生物碱pulmonarinB衍生物及其合成和在防治植物病毒和病菌病中的应用的制作方法

生物碱pulmonarin b衍生物及其合成和在防治植物病毒和病菌病中的应用
技术领域
1.本发明涉及一类生物碱pulmonarin b衍生物及其合成和在防治植物病毒和病菌病中的应 用，属于农业防护技术领域。


背景技术：

2.植物病毒病菌的危害也是不容忽视的，全球范围内，植物病原菌和害虫造成高达40％的 玉米，马铃薯，水稻，大豆和小麦产量损失(nat.eco.&evo.2019，3，430-439)。由细菌、 真菌、线虫和病毒引起的植物病害每年使全球经济损失2200亿美元(front.plant sci.2014，5， 660)。植物病毒占植物致病物的几乎一半，每年在全球造成的损失高达300亿美元(front.plantsci.2014，5，660)。由于病毒在植物细胞中绝对寄生，其复制所需的物质、能量和场所完全依 赖寄主，且植物没有像动物那样完整的先进的免疫代谢系统(science.，2014，344(6181)： 299-303)，使得植物病毒病的防治尤为困难，素有“植物癌症”之称。
3.当前使用的代表性农药登记品种有：氨基寡糖素(由d-氨基葡萄糖以β-1.4糖苷键连接的 低聚糖天然产物)、宁南霉素、病毒唑、病毒a(盐酸吗啉胍
·
乙酸铜)等。实用化品种较少， 所报道的药剂在田间实际应用时其防效大多在60％以下。因此，新型高效的抗植物病毒剂的 开发迫在眉睫。
4.生物源天然农药主要是指以植物、动物、微生物等产生的具有农用生物活性的次生代谢 产物开发的农药，如2.5％鱼藤酮乳油，15％井岗霉素水溶粉剂，等。从天然产物发现结构新 颖、对环境安全的农药是一条重要且高效的途径。
[0005][0006]
pulmonarin b(结构式一)是一种具有芳基酰胺结构的天然产物。2014年，johan课题组 从亚北极海鞘滑膜肺草属中分离并确定结构，通过3步，总收率2.75％合成了pulmonarin b (反应式一)。与已知的几种天然乙酰胆碱酯酶抑制剂相比，pulmonarin b具有更强的非竞 争性乙酰胆碱酯酶的抑制作用(j.nat.prod.2014，77，364-369)。
[0007][0008]
2018年，江成世课题组通过5步，总收率3.69％合成了pulmonarin b(反应式二)，并 报道了其具有体外中等乙酰胆碱酯酶(ache)/丁酰胆碱酯酶(bche)抑制活性，还有抑制自我诱 导和抑制乙酰胆碱酯酶诱导β-淀粉样蛋白聚集作用，对肝细胞系没有毒性，通过数据得出 pulmonarin b可能成为一种抗阿兹海默症药物和一种多功能的抗肾上腺素药物开发的先导化 合物(mar.drugs.2018，16，293)。
[0009][0010]
由于生物碱pulmonarin b天然含量低，且合成困难，生物活性的研究还不够深入。发展 高效的合成方法，设计合成系列pulmonarin b衍生物对深入研究该类化合物的农用活性极为 重要。


技术实现要素：

[0011]
本发明提供一类生物碱pulmonarin b衍生物及其合成方法和在防治植物病毒和病菌病中 的应用。本发明在系统调研文献的基础上，结合药物创制经验，设计并合成了生物碱pulmonarin b衍生物i-1-i-38(结构式二)，为该类生物碱的生物活性研究奠定基础。本发明的 生物碱pulmonarin b衍生物i-1-i-38具有很好的抗植物病毒和病菌活性。
[0012][0013]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-1-i-2的合成方法如反应式三所示：3，5-二溴-4-羟 基苯甲酸(1)在硫酸催化下与甲醇反应得到酯2，再经碘甲烷进行羟基的甲基化
得到化合物 3，水解得到酸4，在edci催化下缩合得到衍生物i-1，最后通过筛选溶剂，控制反应时间发 现用丙酮为溶剂室温反应1小时可以95％的高收率得到衍生物i-2。
[0014][0015]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-3-i-11的合成方法如反应式四所示：以衍生物i-1 为原料，与相应的溴代物发生亲和取代反应得到衍生物i-3-i-11。
[0016][0017]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-2的合成方法如反应式五所示：羧酸4在二氯亚 砜条件下氯化得到酰氯中间体，再与n，n-二甲基乙醇胺反应得到化合物5，最后与碘甲烷反 应得到衍生物i-12。
[0018][0019]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-13-i-20的合成方法如反应式六所示：苯甲酸酯2 与相应的溴代物反应得到化合物6a-6d，水解得到酸7a-7d，再与n，n-二甲基乙醇胺缩合得 到衍生物i-13-i-16，最后与碘甲烷反应得到衍生物i-17-i-20。
[0020][0021]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-21-i-24的合成方法如反应式七所示：羧酸8或9 与n，n-二甲基乙醇胺缩合得到衍生物i-21-i-22，最后与碘甲烷反应得到衍生物i-23-i-24。
[0022][0023]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-25-i-26的合成方法如反应式八所示：羧
酸4与 n，n-二甲氨基乙胺缩合得到衍生物i-25，最后与碘甲烷反应得到衍生物i-26。
[0024][0025]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-27-i-28的合成方法如反应式九所示：羧酸10与 n，n-二甲基乙醇胺缩合得到衍生物i-27，最后与碘甲烷反应得到衍生物i-28。
[0026][0027]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-29-i-35的合成方法如反应式十所示：羧酸10与 相应的胺缩合得到衍生物i-29-i-35。
[0028][0029]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-36的合成方法如反应式十一所示：衍生物i-29与 碘甲烷反应得到衍生物i-36。
[0030][0031]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-37的合成方法如反应式十二所示：衍生物i-32在 三氟乙酸条件下脱保护基得到衍生物i-37。
[0032][0033]
本发明的生物碱pulmonarin b衍生物i-38的合成方法如反应式十三所示：衍生物i-37与 氟硼吡咯醛11经还原胺化反应得到衍生物i-38，衍生物i-38具有很好的荧光性能，可以用于 后期的作用机制研究。
[0034][0035]
本发明生物碱pulmonarin b衍生物i-1-i-38具有很好的抗植物病毒和病菌活性。能够很 好的抑制烟草花叶病毒，大部分化合物都表现出优于对照药病毒唑的抑制活性。对黄瓜枯萎， 花生褐斑，苹果轮纹，小麦纹枯，玉米小斑，西瓜炭疽，水稻恶苗，番茄早疫，小麦赤霉， 水稻稻瘟，辣椒疫霉，油菜菌核，黄瓜灰霉，水稻纹枯14种植物病菌表现出广谱的抑制活性。
[0036]
相比于现有技术，本发明生物碱pulmonarin b衍生物i-1-i-38结构简单，骨架新颖，源 于天然产物，具有很好的环境相容性，易于合成，稳定性好，水溶性好。本发明首次发现生 物碱pulmonarin b衍生物i-1-i-38表现出很好的抗植物病毒和病菌活性。
具体实施方式
[0037]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当 理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围 的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值 范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0038]
实施例1：衍生物i-1-i-2的合成：
[0039][0040]
将化合物1(1.0g，3.28mmol)溶于20ml甲醇中，在冰水浴条件下，加入浓硫酸(0.07g， 0.64mmol，0.2equiv)，在80℃条件下，反应16小时，减压浓缩脱溶，加入50ml水，分别 用20ml乙酸乙酯萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶，得到化合物2，1.04 g，收率98％，白色固体，熔点119-122℃。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.15(s，2h，ar-h)，6.38 (s，1h，oh)，3.91(s，3h，och3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ164.5，153.2，133.7，124.7，109.7， 52.6.
[0041]
将化合物2(1.0g，3.1mmol)溶于30ml丙酮中，加入碳酸钾(0.51g，3.7mmol，1.2equiv)， 在室温条件下，搅拌10分钟，加入碘甲烷(0.53g，3.7mmol，1.2equiv)，继续在室温条件下， 反应12小时，减压浓缩脱溶，加入50ml水，分别用20ml乙酸乙酯萃取3次，有机层用 无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶，得到化合物3，1.01g，收率97％，白色固体，熔点88-92℃。 1
h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.19(s，2h，ar-h)，3.94(s，3h，och3)，3.92(s，3h，och3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ164.4，157.9，134.1，128.3，118.2，60.8，52.7.
[0042]
将化合物3(0.50g，1.55mmol)溶于7ml四氢呋喃和3ml水中，加入氢氧化钠(0.12g， 3.10mmol，2equiv)，在室温条件下，反应6小时，滴加硫酸溶液(3m)，调节ph至1.0～2.0， 抽滤，得到化合物4，0.45g，收率95％，白色固体，熔点181-187℃。1h nmr(400mhz， dmso-d6)δ13.53(s，1h，cooh)，8.10(s，2h，ar-h)，3.86(s，3h，och3).
13
c nmr(100mhz， dmso-d6)δ165.0，157.5，134.1，130.1，118.2，61.1.
[0043]
将化合物4(0.10g，0.32mmol)溶于10ml二氯甲烷中，加入n，n-二甲乙醇胺(0.057g，0.64 mmol，2equiv)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，0.12g，0.64mmol，2equiv) 和4-二甲氨基吡啶(dmap，0.004g，0.032mmol，0.1equiv)，在室温条件下，反应12小时，加 入20ml水，分别用10ml二氯甲烷萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶， 通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝100/1)纯化，得到化合物2-(二甲胺基)乙基3，5-二溴-4-甲氧基苯 甲酸酯(i-1)，0.06g，收率75％，无色油状物。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.20(s，2h，ar-h)， 4.43(t，j＝5.8hz，2h，och2)，3.95(s，3h，och3)，2.72(t，j＝5.8hz，2h，n-ch2)，2.34(s，6h， n-ch3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ163.9，158.0，134.1，128.4，118.2，63.5，60.8，57.8，45.8. hrms(esi)calcd for c
12h16
br2no3(m h)

379.9491，found 379.9493.
[0044]
将化合物i-1(0.1g，0.26mmol)溶于3ml丙酮中，加入碘甲烷(0.04g，0.26mmol，1equiv)， 在室温条件下，反应1小时，减压浓缩脱溶，得到化合物2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯甲酰氧 基)-n，n，n-三甲基乙基-1-碘化铵(i-2)，0.09g，收率95％，白色固体，熔点180-190℃。1h nmr (400mhz，dmso-d6)δ8.19(s，2h，ar-h)，4.71(t，j＝5.8hz，2h，och2)，3.88(s，3h，
och3)， 3.82(t，j＝5.8hz，2h，n-ch2)，3.18(s，9h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ163.0， 158.2，134.1，128.4，118.6，64.2，61.2，59.9，53.3.hrms(esi)calcd for c
13h18
br2no3(m-i-)
393.9648，found 393.9653.
[0045]
实施例2：衍生物i-3-i-11的合成：
[0046][0047]
将化合物i-1(1.0mmol)溶于5ml三氯甲烷中，加入溴化物(1.2mmol，1.2equiv)，在 70℃条件下，反应2～7小时，减压浓缩脱溶，加入适量丙酮/石油醚重结晶，抽滤，得到化 合物i-3-i-11，产物数据如下：
[0048]
n-苄基-2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯甲酰氧基)-n，n-二甲基乙基-1-溴化铵(i-3)
[0049]
白色固体，熔点166-175℃，收率95％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.21(s，2h，ar-h)， 7.61(d，j＝7.5hz，2h，ar-h)，7.57-7.53(m，3h，ar-h)，4.80(t，j＝4.0hz，2h，och2)，4.71(s， 2h，ch2)，3.88(s，3h，och3)，3.88(t，j＝4.0hz，2h，n-ch2)，3.10(s，6h，n-ch3).
13
c nmr(100 mhz，dmso-d6)δ163.1，158.1，134.1，133.6，130.8，129.4，128.5，128.4，118.6，67.5，67.4，61.2， 59.8，49.9.hrms(esi)calcd for c
19h22
br2no3(m-br-)

469.9961，found 469.9966.
[0050]
2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯甲酰氧基)-n，n-二甲基-n-(4-三氟甲基苄基)乙基-1-溴化铵(i-4)
[0051]
白色固体，熔点157-164℃，收率90％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.21(s，2h，ar-h)， 7.93(d，j＝8.1hz，2h，ar-h)，7.84(d，j＝8.1hz，2h，ar-h)，4.81(s，2h，ch2)，4.78(t，j＝4.0hz， 2h，och2)，3.88(t，j＝4.0hz，2h，n-ch2)，3.88(s，3h，och3)，3.12(s，6h，n-ch3).
13
c nmr (100mhz，dmso-d6)δ172.8，163.1，158.2，134.6，134.1，133.0，131.2，128.4，126.3，118.6，66.4， 63.2，61.2，59.7，50.1.hrms(esi)calcd for c
20h21
br2f3no3(m-br-)

537.9835，found 437.9839.
[0052]
n-(4-叔丁基苄基)-2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯甲酰氧基)-n，n-二甲基乙基-1-溴化铵(i-5)
[0053]
白色固体，熔点133-140℃，收率88％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.21(s，2h，ar-h)， 7.57(d，j＝8.4hz，2h，ar-h)，7.53(d，j＝8.4hz，2h，ar-h)，4.80(t，j＝4.0hz，2h，
162.5，157.6，133.6，127.9，118.0，83.3，72.5，61.7，60.7，59.2，54.0，50.5.hrms(esi)calcd for c
15h18
br2no3(m-br-)

417.9648，found 417.9647.
[0064]
n-(2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯甲酰氧基乙基)-n，n-二甲基-2-氧-2-苯乙基-1-溴化铵(i-11)
[0065]
白色固体，熔点182-195℃，收率95％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.95(s，2h，ar-h)， 7.88(d，j＝7.6hz，2h，ar-h)，7.71-7.63(m，1h，ar-h)，7.54-7.50(m，2h，ar-h)，5.53(s，2h， coch2)，4.78(t，j＝4.0hz，2h，och2)，4.19(t，j＝4.0hz，2h，n-ch2)，3.83(s，3h，och3)，3.44 (s，6h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ191.4，162.6，157.4，134.7，134.0，133.3，128.9， 127.7，127.5，117.8，65.3，62.3，60.6，59.6，52.5.hrms(esi)calcd for c
20h22
br2no4(m-br-)
497.9910，found 497.9911.
[0066]
实施例3：2-(3，5-二溴-4-羟基苯甲酰氧基乙基)-n，n，n-三甲基乙基-1-溴化铵(i-12)的合成：
[0067][0068]
将化合物4(1.0g，3.25mmol)溶于5ml二氯亚砜，在70℃条件下，反应5小时，减压 浓缩脱溶，加入10ml n，n-二甲基乙醇胺，在140℃条件下，反应5小时，减压浓缩脱溶， 加入50ml水，分别用20ml乙酸乙酯萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶， 通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝30/1)纯化，得到化合物5，1.05g，收率88％，白色固体，熔点 183-198℃。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.77(s，2h，ar-h)，4.41(t，j＝6.0hz，2h，och2)， 3.37(t，j＝6.0hz，2h，n-ch2)，2.81(s，6h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ165.0， 164.6，133.3，114.3，110.3，58.7，56.2，43.6.hrms(esi)calcd for c
11h14
br2no3(m h)
365.9335，found 365.9338.
[0069]
将化合物5(0.20g，0.55mmol)溶于5ml丙酮中，加入碘甲烷(0.09g，0.66mmol，1.2 equiv)，室温条件下，反应3小时，减压浓缩脱溶，得到化合物2-((3，5-二溴-4-羟基苯甲酰氧 基乙基)-n，n，n-三甲基乙基-1-碘化铵(i-12)，0.2g，收率98％，白色固体，熔点185-194℃。 1
h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.04(s，2h，ar-h)，4.65(t，j＝6.0hz，2h，och2)，3.81(t，j＝ 6.0hz，2h，n-ch2)，3.19(s，9h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ163.6，134.0，133.7， 112.5，64.3，63.3，59.2，53.3，43.1，40.6.hrms(esi)calcd for c
12h16
br2no3(m-i-)

379.9491， found 379.9498.
[0070]
实施例4：衍生物i-13-i-20的合成：
[0071][0072]
将化合物2(1.0g，3.1mmol)溶于30ml丙酮中，加入碳酸钾(0.51g，3.7mmol，1.2equiv)， 室温条件下，搅拌10分钟，加入溴化物(1.2equiv)，继续在室温条件下，反应12～24小时， 减压浓缩脱溶，加入50ml水，分别用20ml乙酸乙酯萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥， 减压浓缩脱溶，通过柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1～10/1)纯化得到化合物6a-6d：
[0073]
化合物6a：白色固体，熔点116-122℃，收率95％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.24(s，2h， ar-h)，7.62(d，j＝6.5hz，2h，ar-h)，7.47-7.39(m，3h，ar-h)，5.11(s，2h，och2)，3.95(s，3h，och3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ164.4，156.6，135.7，134.2，128.7，128.6，128.6，128.5， 118.7，74.9，52.7.
[0074]
化合物6b：白色固体，熔点83-86℃，收率92％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.21(s，2h，ar-h)， 6.24-6.14(m，1h，ch
2-ch)，5.49(dd，j＝10.4，1.2hz，1h，＝ch2)，5.34(dd，j＝10.4，1.2hz，1h， ＝ch2)，4.63(d，j＝4.8hz，1.1hz，2h，ch-ch2)，3.94(s，3h，och3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3) δ164.4，156.9，134.1，132.5，128.2，119.3，118.69，74.3，52.7.
[0075]
化合物6c：白色固体，熔点106-114℃，收率98％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.13(s， 2h，ar-h)，4.87(d，j＝1.5hz，2h，c-ch2)，3.87(s，3h，och3)，3.70(s，1h，ch).
13
c nmr(100 mhz，dmso-d6)δ163.5，155.1，133.3，128.7，118.5，79.9，77.7，60.6，52.8.
[0076]
化合物6d：白色固体，熔点117-124℃，收率92％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.24(s，2h， ar-h)，8.03(d，j＝7.3hz，2h，ar-h)，7.67-7.64(m，1h，ar-h)，7.55-7.52(m，2h，ar-h)，5.36 (s，2h，och2)，3.96(s，3h，och3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ192.20，164.20，156.30，134.2， 134.0，128.9，128.1，118.1，74.4，52.8.
[0077]
将化合物6a-6d(1.0mmol)溶于7ml四氢呋喃和3ml水中，加入氢氧化钠(2.0mmol，2 equiv)，在室温条件下，反应6小时，滴加硫酸溶液(3m)，调节ph至1.0～2.0，抽滤，得到 化合物7a-7d：
[0078]
化合物7a：白色固体，熔点202-216℃，收率95％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.58
(s， 1h，cooh)，8.15(s，2h，ar-h)，7.59(d，j＝6.6hz，2h，ar-h)，7.48-7.40(m，3h，ar-h)，5.06(s， 2h，och2).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ164.5，155.6，135.7，133.64，133.5，129.7，128.5， 128.4，118.2，74.5.
[0079]
化合物7b：白色固体，熔点160-170℃，收率92％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.55(s， 1h，cooh)，8.10(s，2h，ar-h)，6.18-6.09(m，1h，ch
2-ch)，5.46(dd，j＝10.2，1.1hz，1h， ＝ch2)，5.32(dd，j＝10.2hz 1.1hz，1h，＝ch2)，4.59(d，j＝5.6hz，2h，ch-ch2).
13
c nmr(100 mhz，dmso-d6)δ165.0，156.4，134.0，133.3，130.0，119.4，118.6，74.5.
[0080]
化合物7c：白色固体，熔点201-210℃，收率93％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.60(s， 1h，cooh)，8.11(s，2h，ar-h)，4.86(d，j＝2.1hz，2h，c-ch2)，3.71(s，1h，ch).
13
c nmr(100 mhz，dmso-d6)δ165.0，155.3，134.0，130.5，118.9，80.3，78.3，61.0.
[0081]
化合物7d：白色固体，熔点188-197℃，收率90％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ13.60(s， 1h，cooh)，8.13(s，2h，ar-h)，8.01(d，j＝8.3hz，2h，ar-h)，7.72-7.67(m，1h，ar-h)，7.57
-ꢀ
7.55(m，2h，ar-h)，5.50(s，2h，och2).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ192.9，165.0，156.2， 134.5，134.3，134.1，130.3，129.4，128.4，118.2，75.1.
[0082]
将化合物7a-7d(1.0mmol)溶于10ml二氯甲烷中，加入n，n-二甲乙醇胺(2.0mmol，2 equiv)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.0mmol，2equiv)和4-二甲氨基吡啶(0.1 mmol，0.1equiv)，在室温条件下，反应12小时，加入20ml水，分别用10ml二氯甲烷萃 取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶，通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50/1～100/1) 纯化，得到化合物i-13-i-16：
[0083]
2-(二甲胺基)乙基4-苄氧基-3，5-二溴苯甲酸酯(i-13)
[0084]
无色油状物，收率65％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.22(s，2h，ar-h)，7.60(s，2h，ar-h)，7.45
ꢀ-
7.41(m，3h，ar-h)，5.08(s，2h，och2)，4.43(t，j＝5.8hz，2h，cooch2)，2.72(t，j＝5.8hz， 2h，n-ch2)，2.33(s，6h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ174.5，134.2，128.6，118.7，116.4， 114.2，74.9，63.6，57.8，45.8.hrms(esi)calcd for c
18h20
br2no3(m h)

455.9804，found 455.9801.
[0085]
2-(二甲胺基)乙基4-烯丙氧基-3，5-二溴苯甲酸酯(i-14)
[0086]
无色油状物，收率85％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.19(s，2h，ar-h)，6.22-6.12(m，1h，ch)， 5.47(dd，j＝17.1hz 1.1hz，1h，＝ch2)，5.32(dd，j＝17.1hz 1.1hz，1h，＝ch2)，4.60(d，j＝5.6 hz，2h，ch-ch2)，4.42(t，j＝5.4hz，2h，och2)，2.70(t，j＝5.4hz，2h，n-ch2)，2.33(s，6h， n-ch3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ163.9，156.9，134.1，132.5，128.31，119.3，118.6，74.3，63.5， 57.8，45.8.hrms(esi)calcd for c
14h18
br2no3(m h)

405.9648，found 405.9644.
[0087]
2-(二甲胺基)乙基3，5-二溴-4-炔丙氧基苯甲酸酯(i-15)
[0088]
白色固体，熔点65-68℃。收率76％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.21(s，2h，ar-h)，4.86(d， j＝2.4hz，2h，c-ch2)，4.44(t，j＝5.8hz，2h，och2)，2.72(t，j＝5.8hz，2h，n-ch2)，2.59(t，j ＝2.4hz，1h，ch)，2.35(s，6h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ163.8，155.7，134.1，128.9， 118.7，76.8，63.6，60.6，57.8，45.8.hrms(esi)calcd for c
14h16
br2no3(m h)

403.9491，found 403.9497.
[0089]
2-(二甲胺基)乙基3，5-二溴-4-(2-氧-2-苯乙氧基)苯甲酸酯(i-16)
[0090]
白色固体，熔点73-78℃，收率78％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.21(s，2h，ar-h)，8.00(d， j＝7.7hz，2h，ar-h)，7.64-7.60(m，1h，ar-h)，7.52-7.48(m，2h，ar-h)，5.33(s，2h，och2)， 4.43(t，j＝5.4hz，2h，cooch2)，2.71(t，j＝5.4hz，2h，n-ch2)，2.33(s，6h，n-ch3).
13
c nmr (100mhz，cdcl3)δ192.2，163.7，156.3，134.3，134.2，134.0，129.0，128.9，128.1，118.1，74.4，63.6， 57.7，45.8.hrms(esi)calcd for c
19h20
br2no4(m h)

483.9754，found 483.9758.
[0091]
将化合物i-13-i-16(1.0mmol)溶于5ml丙酮中，加入碘甲烷(1.5mmol，1.5equiv)，室温 条件下，反应1小时，减压浓缩脱溶，得到化合物i-17-i-20：
[0092]
2-((4-(苄氧基)-3，5-二溴苯甲酰基)氧基)-n，n，n-三甲基乙基-1-碘化铵(i-17)
[0093]
白色固体，熔点191-203℃，收率95％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.23(s，2h，ar-h)， 7.58(d，j＝6.8hz，2h，ar-h)，7.48-7.39(m，3h，ar-h)，5.08(s，2h，och2)，4.73(t，j＝5.8hz， 2h，cooch2)，3.84(t，j＝5.8hz，2h，n-ch2)，3.21(s，9h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz， dmso-d6)δ163.1，156.8，136.0，134.1，129.1，129.0，129.0，128.6，119.0，75.1，64.2，59.9，53.4. hrms(esi)calcd for c
19h22
br2no3(m-i-)

469.9961，found 469.9965.
[0094]
2-((4-(烯丙氧基)-3，5-二溴苯甲酰基)氧基)-n，n，n-三甲基乙基-1-碘化铵(i-18)
[0095]
白色固体，熔点170-180℃，收率98％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.19(s，2h，ar-h)， 6.16-6.13(m，1h，ch)，5.46(dd，j＝17.2，1.4hz，1h，＝ch2)，5.32(dd，j＝17.2，0.9hz，1h， ＝ch2)，4.71(t，j＝5.4hz，2h，cooch2)，4.61(d，j＝5.7hz，2h，ch-ch2)，3.84(t，j＝5.4hz， 2h，n-ch2)，3.19(s，9h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ163.0，157.0，134.0，133.1， 128.4，119.7，118.9，74.6，64.2，59.9，53.3.hrms(esi)calcd for c
15h20
br2no3(m-i-)

419.9804， found 419.9807.
[0096]
2-((3，5-二溴-4-炔丙氧基苯甲酰基)氧基)-n，n，n-三甲基乙基-1-碘化铵(i-19)
[0097]
白色固体，熔点180-192℃，收率98％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.19(s，2h，ar-h)， 4.90(d，j＝2.4hz，2h，c-ch2)，4.71(t，j＝5.8hz，2h，och2)，3.84(t，j＝5.8hz，2h，n-ch2)， 3.71(t，j＝2.4hz，1h，ch)，3.20(s，9h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ163.0，155.9， 134.0，128.8，119.2，80.4，78.1，64.2，61.1，60.0，53.4.hrms(esi)calcd for c
15h18
br2no3(m-i-)
417.9648，found 417.9645.
[0098]
2-((3，5-二溴-4-(2-氧-2-苯乙氧基)苯甲酰基)氧基)-n，n，n-三甲基乙基-1-碘化铵(i-20)
[0099]
白色固体，熔点179-190℃，收率97％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.22(s，2h，ar-h)， 8.02(d，j＝6.9hz，2h，ar-h)，7.71-7.65(m，1h，ar-h)，7.62-7.57(m，2h，ar-h)，5.55(s，2h， coch2)，4.75(t，j＝6.6hz，2h，och2)，3.82(t，j＝6.6hz，2h，n-ch2)，3.21(s，9h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ192.4，175.6，162.5，134.0，133.8，133.6，128.9，127.9，117.9，74.6， 63.7，59.5，52.9.hrms(esi)calcd for c
20h22
br2no4(m-i-)

497.9910，found 497.9918.
[0100]
实施例5：衍生物i-21-i-24的合成：
[0101][0102]
将化合物8或9(1.0mmol)溶于10ml二氯甲烷中，加入n，n-二甲乙醇胺(2.0mmol，2 equiv)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，2.0mmol，2equiv)和4-二甲氨基吡 啶(dmap，0.1mmol，0.1equiv)，在室温条件下，反应12小时，加入20ml水，分别用10ml 二氯甲烷萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶，通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇 ＝100/1)纯化，得到化合物i-21和i-22，产物数据如下：
[0103]
2-(二甲胺基)乙基3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酸酯(i-21)
[0104]
无色油状物，收率72％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.00(s，2h，ar-h)，4.44(t，j＝5.4hz，2h， och2)，3.98(s，3h，och3)，2.72(t，j＝5.4hz，2h，n-ch2)，2.35(s，6h，n-ch3).
13
c nmr(100 mhz，cdcl3)δ174.2，130.3，129.6，113.2，63.6，60.9，57.8，45.8.hrms(esi)calcd for c
12h16
cl2no3(m h)

292.0502，found 292.0507.
[0105]
2-(二甲胺基)乙基3，5-二碘-4-甲氧基苯甲酸酯(i-22)
[0106]
无色油状物，收率64％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.44(s，2h，ar-h)，4.43(t，j＝5.8hz，2h， och2)，3.91(s，3h，och3)，2.72(t，j＝5.8hz，2h，n-ch2)，2.35(s，6h，n-ch3).
13
c nmr(100 mhz，cdcl3)δ163.4，162.6，141.3，129.4，90.1，63.5，60.8，57.8，45.8.hrms(esi)calcd for c
12h16
i2no3(m h)

475.9214，found 475.9217.
[0107]
将化合物i-21或i-22(0.50mmol)溶于5ml丙酮中，加入碘甲烷(0.60mmol，1.2equiv)， 在室温条件下，反应3小时，减压浓缩脱溶，得到化合物i-23和i-24：
[0108]
2-((3，5-二氯-4-甲氧基苯甲酰基)氧基)-n，n，n-三甲基乙基-1-碘化铵(i-23)
[0109]
白色固体，熔点177-182℃，收率95％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.04(s，2h，ar-h)， 4.73(t，j＝5.4hz，2h，och2)，3.92(s，3h，och3)，3.86(t，j＝5.4hz，2h，n-ch2)，3.22(s，9h， n-ch3).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ162.7，155.7，130.0，128.9，126.9，63.7，61.0，59.4，52.9. hrms(esi)calcd for c
13h17
cl2no3(m-i-)

305.0580，found 305.0583.
[0110]
2-((3，5-二碘-4-甲氧基苯甲酰基)氧基)-n，n，n-三甲基乙基-1-碘化铵(i-24)
[0111]
白色固体，熔点180-188℃，收率98％。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.35(s，2h，ar-h)， 4.69(t，j＝5.8hz，2h，och2)，3.82(t，j＝5.8hz，2h，n-ch2)，3.81(s，3h，och3)，3.18(s，9h， n-ch3).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ163.2，162.8，140.8，129.1，92.7，64.2，61.0，59.7，53.3. hrms(esi)calcd for c
13h17
i2no3(m-i-)

488.9292，found 488.9291.
[0112]
实施例6：衍生物i-25-i-26的合成：
[0113]
将化合物4(0.5g，1.56mmol)溶于5ml二氯甲烷中，加入n，n-二甲基乙二胺(0.15g，1.72 mmol，1.1equiv)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，0.45g，2.34mmol，1.5 equiv)、1-羟基苯并三唑(hobt，0.11g，0.78mmol，0.5equiv)和三乙胺(0.48g，4.68mmol，3 equiv)，在n2保护，室温条件下，反应6小时，减压浓缩脱溶，加入20ml水，分别用10ml 乙酸乙酯萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶，通过柱色谱
(二氯甲烷/甲醇 ＝20/1)纯化，得到化合物3，5-二溴-n-(2-(二甲胺基)乙基)-4-甲氧基苯甲酰胺(i-25)，0.51g，收 率83％，白色固体，熔点100-104℃。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.95(s，2h，ar-h)，6.88(s， 1h，nh)，3.92(s，3h，och3)，3.50(t，j＝5.4hz，2h，conh-ch2)，2.52(t，j＝5.4hz，2h，n-ch2)， 2.28(s，6h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ164.2，156.6，132.9，131.6，118.3，57.6，45.2， 37.4.hrms(esi)calcd for c
12h17
br2n2o2(m h)

378.9651，found 378.9655.
[0114][0115]
将化合物i-25(0.10g，0.25mmol)溶于5ml丙酮中，加入碘甲烷(0.05g，0.38mmol，1.5 equiv)，室温条件下，反应1小时，减压浓缩脱溶，得到化合物2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯甲酰 氨基)-n，n，n-三甲基乙基-1-碘化铵(i-26)，0.098g，收率95％，白色固体，熔点175-184℃。 1
h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.96(t，j＝5.2hz，1h，nh)，8.12(s，2h，ar-h)，3.85(s，3h， och3)，3.69(t，j＝6.3hz，2h，conh-ch2)，3.50(t，j＝6.3hz，2h，n-ch2)，3.14(s，9h，n-ch3). 13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ163.5，156.0，132.1，131.8，117.7，63.6，60.6，52.6，33.9.hrms (esi)calcd for c
13h19
br2n2o2(m-i-)

392.9808，found 392.9806.
[0116]
实施例7：衍生物i-27-i-28的合成：
[0117][0118]
将化合物10(0.5g，1.56mmol)溶于15ml二氯甲烷中，加入n，n-二甲基乙醇胺(0.28g，2.0 mmol，2equiv)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，1.20g，2.0mmol，2equiv) 和4-二甲氨基吡啶(dmap，0.02g，0.1mmol，0.1equiv)，在室温条件下，反应12小时，加入 20ml水，分别用10ml二氯甲烷萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶，通 过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50/1～100/1)纯化，得到化合物2-(二甲胺基)乙基2-(3，5-二溴-4-甲氧 基苯基)乙酸酯(i-27)，0.43g，收率70％，无色油状物。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.47(s，2h，ar-h)，4.26(t，j＝6.9hz，2h，co
2-ch2)，3.90(s，3h，-ch3)，3.58(s，2h，coch2)，2.65(s，j＝8.9 hz，2h，n-ch2)，2.34(s，6h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ135.3，133.6，132.4，118.1， 117.8，77.35，77.0，76.7，62.5，60.6，57.4，45.3，39.7.hrms(esi)calcd for c
13h18
br2no3(m h)
393.9648，found 393.9647.
[0119]
将化合物i-27(0.4g，1.0mmol)溶于5ml丙酮中，加入碘甲烷(0.14g，1.5mmol，1.5 equiv)，室温条件下，反应1小时，减压浓缩脱溶，得到化合物2-(2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯基) 乙酰氧基)-n，n，n-三甲基乙基-1-碘化铵(i-28)，0.5g，收率98％，白色固体，熔点171
～173℃。 1
h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.65(s，2h，ar-h)，4.48(t，j＝6.9hz，2h，co
2-ch2)，3.80(s， 3h，och3)，3.7(t，j＝7.9hz，2h，n-ch2)，3.68(s，2h，coch2)，3.12(s，9h，n-ch3).
13
c nmr (100mhz，dmso-d6)δ169.9，152.3，134.0，133.5，117.0，63.6，60.4，58.5，52.9，40.2，39.9，39.7， 39.5，39.3，39.1，38.9，38.2.hrms(esi)calcd for c
14h20
br2no3(m-i-)

407.9804，found 407.9807.
[0120]
实施例8：衍生物i-29-i-35的合成：
[0121]
将化合物10(1.0mmol)溶于5ml二氯甲烷中，加入相应的胺(1.1mmol，1.1equiv)、1-(3
-ꢀ
二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci，1.5mmol，1.5equiv)、1-羟基苯并三唑(hobt，0.5 mmol，0.5equiv)和三乙胺(3.0mmol，3equiv)，在n2保护，室温条件下，反应6～8小时，减压 浓缩脱溶，加入20ml水，分别用10ml乙酸乙酯萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，减 压浓缩脱溶，通过柱色谱纯化，得i-29-i-35：
[0122][0123]
2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯基)-n-(2-(二甲胺基)乙基)乙酰胺(i-29)
[0124]
白色固体，熔点86-91℃，收率75％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.45(s，2h，ar-h)，6.49(s， 1h，nh)，3.86(s，3h，och3)，3.44(s，2h，coch2)，3.35-3.31(m，2h，conh-ch2)，2.47(t，j＝ 5.8hz，2h，n-ch2)，2.27(s，6h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ170.1，153.1，133.9， 133.4，118.1，60.6，57.7，45.0，41.8，36.9.hrms(esi)calcd for c
13h19
br2n2o2(m h)

392.9808， found 392.9805.
[0125]
n-丁基-2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯基)乙酰胺(i-30)
[0126]
白色固体，熔点90-94℃，收率99％。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.44(s，2h，ar-h)，5.62(s， 1h，nh)，3.89(s，3h，och3)，3.44(s，2h，coch2)，3.27-3.22(m，2h，conh-ch2)，1.51-1.44 (m，2h，nhch
2-ch2)，1.35-1.30(m，2h，ch
3-ch2)，0.93(d，j＝7.3hz，3h，ch
2-ch3).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ169.5，153.3，133.7，133.4，118.3，60.7，42.2，39.6，31.6，20.1，13.7. hrms(esi)calcd for c
13h18
br2no2(m h)

377.9699，found 377.9704.
ch2)，3.10 (s，9h，n-ch3).
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ170.4，152.5，135.7，134.0，117.5，64.0，60.9， 53.0，33.7.hrms(esi)calcd for c
14h21
br2n2o2(m-i-)

406.9964，found 406.9967.
[0140]
实施例10：衍生物i-37的合成：
[0141][0142]
在冰水浴条件下，将化合物i-32(0.05g，0.11mmol)溶于0.5ml三氟乙酸和2ml二氯甲 烷中，在室温条件下，反应3小时，减压浓缩脱溶，用50％氢氧化钠溶液，调节ph＝10，加 入20ml水，分别用20ml乙酸乙酯萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶， 得到化合物n-(2-氨基乙基)-2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯基)乙酰胺(i-37)，0.038g，收率96％，无 色油状物。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.45(s，2h，ar-h)，6.10(s，1h，nh)，3.88(s，3h，och3)， 3.46(s，2h，coch2)，3.30(t，j＝5.9hz，2h，conh-ch2)，2.83(t，j＝5.8hz，2h，nh
2-ch2).
13
c nmr(100mhz，cdcl3)δ170.1，153.2，133.7，133.4，118.2，60.7，42.0，41.8，41.0.hrms(esi) calcd for c
11h15
br2n2o2(m h)

364.9495，found 364.9497.
[0143]
实施例11：衍生物i-38的合成：
[0144][0145]
将化合物i-37(0.4g，1.08mmol，4equiv)和化合物11(0.08g，0.27mmol)溶于24ml二氯 乙烷/甲醇(v
二氯
/v
甲醇
＝5/1)中，加入氰基硼酸钠(0.17g，2.7mmol，10equiv)和4滴乙酸，在 室温条件下，反应4小时，减压浓缩脱溶，加入50ml水，分别用20ml二氯甲烷萃取3次， 有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩脱溶，通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50/1)纯化，减压浓 缩脱溶，得到化合物2-(3，5-二溴-4-甲氧基苯基)-n-(2-((3-(5，5-二氟-1，3，7，9-四甲基-5h-4λ4，5λ4-ꢀ
二吡咯[1，2-c：2
′
，1
′-
f][1，3，2]二单杂波林宁-10-基)丙基)氨基)乙基)乙酰胺(i-38)，0.55g，收率 77％，红色固体，熔点90-94℃。1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.03(t，j＝5.2hz，1h，conh)， 7.54(s，2h，ar-h)，6.23(s，2h，py-h)，3.73(s，2h，coch2)，3.40(s，3h，och3)，3.17-3.12(m， 2h，conh-ch2)，2.95(t，j＝7.3hz，2h，c-ch2)，2.67(t，j＝6.3hz，2h，n-ch2)，2.61(t，j＝6.1 hz，2h，n-ch2)，2.42(s，6h，py-ch3)，2.40(s，6h，py-ch3)，1.70-1.62(m，2h，nhch
2-ch2). 13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ169.8，153.5，136.4，133.8，131.2，122.1，117.4，60.8，49.3，26.3， 16.4，14.6.hrms(esi)calcd for c
27h33
bbr2fn4o2(m-f-)

633.1042，found 633.1045.
[0146]
实施例12：抗烟草花叶病毒活性的测定，测定程序如下：
[0147]
1、病毒提纯及浓度测定：
[0148]
病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制烟草花叶病毒sop规范执
行。病毒 粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，4℃冷藏备用。
[0149]
2、化合物溶液配制：
[0150]
称量后，原药加入dmf溶解，制得1
×
105μg/ml母液，后用含1
‰
吐温80水溶液稀释 至所需浓度；宁南霉素制剂直接兑水稀释。
[0151]
3、活体保护作用：
[0152]
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1
‰
吐温80 水溶液对照。24h后，叶面撒布金刚砂(600目)，用毛笔蘸取病毒液，在全叶面沿支脉方向轻 擦2次，叶片下方用手掌支撑，病毒浓度10μg/ml，接种后用流水冲洗。3d后记录病斑数， 计算防效。
[0153]
4、活体治疗作用：
[0154]
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/ml，接种 后用流水冲洗。叶面收干后，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1
‰
吐温80水溶液对照。 3d后记录病斑数，计算防效。
[0155]
5、活体钝化作用：
[0156]
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，将药剂与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩 擦接种，病毒浓度10μg/ml，接种后即用流水冲洗，重复3次，设1
‰
吐温80水溶液对照。 3d后数病斑数，计算结果。
[0157]
抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]
×
100％
[0158]
阳性对照为商品化抗植物病毒药剂病毒唑。
[0159]
表1生物碱pulmonarin b衍生物i-1-i-38的抗烟草花叶病毒(tmv)活性测试结果
[0160]
[0161]
[0162][0163]
从表1数据可见，生物碱pulmonarin b衍生物i-1-i-38均表现出抗tmv活性，多数化 合物抑制活性优于商品化品种病毒唑，具有极大的开发价值。
[0164]
实施例13：抗菌活性测试，测定程序如下：
[0165]
离体杀菌测试，菌体生长速率测定法(平皿法)：
[0166]
将一定量药剂溶解在适量丙酮内，然后用含有200μg/ml乳化剂水溶液稀释至所需浓度， 然后各吸取1ml药液注入培养皿内，再分别加入9ml培养基，摇匀后制成50μg/ml的含 药平板，以添加1ml灭菌水的平板做空白对照。用直径4mm的打孔器沿菌丝外缘切取菌盘， 移至含药平板上。每处理重复三次。将培养皿放在24
±
1℃恒温培养箱内培养。48小时后调 查各处理菌盘扩展直径，求平均值，与空白对照比较计算相对抑菌率。
[0167][0168]
表2生物碱pulmonarin b衍生物i-1-i-38的离体杀菌活性测试结果：
[0169]
[0170][0171]
生物碱pulmonarin b衍生物i-1-i-38在测试浓度为50μg/ml的条件下对14种被测试菌 都表现出广谱的抑制活性，部分化合物表现出优于对着药百菌清的抑制活性，具备极大的开 发价值。
[0172]
上述实施例中所涉及的原料和试剂均由商购或参考文献方法制备获得，化学反应工艺是 本技术领域的技术人员所能掌握的。
[0173]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构 思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合 适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的 保护范围。