检测厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中有机杂质的方法与流程

1.本发明属于生化检测技术领域。更具体地，涉及一种检测厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中有机杂质的方法。


背景技术：

2.厄贝沙坦为血管紧张素ⅱ(angiotensinⅱ，angⅱ)受体抑制剂，抑制angi转化为angⅱ，能特异性地拮抗血管紧张素转换酶1受体(at1)，对at1的拮抗作用比at2大8500倍，通过选择性地阻断angⅱ与at1受体的结合，抑制血管收缩和醛固酮的释放，产生降压作用。苯磺酸氨氯地平是一种二氢吡啶钙拮抗剂，能够抑制钙离子跨膜进入血管平滑肌和心肌，使冠状动脉和周围血管的平滑肌松弛。临床上常将厄贝沙坦和苯磺酸氨氯地平联合使用或制成复合制剂来治疗高血压等疾病(高芳,gaofang.厄贝沙坦联合氨氯地平治疗老年高血压伴2型糖尿病的疗效[j].实用药物与临床,2012,15(10):628-629.)。
[0003]
在实际生产的质量监控中，厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂的生产过程中存在一定的有机杂质，会影响最终产物的纯度和药效，存在一定的安全隐患。目前，对于厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂的质量监控，对于厄贝沙坦来源或苯磺酸氨氯地平来源的杂质，只能分别采用不同的方法进行针对性的检测，需要花费较多的时间和精力，极大地限制了厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂的质量监控。因此，迫切需要提供一种可以同时检测厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中各种有机杂质的方法。


技术实现要素：

[0004]
本发明要解决的技术问题是克服现有技术缺少同时检测厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中各种有机杂质方法的缺陷和不足，提供一种分离度好、准确度高、操作简单的同时检测厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中各种有机杂质方法。
[0005]
本发明的目的是提供一种检测厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中有机杂质的方法。
[0006]
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0007]
一种检测厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中有机杂质的方法，采用高效液相色谱法进行检测，所述高效液相色谱以ph为2.5～3.4的0.01～0.02mol/l磷酸盐缓冲液作为流动相a，以80～100％甲醇作为流动相b，在以下梯度洗脱条件下进行检测：
[0008]0→
(5～7)min，流动相a：100
→
100％；(5～7)
→
(20～22)min，流动相a：100
→
60％；(20～22)
→
(30～32)min，流动相a：60
→
60％；(30～32)
→
(30.1～32.1)min，流动相a：60
→
100％；(30.1～32.1)
→
(35～37)min，流动相a：100
→
100％。
[0009]
进一步地，所述磷酸盐为磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾。
[0010]
优选地，所述流动相b为100％甲醇。
[0011]
更进一步地，所述高效液相色谱法中，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶填充，检测波长为230～240nm，柱温为30～40℃，流速为0.9～1.1ml/min，进样量为10～20μl。优选地，
所述高效液相色谱法中，检测波长为237nm，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，进样量为10μl。
[0012]
更优选地，所述色谱柱为wondasil c18，150mm
×
4.6mm，3.5μm。
[0013]
进一步地，本发明中所述厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中有机杂质有机杂质包括：
[0014]
厄贝沙坦杂质ⅰ：1-戊酰基氨基环戊烷羧酸[2'-(1h-四唑-5-基)-联苯-4-基甲基]-酰胺，cas号：748812-53-5，结构式为：
[0015][0016]
氨氯地平ep杂质a：3-乙基5-甲基(4rs)-4-(2-氯苯基)-2-[[2-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基)乙氧基]甲基]6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸酯，cas号：88150-62-3，结构式为：
[0017][0018]
氨氯地平ep杂质b：3-乙基5-甲基(4rs)-4-(2-氯苯基)-6-甲基-2-[[2-[2-(甲基氨基甲酰基)苯甲酰氨基]乙氧基]甲基]-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸酯，cas号：721958-72-1，结构式为：
[0019][0020]
氨氯地平ep杂质d：3-乙基5-甲基2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-6-甲基吡啶-3,5-二羧酸酯，cas号：113994-41-5，结构式为：
[0021][0022]
氨氯地平ep杂质e：(4rs)-2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸乙酯，cas号：140171-65-9，结构式为：
[0023][0024]
氨氯地平ep杂质f：(4rs)-2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸甲酯，cas号：140171-66-0，结构式为：
[0025][0026]
氨氯地平ep杂质g：4-(2-氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二甲酸二甲酯，cas号：43067-01-2，结构式为：
[0027][0028]
氨氯地平ep杂质h：2-[[2-[[(4rs)-4-(2-氯苯基)-3-(乙氧基羰基)-5-(甲氧基羰基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-2-基]甲氧基]乙基]氨基甲酰基]苯甲酸，cas号：318465-73-5，结构式为：
[0029][0030]
氨氯地平usp杂质1：5-乙基7-甲基6-(2-氯苯基)-8-甲基-3,4,6,7-四氢-2h-苯并[b][1,4]恶嗪-5,7-二羧酸酯，cas号：n/a，结构式为：
[0031][0032]
更进一步地，所述高效液相色谱法中，对照品的制备采用甲醇为溶剂。
[0033]
进一步地，所述高效液相色谱法中，待测样品的制备方法为：将待测样品用磷酸盐缓冲液分散后，加入甲醇定容，取续滤液进行测定。
[0034]
更进一步地，所述氨氯地平ep杂质a、氨氯地平ep杂质b、氨氯地平ep杂质e、氨氯地
平ep杂质f、氨氯地平ep杂质g、氨氯地平ep杂质h的定量限为(1.3～2.7)ng。
[0035]
进一步地，所述厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中含氨氯地平ep杂质d含量不超过0.5％(校正因子2)，其他单个杂质含量不超过0.2％，总杂质含量不超过1.5％。
[0036]
本发明具有以下有益效果：
[0037]
本发明检测方法，可以在一个色谱条件下同时测定厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中至少9种杂质，各色谱峰与主峰或其他杂质峰的分离度均较好，可以将不同来源的杂质完全分离，定量限也均符合药物的定量分析要求，灵敏度高，且具有较高的回收率、精密度和稳定性，专属性强、重现性好、准确性高，可用于厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂生产过程中对杂质的监控，有利于控制、提高厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂的质量；同时本发明操作简单，检测时间短，非常适用于大规模产业化生产中对药物的质量监控。
附图说明
[0038]
图1为本发明实施例1专属性测定中加标供试品溶液的色谱图。
[0039]
图2为本发明实施例1专属性测定中杂质混合定位溶液所含各成分的最大吸收波长pda扫描图谱。
[0040]
图3为本发明实施例2中加标供试品溶液的检测色谱图。
[0041]
图4为本发明对比例1中加标供试品溶液的检测色谱图。
[0042]
图5为本发明对比例2中加标供试品溶液的检测色谱图。
[0043]
图6为本发明对比例3中加标供试品溶液的检测色谱图。
[0044]
图7为本发明对比例4中加标供试品溶液的检测色谱图。
具体实施方式
[0045]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0046]
其中，磷酸二氢钾为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)、甲醇为色谱纯(spectrum)、厄贝沙坦(中国食品药品检定研究院)、苯磺酸氨氯地平(中国食品药品检定研究院)、厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平片(大日本住友制药株式会社，规格厄贝沙坦100mg/氨氯地平10mg)。
[0047]
厄贝沙坦杂质i为1-戊酰基氨基环戊烷羧酸[2'-(1h-四唑-5-基)-联苯-4-基甲基]-酰胺，来源为中国食品药品检定研究院；
[0048]
氨氯地平ep杂质a为3-乙基5-甲基(4rs)-4-(2-氯苯基)-2-[[2-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基)乙氧基]甲基]6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸酯，来源为pcl；
[0049]
氨氯地平ep杂质b为3-乙基5-甲基(4rs)-4-(2-氯苯基)-6-甲基-2-[[2-[2-(甲基氨基甲酰基)苯甲酰氨基]乙氧基]甲基]-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸酯，来源为pcl；
[0050]
氨氯地平ep杂质d为3-乙基5-甲基2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-6-甲基吡啶-3,5-二羧酸酯，来源为pcl；
[0051]
氨氯地平ep杂质e为(4rs)-2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸乙酯，来源为pcl；
[0052]
氨氯地平ep杂质f为(4rs)-2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸甲酯，来源为pcl；
[0053]
氨氯地平ep杂质g为4-(2-氯苯基)-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二甲酸二甲酯，来源为pcl；
[0054]
氨氯地平ep杂质h为2-[[2-[[(4rs)-4-(2-氯苯基)-3-(乙氧基羰基)-5-(甲氧基羰基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-2-基]甲氧基]乙基]氨基甲酰基]苯甲酸，来源为pcl；
[0055]
氨氯地平usp杂质1为5-乙基7-甲基6-(2-氯苯基)-8-甲基-3,4,6,7-四氢-2h-苯并[b][1,4]恶嗪-5,7-二羧酸酯，来源为pcl。
[0056]
除非特别说明，以下实施例所用其余试剂和材料均为市购。
[0057]
实施例1一种检测厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中有机杂质的方法
[0058]
所述检测厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中有机杂质的方法具体如下：
[0059]
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱wondasil c18(150mm
×
4.6mm，3.5μm)；以0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节ph值至3.0)-甲醇(50：50)为流动相a，甲醇为流动相b，按表1进行线性梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为40℃；检测波长为237nm；进样量为10μl。
[0060]
表1实施例1线性梯度洗脱条件
[0061][0062][0063]
以下对上述色谱条件进行了专属性、溶液稳定性、定量限的验证：
[0064]
1、专属性
[0065]
溶液制备：
[0066]
①
氨氯地平ep杂质a、b、e、f、g、h及usp杂质1定位溶液(约2.5μg/ml)：取各杂质对照品2.5mg，分别置20ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得杂质对照品储备液；精密量取储备液0.5ml，置25ml量瓶，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0067]
②
厄贝沙坦杂质i定位溶液(约15μg/ml)：取厄贝沙坦杂质i对照品约4mg，称定，置20ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为厄贝沙坦杂质i对照品储备液；取厄贝沙坦杂质i对照品储备液100μl，置1.5ml进样小瓶中，加入溶剂1ml，摇匀，即得。
[0068]
③
氨氯地平ep杂质d定位溶液(约15μg/ml)：取氨氯地平ep杂质d对照品约1.5mg，称定，置20ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为厄贝沙坦杂质i对照品储备液；取氨氯地平ep杂质d对照品储备液75μl，置1.5ml进样小瓶中，加入溶剂1ml，摇匀，即得。
[0069]
④
系统适用性溶液：取厄贝沙坦杂质i对照品约3mg，称定，置20ml量瓶中，加甲醇
溶解并稀释至刻度，摇匀，作为厄贝沙坦杂质i对照品储备液；取氨氯地平ep杂质d约5mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为氨氯地平ep杂质d对照品储备液；分别取厄贝沙坦约50mg、苯磺酸氨氯地平约17.5mg，精密称定，置同一50ml量瓶中，精密加入厄贝沙坦杂质i对照品储备液0.5ml、氨氯地平ep杂质d对照品储备液各0.375ml，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0070]
⑤
杂质混合定位溶液：取
④
系统适用性溶液1ml，置1.5ml进样小瓶中，加入
①
所得氨氯地平ep杂质a、b、e、f、g、h及usp杂质1对照品储备液各20μl，摇匀，即得。
[0071]
⑥
供试品储备液：取厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平片5片，精密称定，置100ml量瓶中，加入适量0.02mol/l磷酸盐缓冲溶液(ph 3.0)，超声使分散；加入适量甲醇，剧烈振摇使溶解，用甲醇稀释并定容，滤过，取后续滤液。
[0072]
⑦
溶剂：甲醇-0.02mol/l磷酸盐缓冲溶液(ph3.0)(60:40)。
[0073]
⑧
供试品溶液：取
⑥
供试品储备液5.0ml，置25ml量瓶，加
⑦
溶剂稀释至刻度，摇匀。
[0074]
⑨
加标供试品溶液：取厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平片5片，精密称定，置100ml量瓶中，加入适量0.02mol/l磷酸盐缓冲溶液(ph 3.0)，超声使分散；加入适量甲醇，剧烈振摇使溶解，精密加入
③
所得氨氯地平ep杂质d对照品储备液300μl、
②
所得厄贝沙坦杂质i对照品储备液5ml及
①
所得氨氯地平杂质(氨氯地平ep杂质a、b、e、f、g、h及usp杂质1)对照品储备液各200μl，用甲醇稀释并定容，滤过，取后续滤液。
[0075]
⑩
对照品溶液：取苯磺酸氨氯地平对照品约10.5mg，精密称定，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为苯磺酸氨氯地平对照品储备液；取厄贝沙坦对照品约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为厄贝沙坦对照品储备液；精密量取厄贝沙坦对照品储备液5ml，苯磺酸氨氯地平对照品储备液1ml，置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml，置20ml量瓶，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
[0076]
测定及结果：
[0077]
取空白溶剂(即
⑦
溶剂)、
⑤
杂质混合定位溶液、
②
厄贝沙坦杂质i定位溶液、
③
氨氯地平ep杂质d定位溶液、
⑩
对照品溶液、
⑧
供试品溶液、
⑨
加标供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果参见图1。
[0078]
其中，系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，氨氯地平ep杂质d、氨氯地平、厄贝沙坦及厄贝沙坦杂质i之间的分离度应符合要求，理论板数按厄贝沙坦及氨氯地平计均不低于3000。
[0079]
从图1中可以看出空白溶剂不干扰检测，厄贝沙坦、苯磺酸氨氯地平、各杂质分离良好不干扰检测，专属性符合要求；系统适用性也符合要求。
[0080]
取
⑤
杂质混合定位溶液10μl，注入液相色谱仪，用pda检测器在200nm～400nm扫描，记录色谱图，结果参见图2及表2。
[0081]
表2杂质混合定位溶液定位结果
[0082]
[0083][0084]
从上表可知，厄贝沙坦、氨氯地平及各杂质在237nm波长处有较大吸收，故选择237nm作为检测波长。
[0085]
2、溶液稳定性
[0086]
取专属性中
⑨
加标供试品溶液在室温下放置，于0、8、12、24、36、48h，分别精密量取10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，并计算分析，结果参见表3～4。
[0087]
表3加标供试品溶液稳定性结果-厄贝沙坦
[0088][0089]
表4加标供试品溶液稳定性结果-氨氯地平
[0090][0091]
注：绝对变化量为与0h比较的绝对变化量。
[0092]
由表可见，结果与0h相比，加标供试品溶液中厄贝沙坦、苯磺酸氨氯地平各杂质含量绝对变化率最大分别为0.01％、0.05％，均不大于0.05％，总杂质含量绝对变化量最大分别为0.01％，0.02％，均不大于0.1％，均无新增大于0.05％的杂质，溶液稳定性符合要求。
[0093]
3、定量限
[0094]
分别取专属性
①
中氨氯地平ep杂质a、b、e、f、g、h储备液适量，用甲醇稀释至s/n约为10，作为杂质定量限待测样品进行测定，具体结果参见表5。
[0095]
表5杂质定量限
[0096][0097][0098]
实施例2一种检测厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平复合制剂中有机杂质的方法
[0099]
与实施例1不同之处在于，实施例2的线性梯度洗脱条件参照表6进行，其余参数及
操作参考实施例1，对专属性中的
⑨
加标供试品溶液进行检测，结果参见图3。
[0100]
由图可见，厄贝沙坦、氨氯地平、厄贝沙坦杂质i、氨氯地平ep杂质a、氨氯地平ep杂质b、氨氯地平ep杂质d、氨氯地平ep杂质e、氨氯地平ep杂质f、氨氯地平ep杂质g、氨氯地平ep杂质h、氨氯地平usp杂质1的分离度均大于1.5，分离效果好。
[0101]
对比例1
[0102]
对比例1与实施例1的区别在于，对比例1的流动相改为以0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(用磷酸调ph至3.0)作为流动相a，甲醇作为流动相b，在流动相a：流动相b＝40:60的条件下等度洗脱，其余参数参考实施例1专属性中的
⑨
加标供试品溶液。(对比例1的检测方法参考日本药典第17版中收录的厄贝沙坦苯磺酸氨氯地平含量测定方法)
[0103]
结果参见图4，由图可见，氨氯地平ep杂质h和氨氯地平ep杂质b无法分离，且氨氯地平杂质a未出峰，专属性难以满足要求。
[0104]
将对比例1结果与实施例1进行对比，结果参见表7～8。
[0105]
表7对比例1与实施例1的系统适用性对比
[0106][0107]
由表可见，实施例1和对比例1系统适用性均符合规定(各峰分离度大于1.5，厄贝沙坦、氨氯地平峰理论板数均大于3000)，但实施例1理论板数更高，拖尾因子更小，峰型更好。
[0108]
表8对比例1与实施例1的加标供试品溶液测定结果对比
[0109]
名称实施例1分离度对比例1分离度氨氯地平ep杂质d//氨氯地平ep杂质f5.781.96氨氯地平6.003.76厄贝沙坦杂质i6.524.13氨氯地平ep杂质g1.807.92厄贝沙坦8.172.49氨氯地平ep杂质h5.07/氨氯地平ep杂质b6.87/氨氯地平usp杂质12.82/
氨氯地平ep杂质a6.27未出峰
[0110]
由表可见，在同一个条件下实施例1可以同时检测出更多的杂质，专属性更强，并且分离度更好。
[0111]
为进一步提高分离度，改善峰型，以0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(用磷酸调ph至3.0)作为流动相a，甲醇作为流动相b，在流动相a：流动相b＝60:40的条件下等度洗脱，其余参数不变，对专属性中的
⑨
加标供试品溶液进行检测。结果发现，厄贝沙坦在此流动相下析出，无法检测。
[0112]
对比例2
[0113]
对比例2与实施例1的区别在于，对比例2的线性梯度洗脱条件改为表9所示，其余参数参考实施例1，对专属性中的
⑨
加标供试品溶液进行检测，结果参见图5。
[0114]
表9对比例2线性梯度洗脱条件
[0115][0116][0117]
由图可见，厄贝沙坦杂质i与氨氯地平ep杂质e合并出峰分离不佳，无法对杂质进行准确的检测。
[0118]
对比例3
[0119]
对比例3与实施例1的区别在于，对比例3的流动相a改为0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(用磷酸调ph至2.5)-甲醇(50:50)，其余参数参考实施例1，对实施例1专属性中的
⑨
加标供试品溶液进行检测，结果参见图6和表10。
[0120]
表10对比例3检测结果统计
[0121]
保留时间/minrrt(以氨氯地平计算)归属分离度3.2570.48氨氯地平ep杂质d/4.7590.70氨氯地平ep杂质f5.756.7511.00氨氯地平5.8710.2721.52厄贝沙坦杂质i7.2912.2831.82厄贝沙坦4.04
[0122]
由图及表可见，氨氯地平杂质e、氨氯地平ep杂质g、氨氯地平ep杂质b、氨氯地平ep杂质h、氨氯地平usp杂质1、氨氯地平ep杂质a均未出峰，无法满足检测要求。
[0123]
对比例4
[0124]
对比例4与实施例1的区别在于，对比例3的流动相a改为0.02mol/l磷酸二氢钾溶
液(用磷酸调ph至3.5)-甲醇(50:50)，其余参数参考实施例1，对实施例1专属性中的
⑨
加标供试品溶液进行检测，结果参见图7和表11。
[0125]
表11对比例4检测结果统计
[0126][0127][0128]
由图及表可见，氨氯地平ep杂质e与相邻峰分离度为1.35，小于1.5，分离度不佳。
[0129]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。