鉴定烟草野火菌生理小种类型的分子标记、引物对及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及鉴定烟草野火菌生理小种类型的分子标记、引物对及其应用。


背景技术：

2.烟草野火病是危害烟叶生产的主要细菌性病害之一。野火病主要危害烟草叶片，也可侵染花、蒴果和种子，在烟草整个生育期均可发生，如果野火病发生在烟草苗期，防治不及时极易造成毁灭性损失。野火病菌自然侵染烟草叶片初期，表现为侵染部位中心有一个褐色坏死的圆点，周围围绕宽的圆形黄色晕圈(直径约1厘米)。多雨高湿天气下，相邻病斑扩展融合，后期穿孔导致叶片破碎。近年，辽宁、黑龙江、云南等省份野火病在多雨潮湿的季节发病率上升，成为危害中国烟叶生产的主要细菌性病害，给烟叶成产造成巨大损失。烟草野火病致病菌为丁香假单胞杆菌烟草致病变种(pseudomonas syringae pv.tabaci，pta)，属于假单胞杆菌属，菌体杆状，无荚膜，不产生芽孢，单生，两端钝圆，鞭毛极生1～4根。野火病菌革兰氏染色阴性，生长适温为24～28℃，在金氏b培养基上生长较好，可产生绿色荧光。野火病菌除侵染烟草外，人工接种还能侵染大豆、菜豆、番茄、辣椒、马铃薯、黄瓜、龙葵等植物。目前，除通过烟草病理实验观察发病症状、生理生化实验外，也通过16s rrna和taba等特异基因检测来鉴定野火病菌。
3.国际上通常以野生烟草长花烟和栽培种黄花烟，或者以二者抗性来源的普通栽培烟草作为抗性鉴别宿主来区分野火菌的生理小种。目前已知野火菌有4个生理小种，能侵染普通栽培烟草(不含任何抗野火病基因的)而不能侵染长花烟的野火菌株为0号生理小种，能侵染长花烟而不能侵染黄花烟的为1号生理小种，既能侵染黄花又能侵染长花烟的为2号生理小种，能侵染黄花烟而不能侵染长花烟的为3号生理小种。确定烟草种植区的野火菌生理小种分布情况，是进行下一步烟草抗病育种的关键，而抗野火病烟草品种的培育是未来烟草绿色农业的优先发展方向。目前鉴定野火菌生理小种都是采用在抗性鉴别宿主烟草上接种待测菌株的植物病理试验来实现。但接种试验存在一些缺陷，一是难于控制接种剂量和接种浓度，当接种量过大接种浓度过高时，在抗病烟草上容易产生超敏反应的情况。二是野火菌在抗病烟草上因超敏反应产生的免疫斑有时与正常的野火病斑易于混淆，给结果判定带来困难。这些缺陷都给接种试验的准确性造成了影响，需要设置大量试验重复以提高鉴定的准确性。
4.因此，需要提供一种鉴定准确性高，且简单易行、工作量少的鉴定烟草野火菌生理小种类型的方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的在于提供一种简单易行、准确性高和工作量少的鉴定烟草野火菌生理小种类型的引物对及分子标记。
6.本发明的另一个目的在于提供上述引物对及分子标记在鉴定或辅助鉴定待测烟
草野火菌生理小种类型中的应用。
7.为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
8.本发明首先提供了一种鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型的引物对，所述引物对由上游引物wff1和下游引物wfr1组成：
9.所述上游引物wff1为seq id no.1所示的单链dna分子；所述下游引物wfr1为seq id no.2所示的单链dna分子。
10.包含上述引物对的试剂盒也在本发明的保护范围之内，所述试剂盒为鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型的试剂盒。
11.本发明所述试剂盒的制备方法，包括将上述引物对的各条引物分别单独包装的步骤。
12.本发明进一步提供了上述引物对或试剂盒在如下任一中的应用：
13.a1)制备用于鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型的产品；
14.a2)鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型；
15.a3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌是否为烟草野火菌0号生理小种或3号生理小种的产品；
16.a4)鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌是否为烟草野火菌0号生理小种或3号生理小种；
17.a5)制备用于鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌是否为烟草野火菌1号生理小种或2号生理小种的产品；
18.a6)鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌是否为烟草野火菌1号生理小种或2号生理小种。
19.本发明进一步提供了一种鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型的方法，包括如下步骤：
20.以待测烟草野火菌为模板，采用上述引物对或试剂盒进行菌落pcr反应，得到pcr产物；
21.若所述pcr产物中出现大小为500-750bp的条带，则将待测烟草野火菌判定为或候选为烟草野火菌0号生理小种或3号生理小种；若pcr产物未出现大小为500-750bp的条带，则将待测烟草野火菌判定为或候选为烟草野火菌1号生理小种或2号生理小种。
22.在本发明具体的实施方式中，上述方法中所述500-750bp的条带具体可为615bp的条带。
23.本发明上述菌落pcr反应的参数如下：预变性95℃5分钟；95℃40秒，58℃40秒，72℃1分钟，33个循环；72℃5分钟。
24.本发明进一步提供了用于鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型的分子标记，所述分子标记为seq id no.3所示的dna分子；
25.上述分子标记在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内：
26.b1)制备用于鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型的产品；
27.b2)鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型；
28.b3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌是否为烟草野火菌0号生理小种或3号生理小种的产品；
29.b4)鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌是否为烟草野火菌0号生理小种或3号生理小种；
30.b5)制备用于鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌是否为烟草野火菌1号生理小种或2号生理小种的产品；
31.b6)鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌是否为烟草野火菌1号生理小种或2号生理小种。
32.本发明进一步还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型的方法，包括如下步骤：
33.检测待测烟草野火菌的基因组dna中是否存在上述分子标记，如果存在上述分子标记，则待测烟草野火菌为或候选为烟草野火菌0号生理小种或3号生理小种；如果不存在上述分子标记，则待测烟草野火菌为或候选为烟草野火菌1号生理小种或2号生理小种。
34.在本发明中，上述鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌生理小种类型具体为鉴定或辅助鉴定待测烟草野火菌是烟草野火菌0号生理小种或3号生理小种还是烟草野火菌1号生理小种或2号生理小种。
35.本发明的有益效果如下：
36.本发明首次发现了烟草野火菌的特异分子标记，只存在于烟草野火菌0和3号生理小种中，可直接检测不同烟草野火菌中该分子标记的有无，初步将这些烟草野火菌划分为0号生理小种或3号生理小种与1号生理小种或2号生理小种两类，操作简单易行。
37.本发明发现的分子标记可通过设计引物进行菌落pcr能快速、准确地将0号和3号生理小种与1号和2号生理小种区分开，大大降低了接种试验进行生理小种鉴定的工作量，也提高了其准确度，对烟草抗病育种具有重要意义。另外，本发明在鉴定过程中所采用的菌落pcr在常规分子生物学实验室即能方便、快捷地开展，具有良好的推广性。
附图说明
38.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
39.图1为菌落pcr鉴定烟草野火菌生理小种类型；其中，m代表dna分子量标记，wf1～wf5为5株待测烟草野火菌株。
40.图2为烟草病理试验验证烟草野火菌生理小种类型；其中，wf1～wf5为5株待测烟草野火菌株。
具体实施方式
41.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
42.实施例1利用pcr引物或分子标记和烟草病理试验鉴别烟草野火菌生理小种类型
43.一、利用pcr引物或分子标记鉴别烟草野火菌生理小种类型
44.1、pcr引物设计
45.对烟草野火菌不同生理小种进行基因组测序，得到的烟草野火菌基因组序列。将烟草野火菌基因组所编码的蛋白的氨基酸序列与丁香假单胞杆菌属ⅲ型分泌系统效应蛋
白库比对，分别筛选出各个生理小种烟草野火菌株的ⅲ型分泌系统效应蛋白。根据丁香假单胞杆菌属不同的效应蛋白将各个生理小种烟草野火菌的相应效应蛋白分别归类。根据效应因子筛选原则：0和3号生理小种中含有而1和2号生理小种中不含有，筛选得到hopf1蛋白，其完整蛋白的编码序列如seq id no.3所示(即鉴别烟草野火菌生理小种类型的分子标记为如seq id no.3所示的dna分子)。
46.设计pcr引物，进行pcr反应得到hopf1完整蛋白的编码区。
47.pcr引物的序列为：
48.上游引物wff1：5
′‑
atgggtaatatctgcagttcg-3
′
(如seq id no.1所示)；
49.下游引物wfr1：5
′‑
ctaatcgaggatcttgaccgg-3
′
(如seq id no.2所示)；
50.pcr反应得到的pcr产物的大小为615bp。
51.2、细菌活化
52.从-80℃冰箱中将保存的wf1、wf2、wf3、wf4和wf5五株待测烟草野火菌株的菌液在冰上解冻。在超净工作台上用一次性接种环蘸取各菌液，三级划线到装有金氏b固体培养基的平板上，用封口膜封上平板，倒置放入细菌培养箱中，26℃下培养16小时。
53.3、待测样品制备
54.在超净工作台上，用无菌的10μl规格移液吸头挑取各菌株平板上长出的单个菌落，并将蘸取了单个菌落的吸头插入装有10μl无菌水的200μl规格的pcr反应管中。将吸头在无菌水里搅拌并吹吸几次，以制成菌液。然后吸取1μl菌液至新的pcr反应管中作为待测样品。
55.4、菌落pcr
56.用微量移液器依次向装有待测样品的pcr反应管中加入premix ex taq hot start version 5μl，如seq id no.1所示的上游引物wff1和如seq id no.1所示的下游引物wfr1(浓度为10μm)各1μl，用双蒸水补足使反应液总体积至10μl，吹吸混匀反应液。
57.把各反应管放入pcr仪中进行pcr反应，分别得到wf1、wf2、wf3、wf4和wf5五株待测烟草野火菌株的pcr产物。
58.设定pcr反应的参数为：预变性95℃5分钟；95℃40秒，58℃40秒，72℃1分钟，33个循环；72℃5分钟。
59.5、核酸电泳检测及结果判定
60.核酸电泳检测：配制1％浓度的琼脂糖凝胶并加入核酸显色剂。将上述wf1、wf2、wf3、wf4和wf5五个待测烟草野火菌株的pcr产物混入上样缓冲液并点样到琼脂糖凝胶上，将琼脂糖凝胶放入tae缓冲液中电泳。电泳的电压设为恒定120伏，电泳30分钟。取出电泳好的琼脂糖凝胶，放入凝胶成像仪中显影。
61.结果判定：若待测烟草野火菌株的pcr产物中出现大小为500-750bp(具体为615bp)的条带(即待测烟草野火菌株的基因组dna中存在seq id no.3所示的分子标记)，则将该待测烟草野火菌株判定为0号生理小种或3号生理小种；若待测烟草野火菌株的pcr产物中未出现大小为500-750bp(具体为615bp)的条带(即待测烟草野火菌株的基因组dna中不存在seq id no.3所示的分子标记)，则将该待测烟草野火菌株判定为1号生理小种或2号生理小种。
62.结果如图1所示，根据核酸电泳检测可以将wf1和wf4初步判定为1或2号生理小种，
而将wf2、wf3和wf5初步判定为0或3号生理小种。
63.二、利用烟草病理试验验证烟草野火菌生理小种类型
64.以常规烟草病理试验，即将各株待测野火菌株接种到作为特定的抗性鉴别宿主烟草上，来验证“步骤一、利用pcr引物或分子标记鉴别烟草野火菌生理小种类型”的判定结果。
65.1、抗性鉴别宿主烟草准备
66.在温室中，把黄花烟、长花烟和普通烤烟品种ke1三个品种的烟草播种至营养土中，其中，普通烤烟品种ke1作为野火病感病对照品种。约两个月后将烟苗移栽至花盆中，待烟苗继续生长至团棵期，接种烟草野火菌株进行病理试验。
67.2、烟草野火菌株接种液制备
68.从-80℃冰箱中将保存的wf1、wf2、wf3、wf4和wf5五株待测烟草野火菌株的菌液在冰上解冻。在超净台上，吸取100μl菌液加入到装有20ml lb液体培养基的灭菌三角瓶里，三角瓶用无菌透气膜封口后放入恒温摇床，26℃120转/分震荡培养16小时。摇好的菌液倒入50ml规格离心管中，室温5000转/分离心3分钟，离心完倒掉上清液收集菌体沉淀。菌体沉淀用灭菌pbs缓冲液重悬，然后室温5000转/分再次离心3分钟，离心完倒掉上清液再次收集菌体沉淀。用灭菌pbs缓冲液再次重悬菌体沉淀，并用平板计数法确定菌液浓度，将待测烟草野火菌株的菌液配制成浓度为106cfu/ml的接种液备用。
69.3、烟草野火菌接种试验
70.采用注射法进行烟草野火菌株接种试验，具体步骤如下：
71.首先用1ml规格注射器针头在烟草叶片上穿刺出小孔，然后用不带针头的注射器吸取待测烟草野火菌株的菌液，一手在叶片正面堵住小孔，一手用注射器从叶片反面小孔处向烟草叶片内注射菌液10～20μl。每株待测烟草野火菌株接种每种烟草的4株烟苗，每株烟苗接种顶部展开的2个叶片，每叶片上5株待测烟草野火菌株接种在不同位置。1周后拍摄记录各待测烟草野火菌株在不同抗性鉴别宿主烟草(即黄花烟、长花烟和普通烤烟品种ke1)上的病理反应。
72.4、野火菌生理小种分类
73.各待测烟草野火菌株在不同抗性鉴别宿主烟草上的病理反应如图2所示，烟草野火菌株wf1和wf4能侵染普通烤烟品种ke1(即野火病感病对照品种)，也能侵染长花烟，但不能侵染黄花烟(在黄花烟上造成的斑点为过敏性坏死斑，病斑仅局限于注射区域而无扩展)，归类为1号生理小种。烟草野火菌株wf2能侵染普通烤烟品种ke1(即野火病感病对照品种)，不能侵染长花烟，也不能侵染黄花烟，归类为0号生理小种；烟草野火菌株wf3和wf5能侵染普通烤烟品种ke1(即野火病感病对照品种)，不能侵染长花烟，但可以侵染黄花烟，归类为3号生理小种。
74.综上，wf1和wf4为1号生理小种，wf2为0号生理小种，wf3和wf5为3号生理小种。与“步骤一、利用pcr引物或分子标记鉴别烟草野火菌生理小种类型”的结果一致，验证了“步骤一、利用pcr引物或分子标记鉴别烟草野火菌生理小种类型”的准确性。
75.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发
明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。