一种基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针及其合成、应用方法与流程

1.本发明属于有机合成领域，具体涉及一种基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针及其合成、应用方法。


背景技术：

2.化合物聚集诱导发射的现象在2001年首次被发现。具有聚集诱导发射现象的荧光分子在有机溶剂中显示出弱的荧光特性，在不良溶剂中由于聚集效应产生强的荧光发射。因此大量的具有聚集诱导发射的荧光分子被开发出来用于克服聚集导致的荧光猝灭效应。目前为止，具有聚集诱导发射的荧光分子有用于荧光传感器，光电材料，生物检测等方面的潜力。
3.铜是人体中第三大丰富的必要的重金属元素，它在基本的生理过程中起到至关重要的作用，因此摄入合适量的铜对于我们的健康是非常必要的。美国环境保护机构给出的饮用水中铜离子的最大允许浓度为20微摩尔/升。很多疾病与过量摄入铜有关，如阿尔兹海默症，威尔逊氏病等。因此非常有必要发明检测铜离子浓度的方法。由于荧光分子检测高的选择性，灵敏度，准确性，方便经济而被人们所关注。对于铜离子的荧光检测有很多方法，如若丹明探针，席夫碱探针等。然而这些探针仍有很多缺点，如发射波长短，响应时间长，不稳定，选择性差，检测限高，生物组织相容性差等。这些问题极大地激发了我们开发新的可高灵敏度，响应速度快，高选择性，特异性检测铜离子的近红外荧光探针，以更好的适应在生物体内对铜离子的检测。近红外发射的荧光(650-900nm) 探针因其对生物细胞的光损伤小，组织穿透能力较强，自体荧光干扰较低等优点，在疾病治疗领域具有重要的应用前景。自2000年以来，近红外荧光探针根据有机染料母体的不同分为几大类别，包括花菁，罗丹明类似物，bodipy，方酸和其他类型。以花菁素为母体的荧光探针因为具有摩尔消光系数大、吸收波长范围宽的特点，已经成为最重要的一类近红外荧光母体。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术缺陷，提供一种基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针。该探针具有良好的选择性，较高的灵敏度，可用于待测溶液中铜离子浓度的准确测定。具有很大的生物应用前景。
5.本发明还提供了上述基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针的合成方法及其应用方法。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种利用配位反应测定铜离子浓度的近红外荧光探针，该探针的分子式为 c
48h51
n4o4i，结构如下：
[0008][0009]
上述测铜离子浓度的近红外荧光探针的制备方法，其包括以下步骤：
[0010]
1)苯肼和3-甲基-2-丁酮反应得化合物2；
[0011]
2)化合物2和碘乙烷反应得化合物3；
[0012]
3)环己酮，三氯氧磷和dmf反应得化合物5；
[0013]
4)化合物5和化合物3反应得化合物6；
[0014]
5)水杨酸甲酯和水合肼反应得化合物8；
[0015]
6)化合物8和化合物9反应得化合物10；
[0016]
7)化合物6和化合物10反应得目标产物测定铜离子的近红外荧光探针。
[0017]
其中化合物2，化合物3，化合物5，化合物6，化合物8，化合物9，化合物10如下所示：
[0018][0019]
进一步的，步骤一)具体为：ar气保护，苯肼和3-甲基-2-丁酮和冰醋酸混合，室温搅拌30min，回流12小时，萃取，碳酸氢钠水溶液洗，旋干得酒红色液体即为化合物2。苯肼和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为9:10。
[0020]
步骤二)具体为：ar气保护，化合物2和碘乙烷加入乙腈中，升温回流反应24小时，加无水乙醚，过滤得粗品，用乙醚和石油醚洗涤得黄色组分3。化合物2和碘乙烷质量比为1:
3。
[0021]
步骤三)具体为：ar气保护，零摄氏度下加入dmf和无水dcm，搅拌十分钟后，向反应液中逐滴滴加pocl3和无水dcm的混合溶液。滴加完成后再滴加环己酮，然后升温至57℃回流反应3小时。反应结束后搅拌下将溶液趁热倒入冰中，冷冻过夜，旋干 dcm，过滤得黄色固体。用乙醚洗涤，晾干即为化合物5。三氯氧磷和环己酮的摩尔比为4:1。
[0022]
步骤四)具体为：ar气保护，在烧瓶中加入化合物5，化合物3，乙酸钠和乙酸酐，升温至130℃，反应1小时，加石油醚析出固体得有金属光泽的深绿色固体即为化合物6。化合物5与化合物3的摩尔比为3.6:1。
[0023]
步骤五)具体为：水杨酸甲酯和水合肼加入乙醇中90℃回流5小时，冷却至室温，过滤得得白色晶体即为化合物8。水杨酸甲酯和水合肼的摩尔比为：1:1。
[0024]
步骤六)具体为：化合物9溶解在乙醇中，化合物8溶解于乙醇逐滴滴加1小时，混合物回流4小时，减压除去溶剂得化合物10。化合物9与化合物8的摩尔比为：1:1。
[0025]
步骤七)具体为：nah和席夫碱混合于无水thf中，混合物室温搅拌反应15min， cy-cl加入，反应维持室温36小时。反应结束后石油醚，沉淀过滤得到。过硅胶柱，得终产物11。nah，席夫碱和cy-cl的摩尔比为1:1:1。
[0026]
本发明还提供了上述基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针的应用方法。具体的，该探针用于生物和环境体系中铜离子含量而进行荧光检测。检测时，激发波长是450nm 和750nm。响应波长是500-700nm，800-900nm。具有双激发，双响应的荧光探针。
[0027]
本发明相对于现有技术相比具有显著优点：1、本发明合成一种以花菁为骨架具有 aie效应及fret效应具有特异性识别铜离子功能的近红外探针。通过与铜离子进行配位，改变荧光特性，产生on-off效应。使得荧光强度减弱，实现检测荧光强度既可测定铜离子的浓度测定。近红外发射的荧光探针具有对生物细胞的光损伤小，组织穿透能力较强，自体荧光干扰较低等优点，故我们合成了近红外荧光探针，并通1h nmr,
13
cnmr和质谱表征分析。探针可以在thf:h2o＝6:4溶液中对铜离子快速的响应，与铜离子进行1:1的配位反应。这个探针表现出对铜离子快速，定量，专一性好，高灵敏度的响应。
附图说明
[0028]
图1为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针的合成路线图。
[0029]
图2为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针核磁氢谱。
[0030]
图3为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针核磁碳谱。
[0031]
图4为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针质谱。
[0032]
图5为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针450nm激发对不同离子响应的荧光发射光谱。
[0033]
图6为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针750nm激发对不同离子响应的荧光发射光谱图。
[0034]
图7为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针在450nm处激发，不同离子在592nm处对铜离子检测的干扰比较。
[0035]
图8为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针450nm处激发，铜离子浓度的滴定曲线。
[0036]
图9为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针750nm处激发，铜离子浓度的滴定曲线。
[0037]
图10为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针lod值测量曲线。
[0038]
图11为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针测铜离子的标准曲线。
[0039]
图12，13为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针ph对其影响曲线。
[0040]
图14为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针job’s plot(em：825nm)。
[0041]
图15为本发明基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针job’s plot(em：593nm)
具体实施方式
[0042]
以下通过优选实施方案对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0043]
本发明中所使用的原料均为普通市售产品，或者通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中开发的方法获得。
[0044]
一种基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针，分子式为c
48h51
n4o4i，结构如下：
[0045][0046]
上述基于花菁骨架检测铜离子的新型近红外探针的制备方法，其合成路线见图1，具体包括以下步骤：
[0047]
1)化合物2的制备：
[0048]
ar气保护，7.3g苯肼和6.4g 3-甲基-2-丁酮和60ml冰醋酸混合，室温搅拌30min，升温至145℃回流12小时，冷却到室温，旋蒸除溶剂，用dcm萃取，用碳酸氢钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥，旋干得产物9.52g(产率90％)。化合物2图谱信息如下：
[0049]1h nmr(400mhz,cdcl3):δ7.55(d,j＝8.0hz,1h),7.26～7.29(m,2h),7.20(dd,j 1 ＝4.0hz,j 2＝8.0hz,1h),2.28(s,3h),1.29(s,6h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3):δ15.18, 23.01,53.54,119.79,121.26,125.16,127.57,145.52,153.32,188.11；
[0050]
合成路线如下：
[0051][0052]
2)化合物3的制备：
[0053]
ar气保护，向250ml三口烧瓶中加入2(11g)和碘乙烷(33.9g)和85ml乙腈，升温至 85℃回流24小时，加无水乙醚，过滤得粗品，用乙醚和石油醚洗涤得纯品化合物3(17g)。化
合物3的图谱信息如下：1h nmr(400mhz,cdcl3):δ10.31(s,1h),8.33(s,1h),7.38 (t,j＝8.0hz,4h),7.17(t,j＝8.0hz,2h),7.13(d,j＝8.0hz,4h).
13
c nmr(100mhz, cdcl3):δ119.31,123.41,129.46,145.43,150.34.lc-ms(esi):calcd.for m/z,c
13h12 n2[m h]

＝197.1；found,197.1。
[0054]
合成路线如下：
[0055][0056]
3)化合物5的制备：
[0057]
ar气保护，零摄氏度下向100ml三口烧瓶中加入10mldmf和10ml无水dcm，搅拌十分钟后，向反应液中逐滴滴加9mlpocl3和7.5ml无水dcm的混合溶液。滴加完成后再滴加2.5g环己酮，然后升温至57℃回流反应3小时。反应结束后搅拌下将溶液趁热倒入100g冰中，冷冻过夜，旋干dcm,过滤得黄色固体。用乙醚洗涤，晾干得0.8g。
[0058][0059]
4)化合物6的制备：
[0060]
ar气保护，在100ml三口烧瓶中加入5(1g,5.79mmol),3(3.65，,1.6mmol),乙酸钠(0.95g,11.6mmol)和乙酸酐(15ml),升温至130℃，反应1小时，加石油醚，过滤得粗品，用石油醚和乙醚洗涤得纯品，自然晾干得有金属光泽的深绿色固体(产率85％)。化合物6的谱图信息如下:
[0061]1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.47(d,j＝14.2hz,2h),7.55(d,j＝6.8hz,2h), 7.46(t,j＝7.4hz,2h),7.41
–
7.24(m,4h),6.32(d,j＝14.1hz,2h),4.25(d,j＝7.1hz,4h), 2.77(s,4h),1.99(s,2h),1.75(s,12h),1.43(t,j＝6.7hz,6h).
13
c nmr(101mhz,cd3od), δ(ppm)11.08,20.74,25.96,26.83,38.95,49.27,100.54,110.65,122.18,125.17,126.50, 128.54,141.35,141.77,144.28,149.77,172.47.esi-ms calcd for c
34h40
cln
2
(m

):511.29. found:511.12.
[0062][0063]
5)化合物8的制备：
[0064]
水杨酸甲酯(7.6g,0.05mmol)和水合肼(6.25g,0.125mol)加入25ml乙醇中90℃回流5小时，冷却至室温，过滤得产物。用乙醇-水重结晶，得白色晶体4.7g。
[0065][0066]
6)化合物10的制备：
[0067]
化合物9(276mg,2mmol)溶解在20ml乙醇中，8(304mg,2mmol)溶解于30ml乙醇逐滴滴加1小时，混合物回流4小时，tlc检测，减压除去溶剂，用乙醇重结晶得纯品 0.45g。化合物10的谱图信息如下：
[0068]1h nmr(400mhz；dmso-d6)δ6.29
–
6.41(2h,m,ar-h),6.92
–
7.04(2h,m,ar-h), 7.29
–
7.49(2h,m,ar-h),7.82
–
7.94(1h,m,ar-h),8.55(1h,s,ch),11.37(1h,s,nh).
[0069][0070]
7)化合物11的制备：
[0071]
(80mg,2mmol)nah和(544mg,2mmol)席夫碱混合于20ml无水thf中，混合物室温搅拌反应15min，cy-cl(1.28g,2mmol)加入，反应维持室温36小时。反应结束后20ml 石油醚逐滴加入，沉淀过滤得到。过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇洗脱得终产物600mg。
[0072]
熔点:142-144℃。1h nmr(500mhz,d6-dmso)δ:(ppm):10.33(s,1h,-oh),9.98(s, 1h,-oh),9.87(s,1h,nh),7.86(s,1h,ar-h),7.60(d,j＝7.58hz,2h,ch,ar-h),7.51(d, j＝7.50hz,2h,ar-h),7.41(m,j＝7.38,6h,ar-h),7.20(d,j＝7.21hz,3h,ar-h),7.14(d, j＝7.13hz,1h,ar-h),7.01(t,j＝7.01hz,1h,ar-h),6.33(d,j＝6.32hz,2h,ch),6.21 (dd,j＝6.21hz,1h,ch),6.16(d,j＝6.16hz,1h,ch),4.23(d,j＝4.23hz,4h,ch2), 2.82(s,4h,ch2),1.55(s,6h,ch3),1.31(m,j＝1.31hz,14h,ch3).
13
c nmr(125mhz, d6-dmso)δ:171.54,169.12,161.22,158.91,154.81,149.52,144.83,142.05,141.94, 140.90,132.14,131.89,129.41,128.98,127.61,125.54,123.68,122.81,119.37,116.43, 111.69,110.94,108.09,102.83,102.15,49.25,27.56,27.34,24.92,20.82,12.69.esi-ms: m/z calcd for c
48h51
n4o
4
(m

):747.39,found[m-i]

＝747.34.
[0073][0074]
荧光检测应用试验
[0075]
下文中为描述简便，将本发明制备所得目标化合物“基于花菁骨架检测铜离子的近红外探针”统一简称为“探针cy-z”。
[0076]
1)检测用储备液的配制：
[0077]
a)在每次测试前，先称取4.37mg的荧光探针cy-z，使用10ml容量瓶和hplc级的 thf将其配置成0.5
×
10-3
mol/l的母液。吸取2ml母液置于100ml容量瓶，使用磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph＝6.86)和hplc级的thf按一定比例将其稀释并且定容，最后得到1.0
×
10-5
mol/l的待测液。
[0078]
b)金属阳离子检测液的配置
[0079]
选取libr
·
h2o，nacl，kcl，mgso4，cu(no3)2·
3h2o，cacl2，bacl2，cuso4·
5h2o， al(no3)3·
9h2o，pb(no3)2，cr2(so4)3，cu(oac)2·
h2o，mncl2·
4h2o，fecl3·
6h2o， bi(no3)2·
5h2o，co(no3)2·
6h2o，cubr2，ni(no3)2·
6h2o，sncl2·
2h2o，fecl2·
4h2o， cucl2，agno3，zn(oac)2·
2h2o,cdcl2·
h2o，hgcl2等这些常见的金属盐类，并且称取一定量，使用去离子水将其配成1.0
×
10-2
mol/l的待用金属阳离子溶液。
[0080]
2)光谱测定操作步骤
[0081]
a.荧光探针cy-z的紫外吸收和荧光发射光谱的测定
[0082]
用移液枪吸取2ml荧光探针cy-z的待测液(1.0
×
10-5
mol/l)置于3ml比色皿中，通过查阅文献先预先设置吸收波长范围(200nm～900nm)。先做空白试验，扣除空白再进行紫外吸收光谱操作，得到我们的最大吸收波长。
[0083]
用移液枪吸取2ml荧光探针cy-z的待测液(1.0
×
10-5
mol/l)置于3ml比色皿中，通过查阅文献先预先设置激发波长得到一个发射光谱并且确定好适合的狭缝大小，再通过得到的发射波长反扫得到一个激发光谱，通过我们得到的激发光谱，选取需要的激发波长进行荧光发射波长的测定。
[0084]
b.荧光探针cy-z在不同金属阳离子下的荧光发射光谱的测定
[0085]
用移液枪吸取2ml荧光探针cy-z的待测液(1.0
×
10-5
mol/l)置于3ml比色皿中，再依次吸取40μl(20倍当量)金属阳离子溶液(1.0
×
10-2
mol/l)(libr
·
h2o，nacl， kcl，mgso4，cacl2，bacl2，al(no3)3·
9h2o，pb(no3)2，cr2(so4)3，cu(oac)2·
h2o， mncl2·
4h2o，fecl3·
6h2o，bi(no3)2·
5h2o，co(no3)2·
6h2o，ni(no3)2·
6h2o，sncl2·
2h2o， fecl2·
4h2o，agno3，zn(oac)2·
2h2o，cdcl2·
h2o，hgcl2)测定加入常见金属阳离子后(加入后先搅拌一分钟，再大约静置15min)的荧光发射光谱，然后根据各金属阳离子光谱的变化找出我们所需
要的响应离子。结果如图5，6所示。从图5中我们可以看出在450nm处激发，测定荧光发射光谱，只有铜离子的加入才会明显的导致592nm处荧光发射峰强度的明显降低。从图6中我们可以看到在750nm处激发，测定荧光发射光谱，同样只有铜离子的加入才会明显造成830nm处荧光发射峰强度的明显降低，并在 785nm处荧光发射峰强度逐渐增大。根据荧光发射光谱所反映的情况，我们得到荧光探针cy-z对于金属阳离子cu
2
有比较好的响应。
[0086]
c.荧光探针cy-z的荧光光谱滴定实验
[0087]
先用移液枪吸取2ml探针溶液(1.0
×
10-5
mol/l)进行空白试验然后依次吸取一定当量cu
2
加入到比色皿中，搅拌一分钟。测试对应当量下紫外吸收光谱和荧光发射光谱，直到曲线不再变化，即停止测试。然后将不同当量下cu
2
曲线进行叠加，得到荧光滴定谱图。结果如图8,9所示。图8是在450nm处激发的，图9在750nm处激发分别获得的荧光滴定曲线。从图中可以看出随着铜离子浓度的增大，在图8中592nm处的荧光发射强度逐渐减弱，图9中830nm处的荧光发射强度逐渐减弱，785nm处荧光强度逐渐增强。在795nm处产生一个等消光点。具有很好的测量精确度。
[0088]
d.荧光探针cy-z的金属阳离子竞争实验
[0089]
用移液枪吸取2ml荧光探针cy-z待测液(1.0
×
10-5
mol/l)置于3ml比色皿中，然后再依次吸取40μl(20倍当量)金属阳离子溶液(1.0
×
10-2
mol/l)(libr
·
h2o，nacl， kcl，mgso4，cacl2，bacl2，al(no3)3·
9h2o，pb(no3)2，cr2(so4)3，cu(oac)2·
h2o， mncl2·
4h2o，fecl3·
6h2o，bi(no3)2·
5h2o，co(no3)2·
6h2o，ni(no3)2·
6h2o，sncl2·
2h2o， fecl2·
4h2o，agno3，zn(oac)2·
2h2o，cdcl2·
h2o，hgcl2)加入比色皿中，用移液枪搅拌一分钟，静置15min，之后测定荧光发射光谱。
[0090]
用移液枪再吸取40μl(20倍当量)金属阳离子cu
2
溶液(1.0
×
10-2
mol/l)加入比色皿中搅拌一分钟，静置15min，之后测定荧光发射光谱。
[0091]
比较两者之间的荧光谱图的变化，来判断其它金属阳离子是否对于cu
2
的检测有干扰作用。测量结果如图7所示，可以看出各种离子对铜离子测试的干扰几乎可以忽略不计，说明本发明的荧光探针分子具有良好的特异识别性能，并且受到其他离子的干扰较小。
[0092]
e.荧光探针cy-z的ph影响实验
[0093]
配制不同ph的缓冲溶液，再以一定比例与thf混合之后，精确测定其ph值，得不同ph值的探针分子待测溶液(1.0
×
10-5
mol/l)。先测得不同ph探针溶液的荧光强度，用移液枪再加入40μl(20倍当量)cu
2
搅拌一分钟，测得荧光强度，对比谱图判断不同ph下探针溶液对于cu
2
检测的影响。测试结果如图12,13所示。在450nm和750nm 处激发，荧光强度在ph＝6-8范围内的变化很小，说明该探针具有应用于生物细胞中对铜离子浓度进行测定的潜力。
[0094]
f.荧光探针cy-z的检测极限实验
[0095]
将配好的待测液cy-z(1.0
×
10-5
mol/l)用移液枪吸取2ml，测试空白发射光谱(激发波长450nm，狭缝2nm)，总共测试13次，得到荧光强度数据，然后计算这些数据的方差。在比色皿中滴加不同当量的cu
2
(0,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70,0.80,0.90, 1.00)，测试对应cu
2
当量的发射光谱图。根据下式进行计算荧光探针cy-z对于cu
2
的检测极限：
[0096]
lod(limit of detection)＝3σbi/m
[0097]
m表示响应离子浓度和荧光强度变化关系图中曲线的斜率，σbi表示空白实验数据
的方差。测试结果如图10，11所示，检测限经过计算为0.77
×
10-5
mol/l。
[0098]
g.job’s plot曲线的测定
[0099]
配制一系列不同浓度铜离子和荧光分子的混合溶液，并保持两者加和浓度为 1.0
×
10-5
mol/l。测试结果如图14，15所示。从图中可以看出，铜离子与探针分子的反应比例为1:1。