生物碱pulmonarinB的合成及在防治植物病毒和病菌病中的应用的制作方法

生物碱pulmonarin b的合成及在防治植物病毒和病菌病中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种生物碱pulmonarin b的高效合成方法以及该生物碱在防治植物病毒和病菌病中的应用，属于农业防护技术领域。


背景技术：

2.全球范围内，植物病原菌和害虫造成高达40％的玉米，马铃薯，水稻，大豆和小麦产量损失(nat.eco.&evo.2019，3，430-439)。由细菌、真菌、线虫和病毒引起的植物病害每年使全球经济损失2200亿美元(front.plant sci.2014，5，660)。植物病毒占植物致病物的几乎一半，每年在全球造成的损失高达300亿美元(front.plant sci.2014，5，660)。由于病毒在植物细胞中绝对寄生，其复制所需的物质、能量和场所完全依赖寄主，且植物没有像动物那样完整的先进的免疫代谢系统(science.，2014，344(6181)：299-303)，使得植物病毒病的防治尤为困难，素有“植物癌症”之称。
3.当前使用的代表性农药登记品种有：氨基寡糖素(由d-氨基葡萄糖以β-1.4糖苷键连接的低聚糖天然产物)、宁南霉素、病毒唑、病毒a(盐酸吗啉胍
·
乙酸铜)等。实用化品种较少，所报道的药剂在田间实际应用时其防效大多在60％以下。因此，新型高效的抗植物病毒剂的开发迫在眉睫。
4.生物源天然农药主要是指以植物、动物、微生物等产生的具有农用生物活性的次生代谢产物开发的农药，如2.5％鱼藤酮乳油，15％井岗霉素水溶粉剂，等。从天然产物发现结构新颖、对环境安全的农药是一条重要且高效的途径。
[0005][0006]
pulmonarin b(结构式一)是一种具有芳基酰胺结构的天然产物。2014年，johan课题组从亚北极海鞘滑膜肺草属中分离并确定结构，通过3步，总收率2.75％合成了pulmonarin b(反应式一)。与已知的几种天然乙酰胆碱酯酶抑制剂相比，pulmonarin b具有更强的非竞争性乙酰胆碱酯酶的抑制作用(j.nat.prod.2014，77，364-369)。
[0007][0008]
2018年，江成世课题组通过5步，总收率3.69％合成了pulmonarin b(反应式二)，并报道了其具有体外中等乙酰胆碱酯酶(ache)/丁酰胆碱酯酶(bche)抑制活性，还有抑制自我诱导和抑制乙酰胆碱酯酶诱导β-淀粉样蛋白聚集作用，对肝细胞系没有毒性，通过数据得出pulmonarin b可能成为一种抗阿兹海默症药物和一种多功能的抗肾上腺素药物开发的先导化合物(mar.drugs.2018，16，293)。
[0009][0010]
由于生物碱pulmonarin b天然含量低，且合成困难，生物活性的研究还不够深入。合成的主要瓶颈在于最后一步季铵盐的生成，两篇文献的收率都没有突破20％，极大的限制了该类化合物生物活性的深入研究。发展高效的合成方法，深入研究该类化合物的农用活性显得尤为重要。


技术实现要素：

[0011]
本发明提供一种生物碱pulmonarin b的高效合成方法以及该生物碱在防治植物病毒和病菌病中的应用。本发明在系统调研文献的基础上，借鉴johan课题组报道的合成方法，以5步，总收率59％合成了pulmonarin b，改进了反应条件，提高了反应收率，为该类生物碱的生物活性研究奠定基础。本发明的生物碱pulmonarin b具有很好的抗植物病毒和病菌活性。
[0012]
本发明的生物碱pulmonarin b的合成方法如反应式三所示：对甲氧基苯乙酸在氯化亚砜存在下与甲醇反应得到酯2，再经nbs溴化得到化合物3，水解得到4，在edci催化下缩合得到酰胺5，最后我们通过筛选溶剂，控制反应时间发现用丙酮为溶剂室温反应1小时化
合物5可以98％的高收率转化为生物碱pulmonarin b。
[0013][0014]
本发明生物碱pulmonarin b具有很好的抗植物病毒和病菌活性。能够很好的抑制烟草花叶病毒(500μg/ml抑制率：钝化59％，治疗37％，保护43％)，钝化活性明显优于商品化品种病毒唑(500μg/ml抑制率：钝化39％，治疗37％，保护41％)。对黄瓜枯萎，花生褐斑，苹果轮纹，小麦纹枯，玉米小斑，西瓜炭疽，水稻恶苗，番茄早疫，小麦赤霉，水稻稻瘟，辣椒疫霉，油菜菌核，黄瓜灰霉，水稻纹枯14种植物病菌表现出广谱的抑制活性。
[0015]
相比于现有技术，本发明突破了生物碱pulmonarin b的合成壁垒，以5步，59％的总收率实现了pulmonarin b的高效合成。首次发现生物碱pulmonarin b表现出很好的抗植物病毒和病菌活性。
具体实施方式
[0016]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0017]
实施例1：4-甲氧基苯乙酸甲酯(2)的合成：将化合物1(2.0g，11.2mmol)溶于10ml甲醇中，在冰水浴条件下，缓慢滴加0.5ml二氯亚砜，在70℃条件下，反应4小时，减压浓缩脱溶，加入50ml水，分别用20ml乙酸乙酯萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶，得到化合物2，2.08g，收率95％，无水油状物。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.23(d，j＝8.6hz，2h，ar-h)，6.89(d，j＝8.6hz，2h，ar-h)，3.82(s，3h，och3)，3.72(s，3h，och3)，3.60(s，2h，coch2).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ172.4，169.5，158.7，155.4，130.3，126.1，114.0，55.3，52.0，40.3.
[0018]
实施例2：3，5-二溴4-甲氧基苯乙酸甲酯(3)的合成：将化合物2(1.2g，6.2mmol)溶于5ml乙腈中，在冰浴条件下，加入三氯化铁(1.1g，6.2mmol，1equiv)，搅拌15分钟，缓慢加入n-溴代琥珀酰亚胺(nbs，2.2g，12.4mmol，2equiv)，在室温条件下，反应5小时，加50ml水淬灭，分别用20ml乙酸乙酯萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶，通过柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝15/1)纯化，减压浓缩脱溶，得到化合物3，1.68g，收率75％，黄色油状物。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.43(s，2h，ar-h)，3.87(s，3h，och3)，3.72(s，3h，och3)，3.54
(s，2h，coch2).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ171.0，153.3，133.5，132.4，118.1，60.6，52.4，39.6.
[0019]
实施例3：3，5-二溴4-甲氧基苯乙酸(4)的合成：将化合物3(0.34g，1.0mmol)溶于7ml四氢呋喃和3ml水中，加入氢氧化钠(0.08g，2.0mmol，2equiv)，在室温条件下，反应6小时，滴加硫酸溶液(3m)，调节ph至1.0～2.0，抽滤，得到化合物4，0.31g，收率95％，白色固体，熔点125-130℃。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.57(s，2h，ar-h)，3.79(s，3h，och3)，3.60(s，2h，coch2).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ172.6，152.5，135.3，134.3，117.4，60.8.
[0020]
实施例4：2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯基)-n-(5-二甲氨基戊基)乙酰胺(5)的合成：将化合物4(0.5g，1.56mmol)溶于5ml二氯甲烷中，加入n，n-二甲基戊二胺(0.22g，1.72mmol，1.1equiv)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，0.45g，2.34mmol，1.5equiv)、1-羟基苯并三唑(hobt，0.11g，0.78mmol，0.5equiv)和三乙胺(0.48g，4.68mmol，3equiv)，在n2保护，室温条件下，反应6小时，减压浓缩脱溶，加入20ml水，分别用10ml乙酸乙酯萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶，得到化合物5，0.6g，收率89％，无色油状物。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.45(s，2h，ar-h)，5.89(s，1h，nh)，3.89(s，3h，och3)，3.44(s，2h，coch2)，3.25(t，j＝6.1hz，2h，conh-ch2)，2.27(t，j＝7.3hz，2h，n-ch2)，2.22(s，6h，n-ch3)，1.53-1.46(m，4h，ch2)，1.34-1.29(m，2h，ch2).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ169.6，153.2，133.4，118.3，60.6，59.4，45.4，42.1，39.8，29.2，27.1，24.6.hrms(esi)calcd for c
16h25
br2n2o2(m h)

435.0277，found 435.0271.
[0021]
实施例5：pulmonarin b的合成：将化合物5(0.20g，0.46mmol)溶于5ml丙酮中，加入碘甲烷(0.10g，0.69mmol，1.5equiv)，室温条件下，反应1小时，减压浓缩脱溶，得到化合物pulmonarin b，0.19g，收率98％，无水油状物。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.14(s，1h，nh)，7.53(s，2h，ar-h)，3.76(s，3h，och3)，3.38(s，2h，coch2)，3.27(t，j＝6.1hz，2h，conh-ch2)，3.06(t，j＝7.8hz，2h，n-ch2)，3.06(s，9h，n-ch3)，1.69-1.66(m，2h，ch2)，1.47-1.45(m，2h，ch2)，1.33-1.23(m，2h，ch2).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ169.6，152.3，136.4，133.7，117.5，65.7，60.9，52.7，41.0，38.8，29.0，23.7，22.2.hrms(esi)calcd for c
17h27
br2n2o2(m-i-)

449.0434，found 449.0437.
[0022]
实施例6：抗烟草花叶病毒活性的测定，测定程序如下：
[0023]
1、病毒提纯及浓度测定：
[0024]
病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制烟草花叶病毒sop规范执行。病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，4℃冷藏备用。
[0025]
2、化合物溶液配制：
[0026]
称量后，原药加入dmf溶解，制得1
×
105μg/ml母液，后用含1
‰
吐温80水溶液稀释至所需浓度；宁南霉素制剂直接兑水稀释。
[0027]
3、活体保护作用：
[0028]
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1
‰
吐温80水溶液对照。24h后，叶面撒布金刚砂(600目)，用毛笔蘸取病毒液，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，病毒浓度10μg/ml，接种后用流水冲洗。3d后记录病斑数，计算防效。
[0029]
4、活体治疗作用：
[0030]
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/ml，接种后用流水冲洗。叶面收干后，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1
‰
吐温80水溶液对照。3d后记录病斑数，计算防效。
[0031]
5、活体钝化作用：
[0032]
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，将药剂与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度10μg/ml，接种后即用流水冲洗，重复3次，设1
‰
吐温80水溶液对照。3d后数病斑数，计算结果。
[0033]
抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]
×
100％
[0034]
阳性对照为商品化抗植物病毒药剂病毒唑。
[0035]
表1生物碱pulmonarin b的抗烟草花叶病毒(tmv)活性测试结果
[0036][0037]
从表1数据可见，生物碱pulmonarin b表现出很好的抗tmv活性，钝化活性明显优于病毒唑，具有极大的开发价值。
[0038]
实施例7：抗菌活性测试，测定程序如下：
[0039]
离体杀菌测试，菌体生长速率测定法(平皿法)：
[0040]
将一定量药剂溶解在适量丙酮内，然后用含有200μg/ml乳化剂水溶液稀释至所需浓度，然后各吸取1ml药液注入培养皿内，再分别加入9ml培养基，摇匀后制成50μg/ml的含药平板，以添加1ml灭菌水的平板做空白对照。用直径4mm的打孔器沿菌丝外缘切取菌盘，移至含药平板上。每处理重复三次。将培养皿放在24
±
1℃恒温培养箱内培养。48小时后调查各处理菌盘扩展直径，求平均值，与空白对照比较计算相对抑菌率。
[0041][0042]
表2生物碱pulmonarin b的离体杀菌活性测试结果：
[0043][0044]
生物碱pulmonarin b在测试浓度为50μg/ml的条件下对14种被测试菌都表现出广谱的抑制活性。
[0045]
上述实施例中所涉及的原料和试剂均由商购或参考文献方法制备获得，化学反应工艺是本技术领域的技术人员所能掌握的。
[0046]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其
它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。