一种基于CRISPR基因编辑系统提高同源重组效率的方法与流程

一种基于crispr基因编辑系统提高同源重组效率的方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于crispr基因编辑系 统提高同源重组效率的方法。


背景技术：

2.crispr/cas系统作为目前应用最为广泛的基因编辑技术之一，可以通 过单链导向rna(single-guide rna,sgrna)的引导在基因组中特定的位点 产生双链断裂，随后借助宿主细胞的非同源末端连接(non-homology endjoining,nhej)与同源重组(homology-directed repair,hdr)两种主要的修复方 式来实现基因组编辑。尽管nhej发生的效率较高，但是其往往会导致断裂 位点产生随机的碱基插入和缺失，无法实现精确的编辑。相比之下，hdr 可以在人为提供供体模板的情况下实现包括基因插入、碱基替换等在内的几 乎所有形式的精确编辑。因而在实际应用中，hdr具有极大的应用前景， 但是其发生的概率远低于nhej，极大的限制了其发展。
3.目前已有多种方法用于同源重组效率的提高，总体来说可以分为两类。 一类是通过药物将细胞周期调节至hdr高效发生的时期，通过小分子抑制 剂抑制细胞的nhej修复方式或者直接使用促进hdr修复相关蛋白的活性 的小分子药物。但是这类方法存在的问题是需要施加药物去调整细胞的生长 状态，而我们知道nhej和hdr均为细胞维持自身基因组的两种重要的保 护细胞免受损伤的修复方式，这种通过提高我们想要的修复方式而去抑制另 一种修复方式的方法可能会让细胞抵御损伤的能力下降，造成不同程度的安 全隐患。另一类是通过改变供体的形式来提高同源重组，而其中双链供体虽 然效率较高，且具有方便获得等优势，但是其裸露的3
′‑
oh会成为宿主细胞 核酸酶的识别与攻击对象，导致同源重组率不高。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于crispr基因编辑系统提高 同源重组效率的方法，首次提供了融有链霉亲和素的cas9质粒、相应的具 有生物素修饰的同源供体、nhej荧光报告质粒提高同源重组效率。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种基于crispr基因编辑系统提高同源重组效率的方 法，包括向宿主细胞中引入融有链霉亲和素的cas9质粒和相应的具有生物 素修饰的同源供体。
7.在本发明中，还包括向宿主细胞中引入了nhej荧光报告质粒。
8.在本发明中，作为一种实施方式，所述引入融有链酶亲和素的cas9质 粒为px330-sa-hspcas9-sgrna或px330-hspcas9-sa-sgrna，所述相应的 具有生物素修饰的同源供体为bio-egfp-donor。本发明中所述 px330-sa-hspcas9-sgrna中的sgrna为人gapdh位点sgrna或猪 rosa26位点sgrna，所述px330-hspcas9-sa-sgrna中的sgrna为人 gapdh位点sgrna或猪rosa26位点sgrna，所述bio-egfp-donor为人 gapdh位点的同源供体或猪rosa26
位点同源供体。本发明中所述 px330-sa-hspcas9-sgrna或px330-hspcas9-sa-sgrna是以px330-hspcas9 为基础质粒，通过一步克隆法将链酶亲和素(sa)融合到px330-hspcas9 的n端或c端，然后以退火连接的方式将相应的sgrna连接到 px330-sa-hspcas9或px330-hspcas9-sa骨架上。本发明中所述 bio-egfp-donor是将同源臂5
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ha、3
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ha与egfp三个片段使用se无缝克 隆连接试剂盒装载到pet28a载体上，并通过带有生物素修饰的引物进行 pcr扩增获得。所述同源臂5
′
ha、3
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ha来源于猪的pk-15细胞(rosa26 基因)或人的hek293t细胞(gapdh基因)基因组，切割rosa26基因或 gapdh基因上下游序列，获得上游序列为5
′
ha、下游序列为3
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ha。本发 明中所述egfp基因从pegfp-c1质粒中扩增获得。
9.作为另一种实施方式，本发明还引入了nhej荧光报告质粒。在本发明 中，所述引入融有链酶亲和素的cas9质粒为px330-sa-hspcas9或 px330-hspcas9-sa，所述相应的具有生物素修饰的同源供体为 bio-sgrna-egfp-donor，所述nhej荧光报告质粒为 pcmv-sa-mcherry-nhej。本发明中所述px330-sa-hspcas9核苷酸序列如 seq id no:1所示，所述bio-sgrna-egfp-donor中的人gapdh位点sgrna 分别融合到bio-egfp-donor 5
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端、3
′
端和两端，所述bio-sgrna-egfp-donor 中的人gapdh位点sgrna融合到bio-egfp-donor两端的核苷酸序列如 seq id no:2所示，所述pcmv-sa-mcherry-nhej核苷酸序列如seq idno:3所示。本发明中所述px330-sa-hspcas9或px330-hspcas9-sa是以 px330-hspcas9为基础质粒，通过一步克隆法将链酶亲和素(sa)融合到 px330-hspcas9的n端或c端。本发明中所述bio-sgrna-egfp-donor通过 融合pcr的方法将含有u6启动子与终止子序列的完整sgrna分别融合到 bio-egfp-donor 5
′
端、3
′
端或两端，并通过带有生物素修饰的引物进行pcr 扩增获得。本发明中所述pcmv-sa-mcherry-nhej是将 pcmv-egfp-mcherry中的egfp用链霉亲和素单体sa进行替换，通过 ecorⅰ和xhoⅰ双酶切，再将含有pam序列的sgrna靶序列通过退火连接 的方式整合到pcmv-sa-mcherry之间获得。本发明中所述含有pam序列的 sgrna靶序列为t2-grna：ggggccactagggacaggattgg，g-talen1： gtcccctccaccccacagtgggg，crrna：tttatctgtcccctccaccccacagtg。
10.本发明中所述pcr扩增、质粒酶切、退火连接、无缝克隆涉及的步骤 和反应体系均为本领域技术人员所熟知的步骤和反映体系。
11.在本发明中，所述宿主细胞优选为猪pk-15细胞、人k562细胞、人 hek293t细胞。
12.本发明还提供一种基因组编辑系统，包含向宿主细胞中引入融有链霉亲 和素的cas9质粒和相应的具有生物素修饰的同源供体，优选的还包括向宿 主细胞中引入nhej荧光报告质粒。本发明中当所述引入融有链酶亲和素的 cas9质粒为px330-sa-hspcas9-sgrna或px330-hspcas9-sa-sgrna时，所 述相应的具有生物素修饰的同源供体为bio-egfp-donor；当所述引入融有链 酶亲和素的cas9质粒为px330-sa-hspcas9或px330-hspcas9-sa，所述相 应的具有生物素修饰的同源供体为bio-sgrna-egfp-donor时，所述nhej 荧光报告质粒为pcmv-sa-mcherry-nhej。
13.在本发明中，所述基因编辑系统还包括编码序列操纵系统的多核苷酸序 列。本发明中所述的多核苷酸序列优选为在基因编辑系统中起编码作用的序 列。本发明中所述序列操作纵系统优选为crispr/cas系统。
14.本发明还提供一种实现基因组编辑的方法，包括在生物体中表达所述的 基因组编辑系统。
15.本发明还提供一种所述基因编辑系统在提高同源重组效率中的用途。
16.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
17.本发明首次将融有链霉亲和素的cas9质粒、相应的具有生物素修饰的 同源供体、nhej荧光报告质粒引入到crispr/cas9系统中提高同源重组效 率，基于nhej的荧光报告质粒能够指示发生同源重组的所有元件，初步的 流式分析结果显示能够进一步将被富集细胞中同源重组效率提高至 50％～80％。
18.本发明为基因组编辑技术实现高效同源重组编辑提供了一种新的选择， 在实际应用中无需将标记基因整合到基因组中，仅通过基因组外发挥作用的 nhej报告质粒便可以很容易的获得真实发生同源重组的阳性细胞，因而具 有更高的安全性，同时也降低了筛选的难度，为基因编辑的应用产生了一定 的促进作用。
附图说明
19.图1px330-sa-hspcas9(左)与px330-hspcas9-sa(右)载体示意图。
20.图2px330-sa-hspcas9与px330-hspcas9-sa酶切鉴定结果(左)与测 序峰图(右)。
21.图3sgrna测序峰图。
22.图4prosa26-egfp-donor与pgapdh-egfp-donor载体示意图(上)与 测序峰图(下)。
23.图5不同条件下hochest染核结果。
24.图6电转3天后绿色荧光比例流式分析图。
25.图7电转7天后绿色荧光比例流式分析图。
26.图8电转pk-15细胞3天(左)和7天(右)的绿色荧光比例。
27.图9单细胞克隆荧光状态(从左往右依次是gfp视野、明场与merge 图像)。
28.图10pcr鉴定引物所在位置与扩增产物片段长度。
29.图11pcr鉴定引物示意图与各电转组合pcr鉴定结果图(方框表示双 等位基因编辑克隆)。
30.图12部分克隆序列比对结果(5
′
ha：5
′
同源臂序列，splicing acceptor： 剪切受体，普cas9：没有融合亲和素的普通cas9，n/c-sa：在n端或c端 融有亲和素的cas9蛋白)。
31.图13双等位基因编辑克隆pcr鉴定图(左)与测序峰图(右)。
32.图14电转k562流式分析图。
33.图15k562绿色荧光比例柱状图。
34.图16供体融合pcr扩增结果。
35.图17pcmv-sa-mcherry-nhej报告载体示意图(左)与测序峰图(右)。
36.图18pcmv-sa-mcherry-nhej报告载体细胞功能验证图。
37.图19电转k562细胞nhej与hdr流式双色分析图。
具体实施方式
38.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。
39.实施例1生物素-链霉亲和素强相互作用提高同源重组效率
40.1、融有链霉亲和素的cas9质粒构建与含有grna的px330-hspcas9-sa 质粒构建
41.(1)融有链霉亲和素的cas9质粒构建
42.以px330-hspcas9(全称px330-u6-chimeric-bb-cbh-hspcas9)质粒为 基础载体，将链酶亲和素装载于px330-hspcas9中。
43.经文献(synchronization ofsecretoryprotein traffic in populations ofcells； gaelle boncompain；nature methods)查阅获得链霉亲和素(sa)序列，由 金唯智公司合成，合成过程中在3’端添加了sv40 nls核定位序列，获得合 成的链酶亲和素片段。将合成的链霉亲和素片段进行pcr扩增，扩增引物 为hspcas9-sa-f/hspcas9-sa-r，核苷酸序列如seq id no:4/seq id no:5 所示，扩增时保留px330-hspcas9骨架酶切位点附近序列信息。
44.px330-hspcas9骨架分别用ageⅰ与ecorⅰ单酶切，通过abm一步克隆 试剂盒的方法将链霉亲和素分别融合到px330-hspcas9蛋白的n端或c端， 获得px330-sa-hspcas9或px330-hspcas9-sa，其载体示意图如图1所示。
45.将构建成功的载体分别进行ecorⅰ、bamhⅰ和hindⅲ酶切检测并进 行测序验证，酶切鉴定结果与测序图如图2所示。由图2显示，sa序列两 端分别含有一个bamhⅰ和hindⅲ酶切位点，经双酶切后成功出现513bp 的sa序列和8506bp的px330-hspcas9载体骨架，经测序显示成功构建出 px330-sa-hspcas9或px330-hspcas9-sa质粒。
46.(2)含有sgrna的融有链霉亲和素的cas9质粒质粒构建
47.通过对应的文献(gapdh：knock-in oflarge reporter genes in human cellsvia crispr/cas9-induced homology-dependent and independent dna repair, xiangjun he,nucleicacids research；rosa26:optimization ofa crispr/cas9
‑ꢀ
mediated knock-in strategy at theporcine rosa26 locus in porcine foetalfibroblasts,zicong xie,scientific reports.))获得sgrna(rosa26-sgrna或 gapdh-sgrna)，将sgrna序列两端分别加上5
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cacc-3
′
和5
′‑
aaac-3
′
， 获得相应的连接好的sgrna。然后通过退火连接的方式将相应的sgrna连 接到bbsⅰ酶切的px330-hspcas9-sa骨架上，退火连接涉及的引物为 rosa26-sg-f/rosa26-sg-r和gapdh-sg2-f/gapdh-sg2-r，核苷酸序列如 seq id no:6/seq id no:7和seq id no:8/seq id no:9所示，经转化涂板 后挑菌送测序，测序结果如图3所示。由图3结果显示sgrna序列正确， 此时含有链霉亲和素与sgrna的px330-hspcas9载体构建成功，可以进行 后续的实验。
48.2、相应的同源供体的构建与生物素修饰双链供体的获得
49.(1)相应同源供体的构建：构建好含有grna的px330-hspcas9-sa质 粒后需要构建相应的同源供体
50.从猪的pk-15细胞(rosa26基因)或人的hek293t细胞(gapdh基 因)基因组中获得同源臂(homologous arm,ha)，切割其上下游序列，上游 序列为5
′
ha，下游序列为3
′
ha。egfp基因从pegfp-c1质粒中扩增获得， 随后将rosa26基因或gapdh基因中获得的5
′
ha、3
′
ha与egfp三个片段 使用se无缝克隆连接试剂盒装载到pet28a载体上，其载体示意图与测序 峰图如图4所示。如图4所示，由于插入位置的不同分别选用了不同的策略， 在猪的pk-15细胞中，需要将egfp基因插入到rosa26位点的内含子中， 因此为确保egfp的正确表达，需要引入剪切受体(splicing acceptor)和 sv40poly(a)序列(addgene网站)，引入剪切受
体和sv40poly(a)序列涉及 引物分别为rosa26-donor-1r/rosa26-donor-2f和rosa26-donor-2r/3f，核苷 酸序列如seq id no:10/seq id no:11和seq id no:12/seq id no:13所 示，退火温度均为60℃。在人的k562细胞中，egfp是插入到gapdh的 终止密码子前，因此只需要引入自剪肽p2a序列 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/mt559572.1.)即可，涉及引物为 gapdh-donor-1r/2f，核苷酸序列如seq id no:14/seq id no:15所示，退 火温度均为60℃。经测序验证发现序列完全正确，可以进行后续的实验。
51.(2)生物素修饰双链供体(bio-ds-egfp-donor)的获得
52.使用带有生物素修饰的引物将步骤(1)获得的相应同源供体进行pcr 扩增，扩增引物为bio-f/r，核苷酸序列如seq id no:16/seq id no:17所 示，退火温度60℃，获得两端生物素修饰双链供体片段，扩增片段经产物纯 化后测浓度放入-20℃待用。
53.3、通过电转染的方式将相应的含有sgrna的融有链霉亲和素的cas9 质粒与生物素修饰的双链供体转入到猪的pk-15细胞系中
54.由于考虑到电转染时过多的质粒用量会导致细胞的大量死亡，因此以含 有grna的px330-hspcas9-sa质粒为研究对象，将其选定在5μg的量，做 了与生物素修饰双链供体比例分别为1:1、1:2、1:3条件下的细胞活性鉴定， 对电转后48h的细胞用hochest染色，用荧光显微镜进行观察，观察结果如 图5所示。由图5所示，与对照相比，细胞活性在1:2质粒用量条件下并没 有太大差别，但是当比例为1:3时，存活的细胞数量明显减少，鉴于上述第 3步骤的结果，1:3的组合相比1:2并没有提高更多的同源重组效率，因此最 终选定含有sgrna的融有链霉亲和素的cas9质粒5μg，与生物素修饰双链 供体片段摩尔比例为1:2的条件进行后续的实验。
55.4、同源重组效率的检测
56.通过与没有融合链霉亲和素的含有sgrna的cas9蛋白进行比较，判断 链霉亲和素能否让同源重组效率提高，实验组合表1，流式分析结果如图6 所示。由图6结果显示，发现电转第三天后融合有链霉亲和素的cas9蛋白 可以提高同源重组效率，但是只电转了bio-ds-egfp-donor的对照组存在 4.3％的背景荧光，我们继续将电转后的细胞培养至第7天，并对此时的流式 的结果进行分析，结果如图7所示，此时对照组已经降低至不到1％。然后 将结果进行整理并绘制相应的柱状图，如表2和图8所示。结由表2和图8 结果发现3天和7天后的结果均具有显著性的差异，由于七天后的对照组几 乎没有了背景荧光的干扰，因此以7天之后的结果为准进行分析，发现通过 引入链霉亲和素，不管链霉亲和素融合在cas9的c端还是n端均可以使效 率进一步得到提高，与普通cas9相比，同源重组的效率大约提高了一倍， 说明通过链霉亲和素与生物素的强相互作用确实可以在猪的pk-15细胞系 中实现同源重组效率的提高。
57.表1电转pk-15/k562质粒组合用量(生物素-链霉亲和素)
[0058][0059]
表2 pk-15电转重复结果
[0060][0061]
5、流式分选单细胞克隆鉴定
[0062]
随后为验证绿色细胞是否为正确插入的阳性克隆，并检测双等位基因编 辑的效率，因此将电转7天后的绿色荧光阳性细胞进行单细胞分选，单细胞 分选可以保证克隆的纯度，准确的鉴定出克隆是否发生了双等位基因编辑。 由于不含链霉亲和素的px330-hspcas9组七天后转染效率较低，再加上单克 隆细胞生长较为困难，最终仅得到20个克隆，而含有链霉亲和素的两个组 合因其效率大约提高了约一倍，均获得了近40个克隆，每组得到的克隆数 量如表3所示。
[0063]
表3流式单细胞分选单克隆数量统计
[0064][0065]
待克隆团长至合适大小后，观察其荧光表达情况如图9所示，结果表明 通过荧光显微镜观察几乎所有的克隆均含有绿色荧光。
[0066]
随后取少量克隆细胞通过np-40裂解后直接进行pcr检测，退火温度 为58℃，共设计了两对鉴定引物，它们共用同一条上游引物，该引物设计在 跨5
′
ha的上游基因组位置，而下游引物分别设计在egfp和3
′
ha上，这样 第一对引物(jiandingf1/r1，核苷酸序列如seq id no:18/seq id no:19所 示)便可以检测是否发生了绿色荧光细胞的正确打靶，而
第二对引物 (jiandingf1/r2，核苷酸序列如seq id no:18/seq id no:20所示)则可以 用来鉴定是否发生了双等位基因编辑，引物具体的位置与pcr检测结果如 图10和图11所示。
[0067]
由于克隆细胞基因组采用的是np-40直接裂解获得，含有较多杂质，pcr 扩增质量并不高，而且验证单双等位基因敲入的引物由于扩增片段较长，因 此尽管大多数克隆均为单等位基因编辑，本应获得两条条带，但是最终1900 bp的条带仅有少数克隆扩出。而且f1/r1结果显示，某些克隆大约会在一千 多bp位置额外出现一条带，比如px330-hspcas9 bio-ds-donor中的#06号克 隆明显扩出了两条带，将一千多bp的大条带进行测序，结果发现其发生了 供体片段的直接相连而产生了多拷贝，同时随机对其他的几个克隆结果进行 了测序，测序比对的结果如图12所示。
[0068]
为方便直观的比较各组的鉴定结果，我们统计了双等位基因编辑克隆数 量、单等位基因编辑克隆数量、阴性克隆的数量，如表4所示。
[0069]
表4 pcr鉴定克隆数量统计
[0070][0071]
从表4中可以发现，仅使用生物素修饰供体的组合中共获得18个阳性 克隆，但是并没有检测到双等位基因编辑克隆的产生。而引入链霉亲和素后， n端和c端的的38个和36个克隆中均检测到3个双等位基因编辑的克隆(效 率分别为7.9％和8.3％)，且通过对其中两个克隆(#n-01与#c-06)单独进 行pcr扩增并测序验证，如图13所示，测序结果显示仅有单一的峰，进一 步说明确实是发生了双等位基因编辑。
[0072]
6、电转入的k562细胞验证同源重组效率
[0073]
为进一步验证该生物素-链霉亲和素体系是否适用于不同的物种，选择 了另一种本实验室电转体系较稳定的k562细胞系进行验证，待只转染了 bio-ds-donor的对照组荧光低于1％时进行流式分析，结果如图14所示。流 式结果显示，与pk-15结果相似，加入亲和素后hdr效率进一步提高约1 倍，随后将实验进行了三次重复，对重复的结果进行整理并进行t测验，结 果如表5和图15所示。
[0074]
表5 k562电转三次重复结果
[0075][0076]
实施例2生物素-链霉亲和素强相互作用与nhej修复的红绿载体间接 筛选同源重组联合使用建立高效的同源重组方法
[0077]
1、融有链霉亲和素的cas9质粒构建
[0078]
构建步骤与实施例1第1节步骤(1)相同。
[0079]
2、相应的具有生物素修饰的同源供体(bio-sgrna-egfp-donor)构建
[0080]
(1)原有同源供体模板(bio-egfp-donor)的构建：
[0081]
构建步骤与实施例1第2节第(1)步骤相同。
[0082]
(2)含有u6启动子与终止子序列的完整sgrna质粒 (px330-gapdhsgrna-hspcas9)的构建：以px330-hspcas9质粒为基础， 通过退火连接的方式将rosa26-grna或gapdh-sgrna连接到bbsⅰ酶切 的px330-hspcas9上，获得px330-rosa26sgrna-hspcas9或 px330-gapdhsgrna-hspcas9，退火连接引物为rosa26-sg-f/rosa26-sg-r 或gapdh-sg2-f/gapdh-sg2-r，如seq id no:6/seq id no:7和seq idno:8/seq id no:9所示，经转化涂板后挑菌送测序。
[0083]
(3)bio-sgrna-egfp-donor的构建：通过融合pcr的方法将 px330-gapdhsgrna-hspcas9分别融合到bio-egfp-donor 5
′
端、3
′
端和两 端，获得融合质粒，结果如图16；然后以融合质粒为模板，通过带有生物素 修饰的引物，进行pcr扩增，最终琼脂糖凝胶回收到 bio-sgrna-egfp-donor。
[0084]
所述融合pcr法涉及的引物为：以px330-gapdhsgrna-hspcas9为模 板，引物为grna-gapdh-donor-1f/grna-gapdh-donor-1r和 grna-gapdh-donor-3f/grna-gapdh-donor-3r，如seq id no:21/seq idno:22和seq id no:23/seq id no:24所示；以原有同源供体为模板，引物 为grna-gapdh-donor-2f/grna-gapdh-donor-2r，如seq id no:25/seqid no:26所示。所述grna-gapdh-donor-1f/grna-gapdh-donor-1r和 grna-gapdh-donor-3f/grna-gapdh-donor-3r分别对应原有同源供体模 板5’和3’位置扩增的px330-gapdhsgrna-hspcas，退火温度为60℃。
[0085]
3、nhej荧光报告质粒(pcmv-sa-mcherry-nhej质粒)的构建 将pcmv-egfp-mcherry中的egfp用链霉亲和素单体sa进行替换，之间 依旧保留xhoⅰ与ecorⅰ两个酶切位点，通过ecorⅰ和xhoⅰ双酶切，再 将含有pam序列的sgrna靶序列(人的gapdh位点的sgrna靶序列为 agccccagcaagagcacaagagg)通过退火连接的方式整合到pcmv
‑ꢀ
sa-mcherry之间，mcherry首先不发生表达，只有当sgrna切割靶序列后， 发生移码突变，mcherry读码正确，随后发出红光，其载体示意图和测序峰 图如图17所示。由图17可知，改造后的nhej荧光报告质粒在引入sgrna 靶位点时会导致mcherry提前终止，符合nhej荧光报告质粒的构建原则。
[0086]
pcmv-sa-mcherry-nhej功能验证：将上述构建好的nhej荧光报告质 粒与px330-hspcas9-sa质粒共同转染到293t细胞中，并在实验组中加入相 应的sgrna载体，验证其功能是否与预期一致，转染48h后通过荧光显微 镜观察，结果如图18。由图18表明，pcmv-sa-mcherry-nhej荧光报告质 粒在不引入sgrna时不发生荧光，只有当sgrna存在时，即发生了切割后 便能够借助宿主细胞的nhej修复后发生红色荧光，说明载体构建成功，并 能够指示cas9与sgrna。
[0087]
4、电转k562细胞检测同源重组富集效率
[0088]
将上述制备的3种质粒电转到k562细胞中，cas9选择c端融合有链霉 亲和素的px330-sa-hspcas9，电转用量选择使用5μg，与生物素修饰的同源 供体比例选择为1:2，分别做了px330-hspcas9-sa质 粒:bio-sgrna-egfp-donor质粒:pcmv-sa-mcherry-nhej荧光
报告质粒 ＝1:2:(1-3)，并对不同位置偶联有sgrna的一同比较，由于绿色荧光还需要 进行补偿调节，因此还做了px330-hspcas9-sa:bio-sgrna-egfp-donor质粒 ＝1:2的组合用来调节补偿，最终流式分析结果如图18所示。
[0089]
将图19中的比例通过下列公式进行计算：nhej筛选比例＝q1 q2；hdr 细胞所占比例＝q4 q2；nhej筛选富集细胞中hdr所占的比例 ＝q2/(q1 q2)。整理结果如表6所示。
[0090]
表6电转k562细胞nhej与hdr发生情况统计
[0091][0092][0093]
由表6结果显示，随着nhej报告质粒的增加，nhej筛选比例中hdr 的占比逐渐降低，且nhej效率逐渐升高，当比例增加到1:2:3时，hdr效 率开始出现下降，说明这两种修复方式之间存在竞争关系。通过比较发现当 比例为1:2:2时效果比较好，此时nhej筛选比例与hdr比例接近，且hdr 占比也可以达到30％。这说明当我们以nhej荧光报告质粒发出的荧光进行 分选，其中会有大约三分之一的细胞为发生同源重组的细胞。进一步说明该 方法可以间接富集发生同源重组的细胞。另外，通过将sgrna偶联到双链 供体上可以进一步将富集hdr的效率提高约一倍，而且结果显示两端偶联 有sgrna的组合富集效果最好。
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综合上述试验表明：
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1.将生物素-链霉亲和素引入到crispr/cas9系统，结果显示在人k562 细胞和猪pk-15细胞中将同源重组的效率提高至10％，并且可能在一定程度 上提高了双等位基因编辑的效率。
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2.在上述实验基础上，将sgrna与同源供体模板偶联，使基于nhej 的荧光报告质粒能够指示发生同源重组的所有元件，初步的流式分析结果显 示能够进一步将被富集细胞中同源重组效率提高至50～80％。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和 润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。