一类化合物及其质谱标准品、校正品的制作方法

1.本发明涉及质谱分析技术领域，具体涉及一类化合物及其质谱标准品、校正品。


背景技术：

2.质谱仪是现今生命科学研究中不可或缺的仪器，可通过测定分子的质量来鉴定分子及对其进行结构解析。在利用质谱仪对分子进行鉴定和结构解析时，串级质谱是其中最重要的手段，通过对分子离子进行气相解离得到碎片离子，进而可以得到分子的结构信息。质谱仪较多，例如，基质辅助激光解吸电离-飞行时间(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight，简称maldi-tof)质谱仪是一种常见的质谱仪，具有高通量、高分辨率、高灵敏度的特点，广泛运用在代谢小分子、脂类、糖类分子、多肽及蛋白质的检测和鉴定中。
3.基于maldi-tof质谱仪的离子碎裂实现方式主要有源内裂解(in-source decay，简称isd)和串级飞行时间(tof/tof)两种。质谱仪器的校正对于离子质量的测定准确度非常关键，而目前对于maldi-tof质谱仪的串级质谱模式的校正有一定困难。目前常见的maldi-tof/tof的校正方法采用多肽标准品，然而这些多肽标准品产生的碎片离子多且复杂，解离效率一般，从而导致碎片离子信号不高，特别是对大于3000da的质量范围的校正存在困难。特别地，目前没有好的校标品可以对负离子模式下的串级质谱进行校正。对maldi-isd的校正则依赖蛋白标准品，蛋白标准品产生碎片离子多样且复杂，碎片离子信号强度不高，校正准确度不高，同时这种校正方式只能用于外标法，质量测定的准确度不高。而内标法可以提高质量测定的准确度，但目前没有可用于maldi-isd测定的内标标准品。


技术实现要素：

4.根据第一方面，提供一类化合物，其特征在于，所述化合物含有至少一个在质谱分析中易产生碎片离子的化学键。
5.根据第二方面，在一实施例中，提供一种标准品，所述标准品含有第一方面所述化合物。
6.根据第三方面，在一实施例中，提供一种校正品，所述校正品含有第一方面所述化合物。
7.依据上述实施例的一类化合物及其质谱标准品、校正品，本发明所设计的化合物可以用于质谱分析中的内标校正，也可用于正离子模式和/或负离子模式下的串级质谱校正，碎片离子丰富，信号强度高，质量分布均匀。
附图说明
8.图1(a)为rr(gdp4)8在正离子模式下maldi-tof/tof二级质谱图，图1(b)为该多肽序列及断裂位置的说明，基质为sdhb。
9.图2(a)为rr(gdp3)7在正离子模式下maldi-tof/tof二级质谱图，图2(b)为该多肽
序列及断裂位置的说明，基质为sdhb。
10.图3为rr(gdp4)8在负离子模式下maldi-tof/tof二级质谱图，基质为1，5-dan。
11.图4为rr(gdp3)7在负离子模式下maldi-tof/tof二级质谱图，基质为1，5-dan。
12.图5为rr(gdp4)8在正离子模式下maldi-isd的质谱图，基质为1，5-dan。
13.图6为rr(gdp4)8在负离子模式下maldi-isd的质谱图，基质为1，5-dan。
14.图7(a)为以rr(gdp4)8作为内标校正肌红蛋白(myoglobin)的maldi-isd谱图，图7(b)为肌红蛋白的maldi-isd碎片离子质量与理论质量的误差在经过rr(gdp4)8校正前后的对比图，基质为1，5-dan。
15.图8是根据图7的误差数据，手动输出数值后的误差对比结果图。
16.图9为肽主链化学键中产生碎片离子的键位示意图。
具体实施方式
17.下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
18.另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
19.本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本技术所说“连接”、“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
20.定义
21.如本文所用，“m/z”是指质荷比(mass charge ratio，m/z，曾用m/e)，是离子质量(以相对原子质量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值。
22.如本文所用，“da”为“道尔顿(dalton，da，d)”，是用来衡量原子或分子相对质量的单位，等效于原子质量单位(amu)或统一原子质量单位(u)，定义为未键合的碳12(
12
c)原子在原子核基态及电子基态下质量的1/12。
23.如本文所用，“肽”是指一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合而成的化合物，肽可以由两个、三个或者更多氨基酸“脱水缩合”而成。
24.如本文所用，“多肽”是指由多个(两个或两个以上)氨基酸“脱水缩合”而成的化合物。
25.如本文所用，“蛋白”亦称蛋白质，是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。
26.如本文所用，多肽的“n端”是指多肽链上具有突出的氨基(-nh2)的一端，多肽的“c
端”是指多肽链上具有突出的羧基(-cooh)的一端。
27.如本文所用，“质谱”又称质谱法，是一种测量离子质荷比(质量-电荷比)的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，根据离子在电场、磁场或真空场中运动的特征如速度、运动频率等，测得离子的质荷比，从而确定其质量。“质谱”包括一级质谱和二级质谱，一级质谱主要是给出目标物的分子量，一级质谱主要用于检测带电离子的质荷比和强度，形成一级谱图。一级质谱中的信号为分析物的分子离子峰或碎片离子峰的信号。二级质谱是按照一定方式选择特定质荷比的分析物母离子，将其进一步解离，分析所形成的子离子的质荷比和强度。
28.如本文所用，“二级质谱图”是指离子在质谱中经过碎裂而产生的碎片离子的谱图。
29.如本文所用，“肽主链化学键”(peptide backbone)是由氨基酸分子间的氨基和羧基脱水缩合而形成的化学键，因缩合产物称为肽，故名肽主链化学键，亦称“肽骨架键”、“肽键”。如图9所示，图9(a)表示一个氨基酸的结构，图(b)表示一个具有4个氨基酸的肽段。在经过碰撞诱导解离后，主链上任何一个位置都有可能断开，形成6种类型的离子：ai、bi、ci、xi、yi、zi(i＝1,2,3)。肽主链化学键中，c-c键易产生a、x离子，c-n键易产生b、y离子，n-c键易产生c、z离子(参考文献：“蛋白质理论质谱与肽段断裂模型研究及其应用”，乔彦涛，首都师范大学硕士学位论文，2009年5月，本文图9即为该文献的图1.4)。
30.根据第一方面，在一实施例中，提供一类化合物，其特征在于，所述化合物含有至少一个在质谱分析中易产生碎片离子的化学键。
31.在一实施例中，所述质谱分析可以是任意的质谱分析方法，包括但不限于串级质谱、源内裂解质谱。
32.在一实施例中，所述质谱分析可以包括但不限于基质辅助激光解吸电离-飞行时间(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight，简称maldi-tof)质谱、基质辅助激光解吸电离-源内裂解(maldi-isd)、四极杆-飞行时间(maldi-qtof)、离子阱-飞行时间(maldi-it-tof)。
33.在一实施例中，所述化合物含有至少两个易产生碎片离子的化学键时，所述两个易产生碎片离子的化学键之间间隔有至少一个不易产生碎片离子的化学键。
34.在一实施例中，所述化合物包括但不限于缩合物、聚合物中的至少一种，所述缩合物包含多肽，所述聚合物包含聚糖。缩合物是指经缩合反应释放出小分子后生成的大分子。聚合物亦称高分子化合物，简称高分子，又叫大分子，一般指相对分子质量高达几千到几百万的化合物。
35.在一实施例中，所述化学键包含共价键。
36.在一实施例中，所述共价键包含肽主链化学键。
37.在一实施例中，所述化合物的具有至少一个在质谱离子源中容易质子化的化学结构单元。
38.在一实施例中，所述化合物包含多肽时，所述多肽的n端具有至少一种在质谱离子源中容易质子化的氨基酸。
39.在一实施例中，所述碱性氨基酸包含精氨酸(arg，r)、赖氨酸(lys，k)、组氨酸
(his，h)中的至少一种。
40.在一实施例中，所述易产生碎片离子的化学键包含在maldi-isd中易产生碎片离子的化学键、在maldi-tof/tof中易产生碎片离子的化学键中的至少一种。
41.在一实施例中，所述化学键包含肽主链化学键时，易产生碎片离子的肽主链化学键包含如下肽主链化学键中的至少一种：xxx
1-xxx2pro、xxx-asp、xxx-asn、xxx-cys、gly-xxx、asp-xxx、glu-xxx，
“‑”
为易产生碎片离子的肽主链化学键，xxx1、xxx2、xxx为脯氨酸之外的任意氨基酸。
42.在一实施例中，xxx
1-xxx2pro、xxx-asp、xxx-asn、xxx-cys、gly-xxx肽主链化学键在maldi-isd中易产生碎片离子。
43.在一实施例中，asp-xxx、glu-xxx肽主链化学键在maldi-tof/tof中易产生碎片离子。
44.在一实施例中，不易产生碎片离子的肽主链化学键为所述易产生碎片离子的肽主链化学键之外的任意肽主链化学键。
45.在一实施例中，在maldi-isd中不易产生碎片离子的肽主链化学键包含如下肽主链化学键：xxx-pro，由于maldi-isd一般断裂n-αc，而n-αc有脯氨酸中的侧链连成环状，因此，该断裂在maldi-isd不产生碎片离子。
46.在一实施例中，所述化合物包含多肽时，所述多肽包含至少一种如下重复单元的氨基酸序列：-(x)dp
n-，该重复单元中，x独立地为脯氨酸(pro，p)之外的任意氨基酸，d表示x氨基酸的个数，d、n为正整数，d≥2，n表示脯氨酸的个数。
47.在一实施例中，所述多肽包含如下重复单元的氨基酸序列：-x1x2p
n-，x1、x2为脯氨酸之外的任意氨基酸，n表示脯氨酸的个数。
48.在一实施例中，所述重复单元中，x
1-x2肽主链化学键在maldi-isd中易产生碎片离子，其他肽主链化学键为不易产生碎片离子的肽主链化学键。
49.在一实施例中，所述重复单元中，x
2-p肽主链化学键在maldi-tof/tof中易产生碎片离子。
50.在一实施例中，所述重复单元中，x
1-x2、x
2-p之外的其他肽主链化学键不易产生碎片离子。
51.在一实施例中，所述重复单元中，x
1-x2、x
2-p之外的其他肽主链化学键在maldi-isd、maldi-tof/tof中均不易产生碎片离子。
52.在一实施例中，x1为甘氨酸，x2为酸性氨基酸。
53.在一实施例中，所述酸性氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸中的任意一种。
54.在一实施例中，所述多肽包含如下氨基酸序列：(x3)o[(x)dpn]m，o、m为正整数。
[0055]
在一实施例中，所述多肽包含如下氨基酸序列：(x3)o(x1x2pn)m。
[0056]
在一实施例中，x3为在质谱离子源中容易质子化的氨基酸。
[0057]
在一实施例中，x3为碱性氨基酸。
[0058]
在一实施例中，所述碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任意一种。
[0059]
在一实施例中，n为1～10的整数，m为1～15的整数，o为1～10的整数。
[0060]
在一实施例中，多肽在maldi-tof/tof中的断裂通常发生在酸性氨基酸天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的c末端处(即asp-xxx或glu-xxx)，产生的碎片离子信号强度高。
根据多肽/蛋白在maldi-isd中的解离规律，在xxx-pro处不产生碎片离子，而在xxx
1-xxx2pro、xxx-asp、xxx-asn、xxx-cys及gly-xxx(键连接符号
“‑”
为易断裂的肽主链化学键位置；xxx代表脯氨酸外的任何氨基酸；asn为天冬酰胺，缩写n；cys为半胱氨酸，缩写c；gly为甘氨酸，缩写g)处比较容易产生碎片离子。根据多肽的解离规律和校标物的特征，多肽序列中需要间隔一定的分子量含有酸性氨基酸asp和glu。
[0061]
在一实施例中，为了将多肽设计为用作maldi-isd的内标多肽，多肽的碎片离子应尽量的少，因此，在一实施例中，重复单元中含有多个脯氨酸pro。在一实施例中，脯氨酸pro的数量n≥1，优选为1～10，更优选为1～6，脯氨酸的数量可以根据实际需要进行设定。
[0062]
在一实施例中，多肽包含如下氨基酸序列：ro(gdpn)m，其中，o为氨基酸r的数量，n为每个重复单元中脯氨酸(pro，p)的个数，m为重复单元的个数，o、m、n均为正整数。ro使得碎片离子类型的具有单一性，从而使碎片离子大都为n末端的子离子，即b、c离子(按多肽碎片离子的常规命名方式)。多肽ro(gdpn)m在二级质谱中可产生m个间距为-gdp
n-的分子量的碎片峰，实现质量范围为ro(gdpn)m分子量的校正。r是指精氨酸(arg)。
[0063]
在一实施例中，n可以为1～10的整数，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等等。
[0064]
在一实施例中，n可以为3或4。
[0065]
在一实施例中，m可以为1～15的整数，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等等。
[0066]
在一实施例中，m可以为7或8。
[0067]
m的范围依据所需校正的多肽质量大小来确定，例如，所需校正的多肽包括但不限于2000da、3000da、10000da、20000da、25000da等等，依据该分子量来设定m和n的数值。
[0068]
在一实施例中，o可以为1～10的整数，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等等。
[0069]
在一实施例中，o可以为1～5的整数。
[0070]
根据第二方面，在一实施例中，提供一种标准品，标准品含有第一方面化合物。
[0071]
在一实施例中，所述质谱可以包含基质辅助激光解吸电离质谱。
[0072]
在一实施例中，所述质谱可以包含基质辅助激光解吸电离-源内裂解质谱(maldi-isd)。
[0073]
在一实施例中，所述标准品可以为用于质谱分析的内标标准品。在一实施例中，第一方面多肽可作为内标标准品，与蛋白混合，对蛋白的maldi-isd质谱图进行内标校正。
[0074]
根据第三方面，提供一种校正品，校正品含有第一方面多肽。
[0075]
在一实施例中，校正品包含用于质谱分析的校正品。
[0076]
在一实施例中，所述质谱包含串级质谱。
[0077]
在一实施例中，所述质谱包含基质辅助激光解吸电离质谱。
[0078]
在一实施例中，所述质谱包含基质辅助激光解吸电离-飞行时间串级质谱(maldi-tof/tof)。
[0079]
在一实施例中，所述质谱包含正离子模式和/或负离子模式质谱。
[0080]
在一实施例中，正离子模式下基质辅助激光解吸电离-飞行时间串级质谱校正的分子量≥3000da。现有技术中，对于正离子模式下的二级质谱校正，通常难以对分子量≥3000da的范围进行二级质谱校正，本发明可通过多肽通式中o、d、n、m的改变，覆盖更大范围的校正，比如从500～6000da，更大质量范围的校正难点在于多肽的合成，但也有潜力扩展
到更大的质量范围，比如6000～10000da，或者大于10kda。
[0081]
在一实施例中，校正品包含用于负离子模式下基质辅助激光解吸电离-飞行时间串级质谱(maldi-tof/tof)测定的校正品。
[0082]
根据第四方面，在一实施例中，提供第一方面化合物在制备用于质谱分析的标准品和/或校正品中的用途。
[0083]
在一实施例中，所述质谱可以包含基质辅助激光解吸电离质谱。
[0084]
在一实施例中，所述质谱可以包含基质辅助激光解吸电离-源内裂解质谱(maldi-isd)。
[0085]
在一实施例中，所述标准品可以为用于质谱分析的内标标准品。在一实施例中，第一方面多肽可作为内标标准品，与蛋白混合，对蛋白的maldi-isd质谱图进行内标校正。
[0086]
在一实施例中，校正品包含用于质谱分析的校正品。
[0087]
在一实施例中，所述质谱包含串级质谱。
[0088]
在一实施例中，所述质谱包含基质辅助激光解吸电离质谱。
[0089]
在一实施例中，所述质谱包含基质辅助激光解吸电离-飞行时间串级质谱(maldi-tof/tof)。
[0090]
在一实施例中，所述质谱包含正离子模式和/或负离子模式质谱。
[0091]
在一实施例中，串级质谱校正的分子量≥3000da。
[0092]
在一实施例中，串级质谱校正的分子量范围为500～5000da。
[0093]
在一实施例中，串级质谱校正包含基质辅助激光解吸电离-飞行时间串级质谱校正。
[0094]
在一实施例中，串级质谱校正包含正离子模式或负离子模式下的基质辅助激光解吸电离-飞行时间串级校正。
[0095]
在一实施例中，本发明的目的在于合理设计一类多肽标准品，用于串级质谱的校正。
[0096]
在一实施例中，本发明设计特定序列多肽，可用于maldi-tof/tof在高分子量段的校正。
[0097]
在一实施例中，本发明设计的多肽可用于maldi-tof/tof在负离子模式下的校正。
[0098]
在一实施例中，本发明设计的多肽可用作内标对maldi-isd进行校正。
[0099]
在一实施例中，可使用特定序列的多肽标准品研究多肽在串级质谱中的解离规律。
[0100]
在一实施例中，本发明根据多肽在串级质谱中的碎裂规律，设计可用于校正串级质谱的多肽，需满足条件：1、产生均匀分布的碎片离子；2、容易解离。多肽在maldi-tof/tof中的断裂通常发生在酸性氨基酸天冬氨酸(asp,d)和谷氨酸(glu,e)处(即asp-xxx,glu-xxx，其中xxx为任意氨基酸)，产生的碎片离子信号强度高。根据多肽/蛋白在maldi-isd中的解离规律，在脯氨酸(pro,p)处不产生碎片离子，而在xxx
1-xxx2pro、xxx-asp、xxx-asn、xxx-cys及gly-xxx(键连接符号
“‑”
为易产生碎片离子的位置；xxx代表脯氨酸外的任何氨基酸；asn为天冬酰胺，缩写n；cys为半胱氨酸，缩写c；gly为甘氨酸，缩写g)处比较容易产生碎片离子。根据多肽的解离规律和校标物的特征，多肽序列中需要间隔一定的分子量含有酸性氨基酸asp和glu，特别地，为了用作maldi-isd的内标多肽，多肽的碎片离子应尽量的
少，所以含有多个脯氨酸pro。据此，理论的多肽序列含有-x1x2p
n-的重复单元，其中x1可为甘氨酸gly，而x2为酸性氨基酸asp或glu，n表示脯氨酸的个数。同时，为了确保碎片离子类型的单一性，在多肽的n末端设计为碱性氨基酸精氨酸(arg，r)，从而使碎片离子大都为n末端的子离子，即b、c离子(按多肽碎片离子的常规命名方式，n端碎片离子分类为a、b、c，c端碎片离子分类为x、y、z，多肽碎片离子的命名可参考文献：p.roeppstorff,j.fohlman.proposal for a common nomenclature for sequence ions in massspectra of peptides.biomed.mass spectrom.1984,11,601.doi:10.1002/bms.1200111109)。最终，设计的多肽序列为ro(gdpn)m，其中n为每个重复单元中脯氨酸p的个数，m为重复单元的个数，o为精氨酸的个数。此处设计的多肽含有-gdp
n-的重复单元的多肽序列，理论上gly-asp-pro中gly-asp的键断裂同时符合xxx1-xxx2pro、xxx-asp、gly-xxx键在maldi-isd优先断裂的规律，而其中间隔分布的asp-pro在maldi-tof/tof中优先断裂。据此，多肽ro(gdpn)m在二级质谱中可产生m个间距为
“‑
gdpn‑”
的分子量的碎片峰，实现质量范围为ro(gdpn)m分子量的校正。
[0101]
在一实施例中，本发明所提出的多肽序列rr(gdp4)8可以对maldi-tof/tof在质量4800da左右的范围进行二级质谱的校正。
[0102]
在一实施例中，本发明所提出的多肽序列rr(gdp3)7可以对maldi-tof/tof在质量3500da左右的范围进行二级质谱的校正。
[0103]
在一实施例中，本发明所提出的多肽序列rr(gdp4)8和rr(gdp3)7可以对maldi-tof/tof在负离子模式下进行二级质谱的校正。
[0104]
在一实施例中，本发明所提出的多肽序列rr(gdp4)8和rr(gdp3)7可以对maldi-tof质谱仪在maldi-isd模式下进行内标校正。
[0105]
在一实施例中，本发明所设计的多肽序列为ro(gdpn)m，通过改变精氨酸的数量o、重复单元中脯氨酸的个数n和重复单元的个数m，可以合成新的多肽序列，实现质谱仪器分析中其他质量范围的校正，本发明所设计的多肽还可以用于其他用途，包括但不限于该系列多肽解离规律的分析。
[0106]
实施例1
[0107]
根据设计的多肽序列ro(gdpn)m，为了覆盖质量范围500～5000da的校正，委托苏州强耀生物科技有限公司合成了多肽rr(gdp4)8(seq id no.1)，其分子量为4813da，同时为了说明该多肽设计方法的可行性，合成了另一种n和m数值不同的多肽rr(gdp3)7(seq id no.2)，其分子量为3573da。取合成后的多肽，用去离子水配制成水溶液，多肽在水溶液中的浓度为0.2μg/μl。本实施例中用到的maldi基质有1,5-二氨基萘(1，5-dan，货号56451，生产商英文名为sigma-aldrich，中文名为西格玛-奥德里奇)、2，5-二羟基苯甲酸(super-dhb，货号50862，sigma-aldrich)和α-氰基-4-羟基肉桂酸(cca，货号70990，sigma-aldrich)等基质，取1μl多肽样品与1μl基质混合后点在maldi靶板上，自然干燥，再由maldi-tof/tof质谱仪采集二级质谱图。
[0108]
rr(gdp4)8的化学结构式如下：
[0109]
[0110]
rr(gdp3)7的化学结构式如下：
[0111][0112]
首先，采集母离子为m/z 4813的rr(gdp4)8的二级质谱图，其结果如图1(a)所示。rr(gdp4)8在maldi-tof/tof中解离成规律的二级质谱图，主要的碎片峰离子间隔刚好是一个-gdp
4-组成单元的分子量560da。因为多肽的n末端是两个碱性氨基酸精氨酸rr，它们在离子化过程中容易质子化，成为主要的带电荷氨基酸，所以多肽解离后质谱检测到的碎片离子主要是n末端的碎片b离子。如图1(b)所示，该多肽解离的位点主要在酸性氨基酸天冬氨酸d处，符合多肽在maldi-tof/tof中的解离规律。该多肽可对maldi-tof/tof在4800da左右的二级质谱模式进行校正。
[0113]
随后，为了验证该多肽设计方法的可延展性，合成了分子量相对更小、间隔更小的rr(gdp3)7，它的二级质谱图如图2(a)所示。如图2(b)所示，与rr(gdp4)8的二级质谱图类似，主要的碎片离子间隔为一个-gdp
3-的组成单元的分子量463da，主要的碎片离子也为b离子。因此，该多肽可对maldi-tof/tof在3500da左右的二级质谱模式进行校正。
[0114]
前述的二级质谱在正离子模式下采集，随后，在负离子模式下对多肽进行二级质谱的采集。仪器公司提供的多肽标准品(peptide calibration standard ii，货号8222570，布鲁克)在负离子模式的二级质谱中出峰极差，未采集到有效信号，这也限制了负离子模式二级质谱的应用。仪器公司提供的标准品为多肽混合物，具体如下表1所示：
[0115]
表1
[0116][0117]
rr(gdp4)8的负离子母离子为m/z 4811，其负离子模式二级质谱图如图3所示。负离子模式下碎片离子相对于正离子模式更多，主要的碎片离子不仅有b离子，还有y离子和c离子(未标出c离子，c离子总的强度较b、y离子更弱)。负离子模式下，多肽会丢失质子，因而多肽n末端的精氨酸rr较少机会成为带电荷的氨基酸，c端和天冬氨酸的酸根更倾向丢失质子，从而使得n末端和c末端的碎片离子都很丰富。相邻高丰度b离子间的间隔为一个-gdp
4-组成单元的分子量560da，y离子间的间隔也为560da。而b离子在3000da以下低分子量端的峰强度更高，y离子在3000da以上高分子量端的峰强度更高。在负离子模式下，可单独以b或y离子的峰进行校正，也可结合b或y离子的峰进行校正。同样地，rr(gdp3)7的负离子模式下
的maldi-tof/tof如图4所示，同样包含了诸多b离子和y离子，高丰度的b离子之间间距为-gdp
3-重复单元的质量，即463da。
[0118]
多肽rr(gdp4)8在maldi-isd模式下产生规律性的碎片离子，图5为rr(gdp4)8在正离子模式下maldi-isd的质谱图，图6为rr(gdp4)8在负离子模式下maldi-isd的质谱图。可见，主要的碎片离子为n末端的c离子系列，间隔为-gdp
4-组成单元的分子量，即560da。因为有连续脯氨酸pro的存在，不会产生xxx-pro(此处xxx为包括脯氨酸在内的任意氨基酸)对应的c离子，因此，maldi-isd的谱图中主要有gly-asp断裂产生的c离子，谱图干净，可作为内标，与蛋白混合，对蛋白的maldi-isd质谱图进行内标校正。
[0119]
实施例2
[0120]
本实施例中，肌红蛋白来源于马心脏，货号为m1882，购自sigma。以去离子水为溶剂，配制成浓度为0.2μg/μl的水溶液。
[0121]
将多肽rr(gdp4)8与肌红蛋白按照1:1的体积比混合，得到1μl样品，再加入1μl基质1，5-dan，混合后点在maldi靶板上，然后进行maldi-isd分析，在质谱图中同时得到肌红蛋白和rr(gdp4)8的碎片离子，如图7(a)、图8(a)所示。将肌红蛋白的碎片离子的理论质量与谱图中的碎片离子质量进行误差比对分析，发现未经过多肽rr(gdp4)8碎片离子校正谱图的误差要比经过内标校正的误差大得多，如图7(b)、图8(b)所示，在大多数m/z》1600的离子中，前者误差大于0.2da，后者误差小于0.1da。
[0122]
图8是根据图7的结果，手动输出数值后的结果图，图8(b)中只列出了系列z离子的误差。
[0123]
在一实施例中，可以使采用其他的聚合物分子，比如聚糖、多聚高分子等等，选用的聚合物需要在二级质谱中有类似的解离规律。
[0124]
在一实施例中，本发明提出的多肽序列ro(gdpn)m，可以根据实验需要对重复单元gdpn中n及重复单元的个数m进行改造，或者调整o的数值，从而获得一系列质量范围不同的校正多肽。
[0125]
在一实施例中，本发明所设计的多肽可以在负离子模式下对maldi-tof/tof进行校正，碎片离子丰富，信号强度高，质量分布均匀，而仪器公司提供的多肽标准品在负离子模式下产生碎片少且信号强度低。
[0126]
在一实施例中，本发明可以用作内标对maldi-isd的谱图进行校正，碎片离子峰均匀分布且信号强度高，背景信号极少，用作内标可大幅降低分析物质量测定的误差，而目前还没有可以用作maldi-isd内标的产品。
[0127]
在一实施例中，本发明的多肽可以在较高质量范围(》3000da)对maldi-tof/tof进行校正，产生的碎片离子峰强度很高，背景干扰极少，质量分布均匀，性质稳定，而仪器公司提供的多肽标准品在高分子量段产生碎片离子的信号强度低，导致校正困难。
[0128]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。