5s；60℃，20s)40个循环。设置参比荧光为rox，选择反应类型为sybr green reagents，选择荧光检测通道sybr，设置在60℃时采集荧光信号。
37.经实时荧光pcr扩增得到的l24-2位点质粒dna标准品的扩增曲线如图1所示。
38.将每个稀释度的质粒dna标准品的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
39.以扩增曲线的ct值为纵坐标，质粒dna标准品的log以10为底的基因片段拷贝数为横坐标建立标准曲线，标准曲线的结果如图3所示。计算公式为：y＝-3.5555x 41.485(r2＝0.9981)
40.由于计算公式中的r2≥0.95，则证明本实施例的标准曲线有效。
41.实施例3灵敏度检测
42.将针对l24-2位点的tcr-t细胞药的基因组dna原液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液、10000倍稀释液，根据实施例2实时荧光pcr的反应体系和程序进行扩增。得到针对l24-2位点的tcr-t细胞药的基因组dna的扩增曲线如图4所示。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。
43.将得到的每个稀释度的tcr-t细胞药的基因组dna的ct值代到实施例2的标准曲线中，可以计算得到每个稀释度的tcr-t细胞药的基因组dna的拷贝数。
44.经过计算，针对l24-2位点的tcr-t细胞药基因组dna原液的拷贝数为46766个拷贝，10倍稀释液的拷贝数为7998个拷贝、100倍稀释液的拷贝数为873个拷贝、1000倍稀释液的拷贝数为125个拷贝、10000倍稀释液的拷贝数为27个拷贝。由此可以得出，本实施例1得到的引物对于检测l24-2位点的tcr-t细胞药的灵敏度能达到27个拷贝。即，在实际应用中，引物在患者外周血样的基因组dna中最低可以检测到27个拷贝的tcr基因片段。
45.将l24-49位点的引物按照本实施例3的灵敏度的检测方法检测相对应位点的tcr-t细胞药，所得到的灵敏度均能达到27个拷贝。
46.实施例4
47.按照seq id no.12所示的质粒载体设置l24-2和l24-49位点对应的tcr基因片段，得到seq id no.13～14所示的基因片段，所述l24-2位点对应seq id no.13，l24-49位点对应seq id no.14。利用这两个位点设计引物来检测相应位点的tcr-t细胞药物，同样能得到实施例1～3所述引物和效果。
48.由以上实施例可知，本发明提供了一种特异性识别iyvlvmlvl肽段的荧光pcr引物组及其应用。本技术的引物组是根据hlaa24分型，ebv病毒抗原肽段iyvlvmlvl的tcr设计的。将本技术的引物组制备成荧光定量pcr试剂盒，追踪患者体内tcr-t细胞药物时，能特异的检测到27个拷贝数的tcr-t细胞药物。
49.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。